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æ„义
DNA 需è¦è¢«åŽ‹ç¼©ä»¥é€‚åº”ç»†èƒžæ ¸ï¼Œå¹¶ä¸”åœ¨ç»†èƒžåˆ†è£‚è¿‡ç¨‹ä¸ï¼Œå½“å½¢æˆè‡´å¯†çš„染色å•ä½“以进行机械分离时,这一过程å–决于蛋白质å¤åˆç‰©å‡èšç´ 。它通过环挤压在 DNA ä¸å½¢æˆå’Œæ‰©å¤§çŽ¯ã€‚我们的工作解决了 ATP 未水解的 DNA 结åˆçŠ¶æ€çš„å‡èšç´ 的原å结构。DNA 被夹在一个隔间内,该隔间已被报é“在染色体 (SMC) å¤åˆç‰©çš„其他结构维护ä¸ï¼ŒåŒ…括 Rad50ã€cohesin å’Œ MukBEF。需è¦æ³¨æ„的是é‡è¦å·®å¼‚,这æ„味ç€æ‰€æœ‰ SMC å¤åˆç‰©è‡³å°‘循环通过一些相似的状æ€ï¼Œå¹¶åœ¨å…¶å¤´éƒ¨æ¨¡å—ä¸ç»åŽ†ç›¸ä¼¼çš„构象å˜åŒ–,åŒæ—¶æ°´è§£ ATP å’Œæ˜“ä½ DNA。
摘è¦
å‡èšç´ 是在有ä¸åˆ†è£‚期间将 DNA 压缩æˆæŸ“色å•ä½“æ‰€éœ€çš„æŸ“è‰²ä½“ç»“æž„ç»´æŒ (SMC) å¤åˆç‰©ã€‚ATPase 驱动的环挤出促进了å‡èšç´ 对 DNA 的纵å‘压缩,这一过程被认为是大多数(如果ä¸æ˜¯å…¨éƒ¨ï¼‰SMC å¤åˆç‰©çš„基本活动。为了获得分åè§è§£ï¼Œæˆ‘们在å¯ç¼“慢水解的 ATP 类似物和线性以åŠçŽ¯çŠ¶ DNA çš„å˜åœ¨ä¸‹èŽ·å¾—了酵æ¯å‡èšç´ 的电å低温显微镜结构。DNA 显示在接åˆçš„异二èšä½“ SMC ATP 酶头和 Ycs4 亚基之间被“夹ä½â€ï¼Œå…¶æ–¹å¼ç±»ä¼¼äºŽå…ˆå‰æŠ¥é“çš„ DNA 结åˆçš„ SMC å¤åˆç‰©ç»“构。Ycg1 是å¦ä¸€ä¸ªéž SMC 亚基,仅与å¤åˆç‰©çµæ´»ç»“åˆï¼ŒåŒæ—¶ä¹Ÿä¸Ž DNA 紧密结åˆï¼Œå¹¶ä¸”通常与头部模å—ä¿æŒä¸€å®šè·ç¦»ã€‚在夹紧状æ€ä¸‹ï¼ŒDNA 被 kleisin Brn1 和两个接åˆçš„ Smc2 å’Œ Smc4 头部结构域包围。Brn1/Smc2/Smc4三方环在所有接å£å¤„都是é—åˆçš„,包括在Smc2的颈部。我们表明,在没有 DNA 的情况下,颈部门在头部接åˆæ—¶æ‰“开,但在 DNA å˜åœ¨æ—¶å®ƒä»ç„¶å…³é—。我们的工作表明,å‡èšç´ 和其他 SMC å¤åˆç‰©åœ¨å…¶ ATP 酶循环期间ç»åŽ†äº†ç±»ä¼¼çš„头部模å—构象。相比之下,å‡èšç´ å¤åˆç‰©ä¸ Ycg1 亚基的行为å¯èƒ½è¡¨æ˜ŽæŒ¤å‡ºå应的实施å˜åœ¨å·®å¼‚ï¼Œæˆ‘ä»¬çš„ç ”ç©¶ç»“æžœå°†è¿›ä¸€æ¥é™åˆ¶ SMC å¤åˆç‰©çš„环挤出机械模型。
Brn1/Smc2/Smc4三方环在所有接å£å¤„都是é—åˆçš„,包括在Smc2的颈部。我们表明,在没有 DNA 的情况下,颈部门在头部接åˆæ—¶æ‰“开,但在 DNA å˜åœ¨æ—¶å®ƒä»ç„¶å…³é—。我们的工作表明,å‡èšç´ 和其他 SMC å¤åˆç‰©åœ¨å…¶ ATP 酶循环期间ç»åŽ†äº†ç±»ä¼¼çš„头部模å—构象。相比之下,å‡èšç´ å¤åˆç‰©ä¸ Ycg1 亚基的行为å¯èƒ½è¡¨æ˜ŽæŒ¤å‡ºå应的实施å˜åœ¨å·®å¼‚ï¼Œæˆ‘ä»¬çš„ç ”ç©¶ç»“æžœå°†è¿›ä¸€æ¥é™åˆ¶ SMC å¤åˆç‰©çš„环挤出机械模型。Brn1/Smc2/Smc4三方环在所有接å£å¤„都是é—åˆçš„,包括在Smc2的颈部。我们表明,在没有 DNA 的情况下,颈部门在头部接åˆæ—¶æ‰“开,但在 DNA å˜åœ¨æ—¶å®ƒä»ç„¶å…³é—。我们的工作表明,å‡èšç´ 和其他 SMC å¤åˆç‰©åœ¨å…¶ ATP 酶循环期间ç»åŽ†äº†ç±»ä¼¼çš„头部模å—构象。
相比之下,å‡èšç´ å¤åˆç‰©ä¸ Ycg1 亚基的行为å¯èƒ½è¡¨æ˜ŽæŒ¤å‡ºå应的实施å˜åœ¨å·®å¼‚ï¼Œæˆ‘ä»¬çš„ç ”ç©¶ç»“æžœå°†è¿›ä¸€æ¥é™åˆ¶ SMC å¤åˆç‰©çš„环挤出机械模型。我们的工作表明,å‡èšç´ 和其他 SMC å¤åˆç‰©åœ¨å…¶ ATP 酶循环期间ç»åŽ†äº†ç±»ä¼¼çš„头部模å—构象。相比之下,å‡èšç´ å¤åˆç‰©ä¸ Ycg1 亚基的行为å¯èƒ½è¡¨æ˜ŽæŒ¤å‡ºå应的实施å˜åœ¨å·®å¼‚ï¼Œæˆ‘ä»¬çš„ç ”ç©¶ç»“æžœå°†è¿›ä¸€æ¥é™åˆ¶ SMC å¤åˆç‰©çš„环挤出机械模型。我们的工作表明,å‡èšç´ 和其他 SMC å¤åˆç‰©åœ¨å…¶ ATP 酶循环期间ç»åŽ†äº†ç±»ä¼¼çš„头部模å—构象。相比之下,å‡èšç´ å¤åˆç‰©ä¸ Ycg1 亚基的行为å¯èƒ½è¡¨æ˜ŽæŒ¤å‡ºå应的实施å˜åœ¨å·®å¼‚ï¼Œæˆ‘ä»¬çš„ç ”ç©¶ç»“æžœå°†è¿›ä¸€æ¥é™åˆ¶ SMC å¤åˆç‰©çš„环挤出机械模型。
æŸ“è‰²ä½“ç»“æž„ç»´æŒ (SMC) å¤åˆç‰©æ˜¯ç”Ÿå‘½å„个领域ä¸æŸ“色体动力å¦çš„é©±åŠ¨å› ç´ ã€‚åœ¨çœŸæ ¸ç”Ÿç‰©ä¸ï¼Œå‡èšç´ 在有ä¸åˆ†è£‚过程ä¸å°† DNA 组织æˆæ£’状染色å•ä½“,é»è¿žè›‹ç™½ä»‹å¯¼å§å¦¹æŸ“色å•ä½“çš„å‡èšå’Œé—´æœŸæŸ“色体组织,而 Smc5/6 å‚与 DNA ä¿®å¤ã€‚在细èŒä¸ï¼ŒSMC-ScpAB å’Œ MukBEF 通过个体化å¤åˆ¶çš„染色体æ¥ä¿ƒè¿›æŸ“色体分离。
尽管有这些ä¸åŒçš„功能,SMC å¤åˆä½“共享一个共åŒçš„架构,这使得它们很å¯èƒ½ä¹Ÿé€šè¿‡å…±åŒçš„机制å‘æŒ¥ä½œç”¨ã€‚å·²æ˜¾ç¤ºå‡ ç§ SMC å¤åˆç‰©é€šè¿‡ç§°ä¸ºçŽ¯æŒ¤å‡ºçš„过程扩大 DNA 环,该过程由其 ATP 结åˆç›’ (ABC) åž‹ ATP é…¶æ供动力。虽然酵æ¯å‡èšç´ 和人类é»é™„ç´ çš„çŽ¯æŒ¤å‡ºå·²åœ¨ä½“å¤–é‡å»º ( 3-5 ),但它们如何将 ATP 结åˆå’Œæ°´è§£äº§ç”Ÿçš„能é‡è½¬åŒ–为沿 DNA çš„è¿åŠ¨å°šä¸æ¸…楚。
æ ¸å¿ƒ SMC å¤åˆç‰©æ˜¯ç”±ä¸¤ä¸ª SMC 蛋白和一个 kleisin 组æˆçš„异三èšä½“环,在 condensin ä¸ï¼Œå®ƒä»¬åˆ†åˆ«æ˜¯ Smc2ã€Smc4 å’Œ Brn1(图1A)。SMC 蛋白在完全伸展时高度伸长,一个顶点有一个çƒçŠ¶â€œé“°é“¾â€ç»“构域,å¦ä¸€ä¸ªé¡¶ç‚¹æœ‰ä¸€ä¸ª ABC åž‹ ATPase“头â€ç»“构域,由 50 nm å平行å·æ›²èžºæ—‹ç»“æž„åŸŸéš”å¼€ã€‚ä¸¤ç§ SMC 蛋白 Smc2 å’Œ Smc4 通过铰链结构域稳定地结åˆåœ¨ä¸€èµ·ï¼Œå½¢æˆå¼‚二èšä½“。Brn1 N 端结构域与 Smc2 的头部近端盘绕线圈ã€â€œé¢ˆéƒ¨â€ç»“åˆï¼ŒC 端结构域在称为“帽â€çš„ä½ç½®ä¸Ž Smc4 头部结åˆï¼Œä»Žè€Œå½¢æˆä¸€ä¸ªå°é—çš„ä¸‰æ–¹çŽ¯ã€‚ä¸ºäº†å®Œæˆ condensin,与 Kleisins (HAWKs) 相关的两ç§å«æœ‰ HEAT é‡å¤çš„蛋白质 Ycs4 å’Œ Ycg1 稳定地结åˆåˆ° Brn1 çš„ä¸å¿ƒåŒºåŸŸã€‚
图。1。
(一)酵æ¯å‡èšç´ SMCå¤åˆç‰©çš„ç»“æž„ã€‚æ·»åŠ DNA å’Œ ATP 类似物会导致钳ä½çŠ¶æ€çš„å½¢æˆï¼Œè¿™æ˜¯æœ¬ç ”ç©¶çš„ä¸»é¢˜ã€‚è™šçº¿çŸ©å½¢æ ‡è®°äº†å¤´éƒ¨æ¨¡å—处于夹紧状æ€çš„部分,其ä¸å†·å†»ç”µé•œç»“构已得到解决。(乙)å‡èšç´ å››èšä½“冷冻电镜图åƒçš„二维类平å‡å€¼ï¼ŒåŒ…å«äºšåŸº Smc2ã€Smc4ã€kleisin Brn1 å’Œ Ycs4。dsDNA 清晰å¯è§ï¼Œè€Œ Smc2 å’Œ Smc4 的盘绕线圈臂和铰链域相对于解æžè‰¯å¥½çš„头部模å—具有高度的çµæ´»æ€§ã€‚(C)与 DNA 结åˆçš„夹紧å‡èšç´ 头模å—çš„ 2.95-Ã… 分辨率冷冻电镜图(I 型)。( D) 原å模型的å¡é€šè¡¨ç¤ºï¼Œå†…ç½®å¹¶æ ¹æ®Cä¸æ˜¾ç¤ºçš„地图进行了改进。kleisin Brn1 çš„å„ä¸ªéƒ¨åˆ†æ˜¯æ— åºçš„。
å…ˆå‰çš„å‡èšç´ 电å低温显微镜 (cryo-EM) 结构表明å‡èšç´ 在至少两ç§çŠ¶æ€ä¹‹é—´åˆ‡æ¢ ( 7 )。在没有 ATP 的情况下,Ycs4 与 Smc2 å’Œ Smc4 的头部结构域结åˆï¼Œè€Œç›¸æ¯”之下,Ycg1 是å¯ç§»åŠ¨çš„,å¯èƒ½é€šè¿‡ Brn1 内的柔性区域连接到å¤åˆä½“。在与 ATP 结åˆçš„结构ä¸ï¼ŒYcs4 未绑定并且å¯ä»¥ç§»åŠ¨ï¼Œè€Œ Ycg1 则绑定到头部。值得注æ„的是,Smc2 å’Œ Brn1 之间的颈部界é¢ï¼Œå…¶ä¸ Brn1 çš„ N 末端部分与 ATPase 头部附近的 Smc2 çš„å·æ›²èžºæ—‹é¢ˆéƒ¨ç»“åˆï¼Œåœ¨æ²¡æœ‰ ATP 的情况下关é—,但在 ATP 结åˆç»“æž„ä¸æ²¡æœ‰è§£å†³ã€‚生化实验表明,Smc2 å’Œ Brn1 之间颈部界é¢çš„开放是由 ATP 结åˆé©±åŠ¨çš„。æ®æŠ¥é“,cohesin 有类似的行为,它与 DNA 的解离需è¦æ‰“å¼€ Smc3-kleisin (Scc1) 颈部界é¢ï¼Œè¿™å–决于一ç§ç§°ä¸º Wapl çš„è¾…åŠ©è›‹ç™½ä»¥åŠ ATP 结åˆã€‚
cohesin ã€SMC-ScpABå’Œ MukBEF的体内åŠèƒ±æ°¨é…¸äº¤è”分æžå·²è¢«ç”¨äºŽæ示 SMC å¤åˆç‰©ä¸å¯ä»¥æˆªç•™çŽ¯çŠ¶ DNA 的拓扑隔室(SI 附录,图S1A )。其ä¸åŒ…括 SMC-Kleisin (SK) 隔室,以åŠå½“头部域接åˆæ—¶ï¼ŒæŽ¥åˆå¤´éƒ¨ - Kleisin (EK) 和接åˆå¤´éƒ¨ - SMC (ES) 隔室。å§å¦¹æŸ“色å•ä½“çš„å‡èšåŠ›æ˜¯ç”±å‡èšç´ çš„ SK 隔间内å§å¦¹æŸ“色å•ä½“çš„å…±åŒæ•èŽ·ä»‹å¯¼çš„。相å,目å‰å°šä¸æ¸…楚 DNA 在环挤出过程ä¸ä½äºŽå“ªä¸ªéš”室ä¸ï¼Œæˆ–者是å¦åœ¨ä»»ä½•éš”室ä¸ã€‚
处于 ATP 结åˆæŽ¥åˆ (E) 状æ€å¹¶ä¸Žä¸€æ¡ DNA 结åˆçš„内èšè›‹ç™½çš„冷冻电镜结构表明,DNA 被 Scc2 å’Œ Smc3 çš„é—åˆé¢ˆéƒ¨â€œå¤¹â€åœ¨äºŒèšåŒ– SMC ATP 酶结构域的顶部。使用体外åŠèƒ±æ°¨é…¸äº¤è”对相åŒçš„é»è¿žè›‹ç™½-DNA 相互作用的分æžè¡¨æ˜Žï¼ŒDNA 没有被困在 SK 环内,而是穿过 ES å’Œ EK 区室。这有力地表明,在粘连蛋白的钳ä½çŠ¶æ€ä¸‹ï¼Œkleisin 在 DNA 顶部è¿è¡Œï¼Œå¹¶ä¸” DNA 没有通过三èšä½“ç•Œé¢ä¹‹ä¸€åˆ°è¾¾ SK。æ¤å¤–,最近在 ATP å’Œ DNA 结åˆçŠ¶æ€ä¸‹çš„ MukBEF 结构最终表明,由于整个 kleisin MukF è¢«åˆ†è§£ï¼Œå› æ¤è¢«å¤¹ä½çš„ DNA 通过 EK å’Œ ES 区室。有趣的是,在这ç§ç»“æž„ä¸ï¼ŒÎ½-SMC-kleisin 颈界é¢å¹¶ä¸æ˜¯å®Œå…¨å°é—的;然而,MatP DNA å¸è½½è›‹ç™½ä¹Ÿè¢«ç»“åˆã€‚
æˆ‘ä»¬æ—¨åœ¨ç ”ç©¶å‡èšç´ 如何在 ATP 接åˆçŠ¶æ€ä¸‹ä¸Ž DNA ç›¸äº’ä½œç”¨ï¼Œä»¥åŠ DNA 相互作用如何调节颈部界é¢çš„状æ€ã€‚为了解决这个问题,我们首先使用冷冻电镜解决 DNAã€ADP å’Œ BeF 3å˜åœ¨ä¸‹å‡èšç´ 的结构。
结果“钳ä½â€å‡èšç´ å¤åˆç‰©çš„冷冻电镜结构。
为了æ示å‡èšç´ -DNA å¤åˆç‰©çš„ç»“æž„ï¼Œæˆ‘ä»¬çº¯åŒ–äº†ç¼ºä¹ Ycg1 亚基的“四èšä½“â€å‡ºèŠ½é…µæ¯å‡èšç´ å¤åˆç‰©ï¼ˆSI 附录,图 S1 B,包å«äºšåŸº Smc2ã€Scm4ã€Brn1 å’Œ Ycs4)。我们将å‡èšç´ å››èšä½“与 80-bp åŒé“¾ DNA (dsDNA)ã€ADP å’Œæ°ŸåŒ–é“ (BeF 3 - ) æ··åˆï¼Œå°†æ ·å“åº”ç”¨äºŽå†·å†»ç”µé•œç½‘æ ¼ï¼Œå¹¶æ”¶é›†å›¾åƒï¼ˆSI 附录,图 S2 A)。与 ADP.BeF 3结åˆçš„ ABC åž‹ ATP 酶通常代表酶-底物å¤åˆç‰© ( 20 )。由于我们数æ®ä¸ SMC 盘绕线圈和铰链部件的明显çµæ´»æ€§ï¼Œæˆ‘ä»¬æ— æ³•å¯¹æ•´ä¸ªå¤åˆä½“进行分æžï¼ˆSI 附录,图 S2 B),而是专注于头部模å—(图 1 Bå’ŒSI 附录,图 S3,左)。在挑选出é‡ç‚¹å…³æ³¨ SMC 头部域的粒å之åŽï¼Œé€šè¿‡äºŒç»´ (2D) 分类选择了 702,764 个显示 SMC 头部ã€Ycs4 å’Œ DNA 密度的良好粒å。通过进一æ¥å¤„ç†ï¼Œæˆ‘们é‡å»ºäº†ä¸¤ä¸ªå†·å†»ç”µé•œå›¾ï¼ˆI åž‹å’Œ II 型),分辨率分别为 2.95 å’Œ 3.05 Å,分别具有 286,294 å’Œ 251,999 个粒å(图 1 Cå’ŒSI 附录,图 S2 Cå’ŒDï¼‰ã€‚è¿™äº›æ˜ å°„ä½¿æˆ‘ä»¬èƒ½å¤Ÿä»Žä¸¤è€…æž„å»ºå’Œæ”¹è¿›å¯é 的原å模型(SI 附录,表 S1)。对它们的构象进行比较表明,两个原å模型之间具有很强的相似性,å‡æ–¹æ ¹å差为 1.2 Å(图 1 Då’ŒSI 附录,图 S2 E)。
在 I åž‹å’Œ II 型两ç§ç»“æž„ä¸ï¼ŒSMC 头部域和近端盘绕线圈 Ycs4 å’Œ Brn1 å½¢æˆç´§å‡‘çš„çƒçŠ¶ç»“构,å³å¤´éƒ¨æ¨¡å—。大多数 SMC 线圈和铰链未解决,很å¯èƒ½æ˜¯ç”±äºŽè§£å†³éƒ¨åˆ†çš„çµæ´»æ€§ï¼ˆå›¾ 1 Bå’ŒSI 附录,图 S2 B)。在这两ç§ç»“æž„ä¸ï¼ŒDNA 都ä¿æŒåœ¨äºŒèš SMC 头部结构域的上表é¢å’Œ Ycs4 ä¸çš„凹槽之间(图1C)。该图使我们能够追踪到 Brn1 kleisin 亚基的很大一部分(279/754,Brn1 ä¸ 37% 的残基),它与 Smc2 的颈部区域结åˆï¼Œé€šè¿‡æ‰©å±•çš„相互作用表é¢å’Œ Smc4 头部的帽与 Ycs4域 (图 1 D)。Smc2 å’Œ kleisin çš„ N 末端结构域之间的颈部界é¢åœ¨æˆ‘们的结构ä¸æ˜¯å°é—的,这å¯èƒ½è¡¨æ˜Ž DNA 结åˆçš„é’³ä½æž„象阻æ¢äº†è¯¥ç•Œé¢çš„ ATP ä¾èµ–æ€§å¼€æ”¾ï¼Œå› ä¸ºä¹‹å‰æ›¾æŠ¥é“过 Smc2/kleisin 颈部在没有 DNA 的情况下,门在 ATP 结åˆæ—¶æ‰“开。I åž‹å’Œ II åž‹çš„ DNA 密度ä¸åŒï¼Œå®ƒä»¬æ²¡æœ‰å¤¹åœ¨ Ycs4 å’Œ SMC 头之间。虽然 I åž‹çš„ DNA 穿过 SMC 头部的整个表é¢ï¼Œä½† II 型在 Ycs4 远端区域显示分辨率较差的 DNA 密度(SI 附录,图 S2 C-E)。由于 I åž‹å’Œ II åž‹å› æ¤ä»…略有ä¸åŒï¼Œæˆ‘们基于 I åž‹æ¥æ述结构,除éžå¦æœ‰è¯´æ˜Žï¼ˆå›¾ 1Cå’ŒD )。
ATPase 头部结构域的结构和与 DNA 的相互作用。
Condensin 包å«ä¸¤ä¸ª ATPase ä½ç‚¹ï¼Œæ¯ä¸ª SMC 头部结构域都具有æ¥è‡ªä¸€ä¸ªå…±äº«æˆ–“夹层â€æ´»æ€§ä½ç‚¹çš„ Walker A å’Œ Walker B 基åºå’Œæ¥è‡ªå¦ä¸€ä¸ªçš„“ABC ç¾å基åºâ€ã€‚在该结构ä¸ï¼Œå¤´éƒ¨åŸŸæ˜¯äºŒèšä½“,两个ADP.BeF 3夹在界é¢ä¸ï¼ˆå›¾2A)。æ¯ä¸ªæ´»æ€§ä½ç‚¹éƒ½åŒ…å«ä¸€ä¸ª ADP.BeF 3ã€ä¸€ä¸ª Mg 2+离åå’Œ Smc2 å’Œ Smc4 ä¸é«˜åº¦ä¿å®ˆçš„残基之间的相互作用网络。SMC 头部结构域的接åˆåœ¨å…¶ä¸Šä¾§â€‹â€‹äº§ç”Ÿäº†ä¸€ä¸ªå‡åŒé‡å¯¹ç§°çš„ DNA 结åˆè¡¨é¢ï¼Œè¯¥è¡¨é¢ç”±ä¸¤ä¸ªç›˜ç»•çš„线圈接壤(图 2 B)。大约 18 bp çš„ DNA 穿过该表é¢ï¼Œä¸Žå¤§é‡å¸¦æ£ç”µè·çš„残基相互作用(SI 附录,图 S4 A)。有趣的是,DNA 并ä¸å®Œå…¨é›†ä¸åœ¨ ATPase 头部的伪二é‡è½´ä¸Šï¼ˆå›¾ 2 Bï¼‰ï¼Œå› æ¤è¿˜ä¸Žèžºæ—‹çº¿åœˆ Smc2 颈部相互作用,而ä¸æ˜¯ä¸Žèžºæ—‹çº¿åœˆ Smc4 相互作用(图 2 B) . Brn1 çš„ N 端结构域与 Smc2 的颈部结åˆï¼Œä¹ŸæŽ¥è¿‘我们结构ä¸çš„ DNA。
图 2。
( A ) Smc2 å’Œ Smc4 的伪二é‡å¯¹ç§° ATP​​ase 头部结构域的顶视图。两个 ADP.BeF 3分å夹在它们之间,导致 SMC 头部域的接åˆã€‚(乙)夹紧的 DNA 与 Smc2/4 çš„ ATPase 头部结构域的大部分带æ£ç”µçš„上表é¢ç»“åˆï¼Œä½†ä¸Žä¼ªåŒè½´ä¸å®Œå…¨å¯¹é½ã€‚DNA 也与 Smc2 å’Œ Brn1 的盘绕线圈颈部接触,但ä¸ä¸Ž Smc4 的颈部接触。(C)在夹头模å—ä¸ï¼ŒYcs4通过æœå‘N端的带æ£ç”µè·çš„凹槽和C端附近的å°è§¦ç‚¹ä¸ŽDNA进行广泛接触。( D ) Ycs4 与头模å—内的其他åå•å…ƒè¿›è¡Œå››æ¬¡æŽ¥è§¦ï¼š(E ) 带有 Smc2 颈部和 Brn1,(F)带有从 Smc2 头域å‘出的环,该环在 Brn1 与 Ycs4 结åˆæ—¶ä¹Ÿä¸Ž Brn1 接触,(G)在 Smc4 的背é¢æœ‰ä¸€ä¸ªå¤§è¡¥ä¸ï¼Œå’Œï¼ˆH)与é è¿‘ Smc4 çš„ N 端的一个éžç»“构化和ä¿å®ˆæ€§å·®çš„部分。
Ycs4 是一个大的钩状蛋白质,由 21 个 HEAT é‡å¤å’Œä¸€ä¸ªç§°ä¸ºâ€œé•¿é¼»â€çš„çªèµ·ç»„æˆï¼ˆSI 附录,图 S4 C)。在我们的冷冻电镜图ä¸ï¼Œæˆ‘们观察到两个清晰的蛋白质密度沿ç€é’©å的内部和尖端延伸(SI 附录,图 S4 C)。第一个密度显然对应于早先在 apo condensin 的低温-EM 结构ä¸å‘现的 Brn1 çš„ä¸€éƒ¨åˆ†ï¼Œä»¥åŠ Ycs4-Brn1 晶体结构(残基 184 到 223)(8),而我们将第二个密度分é…ç»™Brn1 的区域已被生化鉴定但未早先解决(残基 275 至 323)。
DNA 被 Ycs4 夹在二èšåŒ–头部的顶部。在 Ycs4 上,DNA 与蛋白质ä¸é—´é™„近的一系列 HEAT é‡å¤è¾¹ç¼˜å½¢æˆçš„带æ£ç”µè¡¨é¢ç»“åˆï¼Œè¯¥è¡¨é¢åŒ…括残基 K211ã€K292ã€K300ã€K377ã€R416ã€K420 å’Œ R556(图 1)。 2 Cå’ŒSI 附录,图 S4 B)。在 Ycs4 çš„å¦ä¸€ç«¯å’Œ DNA çš„å¦ä¸€ç«¯ï¼ŒYcs4 钩的尖端也通过一个精氨酸残基 (R1122) 与 DNA 的骨架结åˆã€‚
Ycs4 在四个接å£ä¸Šä¸Ž Smc2 å’Œ Smc4 å½¢æˆå¹¿æ³›çš„è”系(图2D)。第一个是 Ycs4 çš„ N 端 HEAT é‡å¤ 3 å’Œ 4ã€Smc2 的颈部和 Brn1 的螺旋 α3 的上端之间的三方相互作用(图2E)。这ç§æŽ’列将 Brn1 çš„ α3 æ•èŽ·åœ¨ Ycs4 å’Œ Smc2 之间,å¯èƒ½ä¼šé˜»æ¢ Smc2-Brn1 ç•Œé¢çš„打开,如å‰æ‰€è¿°ï¼Œæ®æŠ¥é“,这ç§ç•Œé¢åœ¨æ²¡æœ‰ DNA 的情况下å‘生在头部接åˆæœŸé—´ã€‚Ycs4 的第二个相互作用ä½ç‚¹æ˜¯ä»Ž Smc2 头部结构域(残基 69 至 73)一侧å‘出的环,该环也与æ¥è‡ª Brn1 çš„ α 螺旋(残基 189 至 196)接触(图 2F)。第三个相互作用很大,ä½äºŽ Ycs4 ä¸æœå‘ C 末端的区域(残基~1010 到 1094)和 Smc4 头部结构域背é¢çš„ β-折å 之间(图2G)。最åŽï¼Œåœ¨ Smc4 çš„ N 末端(127 到 131)附近的一个éžç»“构化和ä¸å®Œå…¨ä¿å®ˆçš„区域形æˆäº†ç¬¬å››ä¸ª Ycs4 ç•Œé¢ï¼Œä½¿ç”¨ Ycs4 é’©å的外部(图 2 Hå’ŒSI 附录,图 S4 F)。
具有多ç§çŠ¶æ€çš„å‡èšç´ 结构(apoã€apo 桥接和 ATP é’³ä½ï¼‰ï¼ˆè›‹ç™½è´¨æ•°æ®åº“ [PDB] ID 代ç 6YVUã€6YVV å’Œæœ¬ç ”ç©¶ï¼‰ä½¿æˆ‘ä»¬èƒ½å¤Ÿåˆ†æžä¼´éšå®ƒä»¬çš„构象å˜åŒ–。Ycs4的结构在apoå’Œclamped结构ä¸ç›¸ä¼¼ï¼Œä½†C端HEATé‡å¤å‘外移动10-Å,这导致钩åç•¥å¾®åŠ å®½ï¼ˆSI附录,图S4 E,左)。在apoå’Œapo-bridged构象ä¸ï¼ŒSmc4å’ŒYcs4之间的关è”是相似的,但是在apo-bridged状æ€ä¸‹SMC头部之间的è·ç¦»å˜å¤§äº†ï¼Œå¹¶ä¸”Smc2与Ycs4çš„N端HEATé‡å¤ç»“åˆï¼ˆSI附录,图S4 E,ä¸ï¼‰ã€‚Ycs4 å’Œ SMC ç£å¤´çš„相对方å‘是相似的。然而,在夹紧状æ€ä¸‹ï¼Œä¸Ž apo å’Œ apo 桥接相比,Ycs4 相对于 SMC ç£å¤´æ—‹è½¬äº† 55°(SI 附录,图 S4 E,å³ï¼‰ã€‚
在钳ä½çŠ¶æ€ä¸‹ï¼ŒYcg1 与 DNA 结åˆï¼Œä½†ä»…æ¾æ•£åœ°é™„ç€åœ¨ Condensin 的头部模å—上。
å‡èšç´ “五èšä½“â€å…¨å¤åˆç‰©ï¼ˆäºšåŸº Smc2ã€Smc4ã€Brn1ã€Ycs4 å’Œ Ycg1)的先å‰ä½Žæ¸© EM 结构表明,在没有 DNA 的情况下,Ycg1 在 ATP 接åˆçŠ¶æ€ä¸‹ä¸Ž Smc2 结åˆã€‚为了确定 Ycg1 是å¦ä¹Ÿä¸Ž DNA 结åˆã€å¤¹ç´§çŠ¶æ€çš„头部模å—相互作用,我们将å‡èšç´ 五èšä½“(SI 附录,图 S1 C)与 80-bp DNAã€ADP å’Œ BeF 3åƒä»¥å‰ä¸€æ ·æ··åˆï¼Œå¹¶é€šè¿‡å†·å†»æ£€æŸ¥ã€‚ EM(SI 附录,图 S5 A)。使用我们的四èšä½“结构æ¥æŒ‡å¯¼åˆ†æžï¼Œæˆ‘们能够在广泛分类åŽè§£å†³ä¸¤ä¸ªç‹¬ç«‹çš„结构(SI 附录,图 S3,å³å›¾å’Œ S5 B)。
首先,我们获得了包å«å‡èšç´ 头模å—的较大åå¤åˆä½“的地图,这与为四èšä½“ç¡®å®šçš„å‡ ä¹Žæ²¡æœ‰åŒºåˆ«ã€‚è¿™å¼ 3.7-Ã… 分辨率图(由于粒åæ•°é‡é™åˆ¶ï¼Œä½œä¸ºå•ä¸ªå›¾å¤„ç†ï¼š45,112 个粒åï¼›SI 附录,图 S3,å³ï¼‰æ¸…楚地表明,Ycg1 与 Smc2 或çƒçŠ¶å¤´éƒ¨æ¨¡å—å†…çš„ä»»ä½•å…¶ä»–äºšåŸºæ²¡æœ‰ä¸¥æ ¼å…³è”å¤åˆä½“(SI 附录,图 S5 Bå’ŒC)。
其次,从åŒä¸€ä¸ªæ•°æ®é›†ä¸ï¼Œæˆ‘们以 3.2-Ã… 的分辨率解æžäº†ä¸Ž DNA 结åˆçš„ Ycg1 的结构(图 3 Aå’ŒB )。在这ç§ç»“æž„ä¸ï¼Œä¸Ž Ycg1 结åˆå¹¶æž„æˆâ€œå®‰å…¨å¸¦â€ï¼ˆæ®‹åŸº 387 至 524)的 Brn1 åŒºåŸŸå¤§éƒ¨åˆ†è¢«è§£å†³ï¼Œé™¤äº†æ— åºçš„连接环(残基 411 至 458)(图 3丙)。DNA 在通过 Ycg1 çš„ DNA 结åˆè¡¨é¢å¹¶ç©¿è¿‡å®‰å…¨å¸¦æ—¶ä¼šæœ‰äº›å¼¯æ›²ã€‚DNA 覆盖了 Ycg1 的大部分带æ£ç”µè¡¨é¢ï¼Œä¸Žä¹‹å‰ä½¿ç”¨ X 射线晶体å¦çš„ç ”ç©¶ç›¸æ¯”ï¼Œæˆ‘ä»¬å¯ä»¥è¯†åˆ«å‡ºæ›´å¤šçš„ Ycg1-DNA ç›¸äº’ä½œç”¨ï¼Œè¯¥ç ”ç©¶ä½¿ç”¨è¾ƒçŸçš„ DNA(SI 附录,图 S5 Då’ŒE)。我们观察到 Ycg1 与 Brn1 结åˆè€Œä¸ä¸Ž condensin 的头部模å—结åˆè¿™ä¸€äº‹å®žå¼ºçƒˆè¡¨æ˜Žï¼Œåœ¨ condensin çš„é’³ä½çŠ¶æ€ä¸‹ï¼ŒYcg1 通过 Brn1 æ供的çµæ´»è¿žæŽ¥å™¨ä¸Ž Ycg1 交互站点的任一侧ä¿æŒè¿žæŽ¥åˆ°å¤åˆä½“的其余部分(图3A )。
图 3。
(一)夹紧状æ€ä¸‹å‡èšç´ 五èšä½“的结构,包å«äºšåŸº Smc2ã€Smc4ã€Brn1ã€Ycs4 å’Œ Ycg1。(乙)å•ç‹¬çš„ Ycg1 分辨率为 3.2-Ã… 的冷冻电镜图,与 DNA 结åˆï¼Œä»Žå‡èšç´ 五èšä½“上收集的数æ®é›†ä¸èŽ·å¾—ï¼Œå¤§æ¦‚æ˜¯å› ä¸º Ycg1 æ²¡æœ‰ä¸¥æ ¼åœ°é™„ç€åœ¨å¤åˆç‰©æˆ–头部模å—上。( C ) 原å模型的å¡é€šè¡¨ç¤ºï¼Œè¯¥æ¨¡åž‹å†…置于Bä¸æ‰€ç¤ºçš„地图ä¸ï¼Œå¹¶æ ¹æ®åœ°å›¾è¿›è¡Œäº†æ”¹è¿›ã€‚Brn1å½¢æˆçš„“安全带â€ï¼ˆ21 ï¼‰å¾—åˆ°äº†å¾ˆå¥½çš„è§£å†³ï¼Œé™¤äº†ä¸€ä¸ªæ— åºçš„循环。( D ) kleisin Brn1 通过酵æ¯å‡èšç´ çš„é’³ä½çŠ¶æ€çš„建议路径。在我们的冷冻电镜图ä¸ï¼Œæœ‰å‡ ä¸ªåŒºåŸŸæ— æ³•è§£æžï¼ˆå›¾ 1 C),但有åºåˆ‡ç‰‡çš„ä½ç½®è¡¨æ˜Ž kleisin ä»ä½äºŽå¤¹ç´§çš„ DNA 上方,导致 EK 陷入。大 Brn1 回路将 Ycg1 连接到头部模å—,这使得 Ycg1 能够驻留在如图 4A 所示的è·ç¦»å¤„。
Brn1 亚基相对于 DNA 的路径。
DNA 通过 SMC å¤åˆç‰©çš„路径很é‡è¦ï¼Œå› 为它决定了环状(或éžå¸¸é•¿çš„)DNA 是å¦åœ¨æ‹“扑上被æ•èŽ·ã€‚在以å‰çš„ cohesin é’³ä½ç»“æž„ä¸ï¼Œå¾ˆå°‘有 kleisin 亚基 Scc1 被解æžï¼Œå¹¶ä¸”使用åŠèƒ±æ°¨é…¸äº¤è”实验推æ–和验è¯äº†è·¯å¾„ 。在目å‰çš„结构ä¸ï¼Œæ›´å¤šçš„ kleisin 链是å¯è§çš„,这有助于确定 DNA 是å¦ç©¿è¿‡ Smc2-Smc4-Brn1 (SK) 的三环并被其包裹(图 3 D)。如上所述,在我们的结构ä¸ï¼ŒBrn1(22 到 106)的 N 端结构域与 Smc2 的颈部结åˆã€‚然åŽï¼ŒBrn1 æ²¿ç€ Ycs4 的凹é¢ï¼ˆBrn1:163 到 223)和蛋白质的 C 末端(Brn1:275 到 323)蜿蜒。下一个解æžçš„ Brn1 残基与 Ycg1 结åˆå¹¶åœ¨ DNA 周围形æˆå®‰å…¨å¸¦ï¼ˆBrn1:459 至 525ï¼‰ï¼Œç„¶åŽ Brn1 çš„ C 末端有翼螺旋结构域与 Smc4 的帽结åˆï¼ˆBrn1:526 至 747ï¼‰ã€‚è™½ç„¶æœ‰å‡ ä¸ªåŒºåŸŸä»æœªè§£å†³ï¼Œä½† Brn1 残基 106 å’Œ 163 çš„ä½ç½®è¡¨æ˜Ž Brn1 链最有å¯èƒ½é€šè¿‡ DNA 上方。这æ„å‘³ç€ DNA 至少穿过 EK 隔室(SI 附录,图 S1 A)。
é’³ä½çŠ¶æ€ä¸‹å‡èšç´ 和环状 DNA 之间的相互作用。
到目å‰ä¸ºæ¢ï¼Œæœ¬ç ”究ä¸ç ”究的å‡èšç´ -DNA å¤åˆç‰©æ˜¯ä½¿ç”¨ 80 bp åŒé“¾çº¿æ€§ DNA 组装而æˆçš„ã€‚å› æ¤ï¼Œå¤¹å¤´æ¨¡å—å’Œ Ycg1 å¯èƒ½ä¸Žåˆ†ç¦»çš„ DNA 分å结åˆï¼Œå¹¶ä¸”任何拓扑约æŸéƒ½è¢«ä½¿ç”¨çº¿æ€§ DNA 的事实所覆盖。当所有亚基都有机会与åŒä¸€æ¡ DNA 链结åˆæ—¶ï¼Œä¸ºäº†æ£€æŸ¥å‡èšç´ å…¨å¤åˆç‰©çš„排列,我们混åˆå‡èšç´ 五èšä½“ã€ç¼ºå£ï¼ˆæ¾å¼›ï¼‰è´¨ç²’ DNA (1.7 kb)ã€ADP å’Œ BeF 3并使用带有 Volta 相ä½æ¿ (VPP) çš„å†·å†»ç”µé•œä»¥å¢žåŠ æˆåƒå¯¹æ¯”度(图 4 Aå’ŒSI 附录,图 S6)。在å•ä¸ªå†·å†»ç”µé•œå›¾åƒä¸ï¼Œæ²¡æœ‰å¹³å‡ï¼Œæˆ‘们观察到å‡èšç´ çš„å¤åˆç‰©ï¼Œå…¶ä¸ä¸»ä½“å’Œ Ycg1 最有å¯èƒ½ä¸ŽåŒä¸€è´¨ç²’结åˆã€‚å³ä½¿æ²¡æœ‰å¹³å‡ï¼Œä¹Ÿå¯ä»¥çœ‹åˆ°è´¨ç²’ DNA 以与我们的更高分辨率结构所æ示的相åŒæ–¹å¼ç©¿è¿‡å¤´éƒ¨æ¨¡å—并穿过 Ycg1(分别为图 1 Cå’Œ3 B)。
图 4。
(A,左和ä¸ï¼‰å‡èšç´ 五èšä½“夹紧环状质粒 DNA,如通过带有 VPP 的冷冻电镜观察到的。与 DNA 结åˆçš„ Ycg1 与头部模å—有一段è·ç¦»ï¼Œå¯èƒ½æ˜¯å› 为 Ycg1 通过 Brn1 çµæ´»è¿žæŽ¥ã€‚(一,å³ï¼‰ä¸é—´å›¾åƒçš„示æ„图和å åŠ çš„äºŒç»´ç±»å¹³å‡å€¼ï¼Œçªå‡ºæ˜¾ç¤ºå¤´éƒ¨æ¨¡å—å’Œ Ycg1 之间的 DNA 环已ç»å½¢æˆï¼ˆæ·±ç°è‰²ï¼‰ã€‚打开的 SMC èžºæ—‹çº¿åœˆè‡‚å‡ ä¹Žå¯è§ã€‚( B ) 夹æŒçŽ¯çŠ¶DNAçš„å‡èšç´ 头模å—采用与线性DNA相åŒçš„构象(与图1C比较)。( C) åŒæ ·ï¼ŒYcg1 以类似于线性 DNA çš„æ–¹å¼ä¸ŽçŽ¯çŠ¶ DNA 结åˆï¼ˆä¸Žå›¾ 3 B比较)。(D)头部模å—的夹紧结构与 SMC 臂和铰链域的两æ¡ä¸åŒ DNA 路径兼容,未解决,导致拓扑包埋的ä¸åŒåŠ 载路径。EK + ES éœ€è¦ DNA 穿过未接åˆçš„头部,而 EK + SK 需è¦åœ¨ä¸‰æ–¹ SK 环 Smc2-Smc4-Brn1 ä¸æ‰“开一个门(SI 附录,图 S1 A)。( E ,å·¦) Smc2-Brn1 颈门在å‡èšç´ 的夹紧状æ€ä¸‹å…³é—ã€‚é¢ˆé—¨æ¶‰åŠ Brn1 çš„ N 末端螺旋结构域与 Smc2 çš„å·æ›²èžºæ—‹é¢ˆç»“åˆã€‚Ycs4 çš„ N 端部分和夹ä½çš„ DNA å¯èƒ½åœ¨é‚£é‡Œç¨³å®šå…³é—ç”± Smc2ã€Smc4 å’Œ Brn1 组æˆçš„三方 SK 环的颈门。(E,å³ï¼‰Brn1 N端释放试验。åªè¦é¢ˆé—¨æ²¡æœ‰å…³é—,工程化的 TEV 切割ä½ç‚¹å°±å¯ä»¥ä½¿ N 端 Brn1 结构域从ç å上被切割和洗掉。N-末端片段用è§å…‰æŸ“æ–™ (LD555) æ ‡è®°ä»¥è¿›è¡Œå¯è§†åŒ–。在没有 DNA çš„æƒ…å†µä¸‹ï¼Œæ·»åŠ ATP 或 ADP.BeF 3打开大门,而 DNA çš„åŒæ—¶å˜åœ¨ä½¿å¤§é—¨ä¿æŒå…³é—,大概是通过形æˆå‡èšç´ çš„é’³ä½çŠ¶æ€ï¼Œå¦‚图所示。
然åŽï¼Œæˆ‘们生æˆäº†é’³ä½å‡èšç´ 头模å—å’Œ Ycg1 çš„ 2D 类平å‡å€¼å’Œä¸‰ç»´ (3D) 模型,æ¯ä¸ªæ¨¡åž‹éƒ½ä¸ŽçŽ¯çŠ¶ DNA 结åˆï¼ˆå›¾ 4 Bå’ŒC)。虽然这些结构由于较å°çš„ç²’å数而具有较低的分辨率,但它们显示出相åŒçš„构象,并且 DNA 也被困在 EK 隔室ä¸ã€‚鉴于 DNA 是圆形的,DNA ä¸å¯èƒ½æ»‘å…¥ EK éš”å®¤ï¼Œå› æ¤ DNA 如何进入有两ç§å¯èƒ½æ€§ï¼š1)SMC-kleisin 环ä¸çš„三个界é¢ä¹‹ä¸€æ‰“开,并且 DNA 在拓扑上被困在这个三方环(EK å’Œ SK)ä¸æˆ– 2)DNA åœ¨å®ƒä»¬æŽ¥åˆ ATP(EK å’Œ ES)之å‰åœ¨åˆ†ç¦»çš„头部之间通过。在第二个模型ä¸ï¼ŒDNA åŒæ—¶è¢«å›°åœ¨ ES å’Œ EK 隔室ä¸ï¼Œä½†ä»Žæœªè¿›å…¥ SK 环。需è¦æŒ‡å‡ºçš„是,由于盘绕线圈和铰链域的ä½ç½®åœ¨å¤¹ç´§çŠ¶æ€ä¸‹æ— 法解æžï¼Œå›¾ 4 D ) 以åŠä¸Ž ES(如从内èšç´ 推æ–出的)或与 SK çš„é¢å¤–拓扑相互作用是å¯ä»¥æƒ³è±¡çš„。SK å¡å¤¹å¯ä»¥é€šè¿‡æˆ‘们夹紧结构ä¸ç›˜ç»•çº¿åœˆçš„打开æ¥è¡¨ç¤ºï¼Œä½†å®ƒéœ€è¦é—¨æ‰“开,æ£å¦‚之å‰æ出的。
Smc2–Brn1 颈部接å£åœ¨å¤¹ç´§çŠ¶æ€ä¸‹ä¿æŒå…³é—。
之å‰æœ‰æŠ¥é“称,在没有 DNA 的情况下,ATP 结åˆä¼šå¯¼è‡´ Brn1(N 末端结构域)和 Smc2 颈部界é¢çš„å¼€æ”¾ï¼Œä»¥åŠ N-Scc1 å’Œ Smc3 颈部在 cohesin ä¸çš„ç‰æ•ˆç•Œé¢ 。_ 为了支æŒè¿™ä¸€ç‚¹ï¼Œåœ¨ç»“åˆç´ å’Œå‡èšç´ çš„æ ¸è‹·é…¸ç»“åˆå’Œ SMC 头部接åˆç»“æž„ä¸ï¼Œåœ¨æ²¡æœ‰ DNA 的情况下,kleisin çš„ N 端结构域 (NTD) ä¸å˜åœ¨ï¼Œè€Œåœ¨kleisin çš„ NTD 结åˆçš„æ— æ ¸è‹·é…¸å’ŒéžæŽ¥åˆç»“构。
æ¤å¤–,é‡ç»„ condensin 的生化实验,称为 N 末端 kleisin 释放试验,已被用于è¯æ˜Ž ATP 结åˆæ‰“开了这个界é¢ã€‚烟è‰èš€åˆ»ç—…毒 (TEV) 蛋白酶的识别åºåˆ—被æ’入到 Brn1 çš„éžç»“构化区域(残基 141 之åŽï¼‰ã€‚在用 TEV 蛋白酶切割 Brn1 åŽï¼Œåœ¨æ²¡æœ‰ ATP 的情况下,Brn1 N 末端片段与å¤åˆç‰©çš„其余部分共å…疫沉淀,报告了一个å°é—çš„ç•Œé¢ã€‚然而,当在洗涤æ¥éª¤ä¸åŠ å…¥ ATP 时,N 末端片段没有与å¤åˆç‰©å…±å…疫沉淀,表明 ATP 刺激了界é¢çš„脱离。æ¤å¤–,N-末端片段在å¯ä»¥ç»“åˆä½†ä¸èƒ½æ°´è§£ ATP çš„çªå˜ä½“ä¸é‡Šæ”¾ï¼Œä½†åœ¨ä¸èƒ½ç»“åˆ ATP çš„çªå˜ä½“ä¸è¢«æ¶ˆé™¤ã€‚这表明 ATP 结åˆï¼Œä½†ä¸æ˜¯å…¶éšåŽçš„水解,刺激了 Smc2-Brn1 颈部界é¢çš„打开。
令人惊讶的是,在我们的钳ä½ç»“æž„ä¸ï¼Œå°½ç®¡ ATPase å¤´éƒ¨å’Œæ ¸è‹·é…¸ç»“åˆï¼ŒSmc2-Brn1 ç•Œé¢ä»ç„¶å…³é—(图 4 E,左)。有两ç§å¯èƒ½æ€§å¯ä»¥è§£é‡Šè¿™ä¸€å‘现:1) 与 ATP ä¸åŒï¼ŒADP.BeF 3的结åˆä¸ä¼šåˆºæ¿€é‡Šæ”¾æˆ– 2) DNA 的结åˆå¹¶ä¸”处于钳ä½æž„象会抑制释放。为了检验这些å‡è®¾ï¼Œæˆ‘们使用了相åŒçš„ N 端 Brn1 释放试验(图 4 E,å³ï¼‰ã€‚我们å‘现,如å‰æ‰€è¿°ï¼Œåœ¨æ²¡æœ‰æ ¸è‹·é…¸çš„情况下,Brn1 çš„ N 末端片段被有效地共å…疫沉淀。当在å…疫沉淀洗涤æ¥éª¤ä¸åŠ å…¥ ATP 时,N 末端片段ä¸å†å…±å…疫沉淀,è¯å®ž ATP 刺激了释放。åŒæ ·ï¼Œå½“我们用å«æœ‰ ADP.BeF 3的缓冲液洗涤ç å时,N 末端片段没有有效共沉淀。这表明,与 ADP.BeF 3刺激的 ATP 头部接åˆä¸€æ ·ï¼Œä¼šå¯¼è‡´ Smc2-Brn1 颈部界é¢è„±ç¦»ã€‚相å,当ç å在å«æœ‰ 80-bp dsDNA å’Œ ADP.BeF 3的缓冲液ä¸æ´—涤时,N-末端片段被有效地共沉淀。总之,这些实验表明å‡èšç´ åœ¨æ ¸è‹·é…¸é©±åŠ¨çš„å¤´éƒ¨æŽ¥åˆè¿‡ç¨‹ä¸å¯ä»¥é‡‡ç”¨ä¸¤ç§æž„象:其ä¸ä¸€ä¸ª Smc2-Brn1 ç•Œé¢æ˜¯å¼€æ”¾çš„,如仅与 ATP 或 AMP-PNP ( 7 ) 结åˆçš„å‡èšç´ 的冷冻电镜结构所示,而在æ¤å¤„报告的å¦ä¸€ä¸ªä¸ï¼Œå®ƒè¢«ç‰¢ç‰¢å…³é—(SI 附录,图 S7 Aå’ŒB)。说它采用哪ç§æž„è±¡çš„å”¯ä¸€å†³å®šå› ç´ ä¼¼ä¹Žæ˜¯ DNA çš„å˜åœ¨ä¸Žå¦ä¼¼ä¹Žæ˜¯åˆç†çš„。
讨论最近æ出了一ç§å‡èšç´ 将间期染色体转å˜ä¸ºæœ‰ä¸åˆ†è£‚染色å•ä½“的机制:å‡èšç´ 在水解 ATP çš„åŒæ—¶æŒ¤å‡ºæŸ“色体纤维,以产生跨越整个染色体的 DNA 环阵列。然而,尽管有大é‡çš„实验和模型,但这ç§éžå‡¡çš„è¿åŠ¨æ´»åŠ¨çš„分å基础ä»ç„¶æ˜¯ç¥žç§˜çš„ ( 24 )。在本文ä¸ï¼Œæˆ‘们介ç»äº†ä¸Ž DNA å’Œ ADP.BeF 3å¤åˆçš„ condensin 的结构,一ç§å¯ç¼“慢水解的 ATP 模拟物。这æ示了 ATPase 循环ä¸å‡èšç´ çš„å‡ ä¸ªé‡è¦è¡Œä¸ºã€‚首先,å‡èšç´ 采用“钳ä½â€æž„è±¡ï¼Œå…¶ä¸ DNA 结åˆåœ¨æŽ¥åˆçš„ SMC 头部结构域ã€Ycs4 亚基和 Smc2 颈部结构域之间。其次,DNA 通过 kleisin 和头部结构域之间的 EK éš”å®¤ã€‚ç¬¬ä¸‰ï¼Œå…³é— Smc2 å’Œ Brn1 之间的接å£ã€‚åŽè€…ä»¤äººæƒŠè®¶ï¼Œå› ä¸ºå¤´éƒ¨æŽ¥åˆè¢«è®¤ä¸ºæ‰“开了这个界é¢ï¼ˆ8)。我们还æ供了生物化å¦è¯æ®è¡¨æ˜Žè¿™ç§ ATP 刺激的界é¢å¼€å£å—到 DNA 的抑制。
condensin çš„é’³ä½çŠ¶æ€ä¸Ž cohesin çš„é’³ä½çŠ¶æ€å¯†åˆ‡ç›¸å…³ï¼ˆSI附录,图 S7 Cå’ŒD),çªå‡ºäº†ä¸¤ç§è›‹ç™½è´¨å¤åˆç‰©ä¹‹é—´æ½œåœ¨çš„深层机制相似性。在 cohesin ä¸ï¼ŒScc2 cohesin â€œåŠ è½½å™¨â€äºšåŸºåœ¨é’³ä½ç¼©åˆè›‹ç™½ä¸å æ® Ycs4 çš„ä½ç½®ï¼Œä¸¤ç§å¤åˆç‰©åœ¨é¢ˆé—¨ï¼ˆSmc2-Brn1ï¼›Smc3-Scc1)周围显示出éžå¸¸ç›¸ä¼¼çš„排列,kleisins çš„ N 端域楔入两者之间SMC 颈部ã€DNA å’Œå¤¹ç´§äºšåŸºã€‚å› æ¤ï¼Œé¢ˆé—¨çš„打开似乎å–决于两ç§å¤åˆç‰©ä¸ DNA 的缺失和 ATP çš„å˜åœ¨ï¼Œè¿™å¹¶ä¸å¥‡æ€ª ã€‚å› ä¸º MukBEF çš„é’³ä½çŠ¶æ€ç±»ä¼¼äºŽé»è¿žè›‹ç™½çš„é’³ä½çŠ¶æ€ï¼ˆSI 附录,图 S7 E),它也与å‡èšç´ 有关,åŒæ—¶å‘现 SbcCD (Mre11-Rad50),一ç§ç±»ä¼¼ SMCå‚与 DNA ä¿®å¤çš„蛋白质也以这ç§æ–¹å¼ä¸Ž DNA 结åˆï¼ˆPDB ID 代ç 6S85),似乎 DNA é’³ä½æ˜¯è¿™äº›å¤åˆç‰©çš„一ç§ä¿å®ˆçŠ¶æ€ï¼Œå¹¶ä¸”å¯èƒ½ä¸Žå®ƒä»¬æœ€åŸºæœ¬çš„功能有关。
结åˆå·²å‘表的结构,我们的数æ®è¡¨æ˜Ž condensin å¯ä»¥é‡‡ç”¨è‡³å°‘å››ç§ç¨³å®šçš„æž„è±¡ï¼šæ ¸è‹·é…¸å˜åœ¨ä¸‹çš„两ç§éžå¸¸ä¸åŒçš„构象(ATP æŽ¥åˆ [ SI 附录,图 S7 A,å³] å’Œ DNA é’³ä½),å–决于 DNA çš„å˜åœ¨å’Œä¸¤ç§æ— æ ¸è‹·é…¸çš„ apo 构象(apo å’Œ apo 桥接 [ SI 附录,图 S4 E,左和ä¸])。在 apo 构象ä¸ï¼ŒYcs4 与 SMC 头部结åˆï¼Œå®ƒä»¬çš„ ATP 酶活性ä½ç‚¹å½¼æ¤èƒŒå¯¹å¹¶ç½®ã€‚在 apo-bridged 构象ä¸ï¼Œå¤´éƒ¨è¢«ä½äºŽå®ƒä»¬ä¹‹é—´çš„ Ycs4 强制分开。在这两ç§çŠ¶æ€ä¸‹ï¼ŒYcg1 仅通过çµæ´»çš„ Brn1 链接器绑定到å¤åˆä½“。在没有 DNA çš„ ATP 结åˆç»“构(ATP 接åˆï¼‰ä¸ï¼Œå¤´éƒ¨å·²æŽ¥åˆï¼Œä½†çŽ°åœ¨ Ycs4 ä¸å†ä¸Žä¸»ä½“绑定,而 Ycg1 与 Smc2 头部紧密结åˆï¼Œå¹¶ä¸” Smc2-Brn1 颈部接å£æ‰“开(SI 附录,图 S7 A,å³ï¼‰ã€‚最åŽï¼Œåœ¨ä¸Ž ATP å’Œ DNA 结åˆçš„钳形结构ä¸ï¼Œå¤´éƒ¨ç»“æž„åŸŸå›´ç»•æ ¸è‹·é…¸æŽ¥åˆï¼Œç„¶è€Œ Ycs4 与主体相关而ä¸æ˜¯ Ycg1——并且 Smc2-Brn1 颈部界é¢æ˜¯å°é—çš„ï¼ˆæœ¬ç ”ç©¶ï¼‰ã€‚
å¯ä»¥æƒ³è±¡ï¼ŒADP.BeF 3 + DNA 与 ATP 或 AMP-PNP 结构(Smc2-Brn1 ç•Œé¢å¼€å£å’Œ Ycg1/Ycs4 与 SMC 头结åˆï¼‰ä¹‹é—´çš„ä¸åŒæž„象是用于接åˆçš„ä¸åŒæ ¸è‹·é…¸çš„结果头部结构域而ä¸æ˜¯ DNA çš„å˜åœ¨ã€‚ç”±äºŽä¸‰ä¸ªåŽŸå› ï¼Œè¿™ä¸å¤ªå¯èƒ½ã€‚首先,在之å‰å¯¹ ABC åž‹ ATP é…¶çš„ç»“æž„ç ”ç©¶ä¸ï¼Œä¸Žä¸åŒæ ¸è‹·é…¸ç±»ä¼¼ç‰©æŽ¥åˆçš„å¤´éƒ¨å¯¼è‡´è¿™äº›ç»“æž„åŸŸçš„æž„è±¡å‡ ä¹Žç›¸åŒã€‚其次,在 cohesin çš„ç‰æ•ˆé’³ä½ç»“æž„ä¸ï¼ŒATP 与çªå˜ (EQ Walker B) 结åˆä½¿ç”¨ï¼Œå¯¼è‡´ ATP 水解缺陷但ä¸ç»“åˆ ( 17 )。尽管使用 ATP 而ä¸æ˜¯ ADP.BeF 3,蛋白质采用相åŒçš„é’³ä½æž„象,Smc3-Scc1ç•Œé¢å…³é—。第三,我们的Brn1 释放试验显示ATP 或ADP.BeF 3对颈门开å£çš„å½±å“没有明显差异。
我们的结构æ出了一个有趣的问题,å³ä¹‹å‰æ²¡æœ‰ DNA çš„å‡èšç´ çš„ ATP 结åˆç»“æž„çš„é‡è¦æ€§ã€‚condensin 是å¦é‡‡ç”¨ä¸¤ç§ä¸åŒçš„ ATP 结åˆæž„象作为环挤压过程的一部分?如果ä¸æ˜¯ï¼Œå½“ä¸å¤„于钳ä½çŠ¶æ€æ—¶ï¼ŒATP 结åˆçš„相关性是什么?æ¯ä¸ªç»“æž„ä¸ Smc2-Brn1 颈部界é¢çš„状æ€è¡¨æ˜Žäº†ä¸€ç§å¯èƒ½çš„解释。在钳ä½çŠ¶æ€ä¸‹ï¼Œè¯¥ç•Œé¢å…³é—ï¼Œè€Œåœ¨æ— DNA 结构ä¸ï¼ŒBrn1 N ç«¯ç»“æž„åŸŸæ— æ³•è§£æžï¼Œå¯èƒ½è¡¨æ˜Žå®ƒæ˜¯å¼€æ”¾çš„。我们的生化è¯æ®è¿›ä¸€æ¥æ”¯æŒäº†è¿™ä¸€å‘现,表明 ATP 结åˆä¼šé‡Šæ”¾ Brn1 N 端结构域,除éžå应ä¸åŒ…å« DNAã€‚å› ä¸ºè¿™ä¸ªæŽ¥å£çš„开放会æŸå®³ä¸‰æ–¹å‡èšçŽ¯çš„完整性,ATP 结åˆçŠ¶æ€å¯èƒ½ä»£è¡¨å‡è®¾çš„å¸è½½å应。Condensin 需è¦èƒ½å¤Ÿä»¥ä¸€ç§å—调节的方å¼ä»ŽæŸ“色质ä¸è§£ç¦»ï¼Œè€Œ Smc2-Brn1 ç•Œé¢çš„打开是这ç§é‡Šæ”¾çš„一ç§å¯èƒ½æœºåˆ¶ï¼Œå°¤å…¶æ˜¯å½“ condensin çš„çŽ¯æŒ¤åŽ‹æˆ–å…¶ä»–ç»†èƒžæ´»åŠ¨æ¶‰åŠ DNA 的拓扑或å‡æ‹“扑截留时 。事实上,通过é»é™„ç´ ä¸çš„ Smc3–Scc1 ç•Œé¢å¸è½½ï¼Œå…¶åœ¨ç»†èƒžä¸çš„拓扑æ•èŽ·å·²ç‰¢å›ºç¡®ç«‹ï¼ŒåŒæ ·ç”± ATP 结åˆé©±åŠ¨ã€‚最åŽï¼Œæœ€è¿‘çš„ MukBEF 结构与 MatP å¸è½½å™¨å¤åˆï¼Œè¢«è®¤ä¸ºæ˜¾ç¤ºäº†å‡†å¤‡å¥½è¿›è¡Œ DNA 拓扑å¸è½½çš„å¤åˆç‰©ï¼Œæ˜¾ç¤ºäº†ç±»ä¼¼çš„ N-kleisin 颈门 (MukF-MukB) 处于打开状æ€ï¼ˆSI 附录,图 S7 B )。
也å¯ä»¥æƒ³è±¡ï¼Œé¢ˆéƒ¨ç•Œé¢å¤„的环开å£æ˜¯ DNA è¿åŠ¨æ´»åŠ¨çš„一个组æˆéƒ¨åˆ†ï¼Œå› 为在整个易ä½å‘¨æœŸä¸ DNA å¯èƒ½ä¸ä¼šä¸Žå¤´éƒ¨ç»“构域ä¿æŒç»“åˆã€‚然而,最近的体外å•åˆ†å实验表明,当颈部界é¢æ°¸ä¹…å…³é—时,å‡èšç´ å’Œé»é™„ç´ éƒ½èƒ½å¤ŸåŠ è½½åˆ° DNA 上并挤出环。这与以下å‘现一致,å³ç‰æ•ˆé»è¿žè›‹ç™½æˆ– SMC-ScpAB ç•Œé¢çš„é—åˆåˆ†åˆ«å¯¼è‡´é…µæ¯å’Œæž¯è‰èŠ½å¢æ†èŒä¸çš„功能å¤åˆç‰©ã€‚
我们的冷冻电镜数æ®æ供了明确的è¯æ®ï¼Œè¡¨æ˜Žå‡èšç´ å¯ä»¥åŒæ—¶é€šè¿‡ Ycg1 和夹头模å—与 DNA 结åˆã€‚æ ¹æ®æˆ‘们的结构和已å‘表的å•åˆ†å实验,我们æ出这是环挤出过程ä¸çš„一个ä¸é—´æ¥éª¤ï¼ŒYcg1 相对于头部模å—çš„å¯å˜è·ç¦»å¯èƒ½å†³å®šæˆ–å…许å‡èšç´ 在 DNA 上进行æ¥éª¤éœ€è¦æŒ¤å‡ºå¾ªçŽ¯å¹¶æ‰©å¤§å®ƒä»¬ã€‚似乎还值得指出的是,夹头模å—å’Œ Ycg1 上的两个结åˆä½ç‚¹èƒ½å¤Ÿæ•èŽ·é¢„先形æˆçš„ DNA 环,如图4A所示。,这将是开始循环挤压的一个方便的åˆå§‹å应。在这ç§æƒ…况下,Ycg1 å¯èƒ½å……当 DNA 上的é™æ€é”šï¼Œè¿™æ„味ç€åœ¨çŽ¯æŒ¤åŽ‹è¿‡ç¨‹ä¸ï¼Œè¢«å¤¹ç´§çš„ DNA 被转移,这与 ATP 转æ¢å¯¹ DNA 夹紧的调节一致。
然而,很明显,需è¦å‡†ç¡®äº†è§£çŽ¯æŒ¤åŽ‹å¾ªçŽ¯ä¸çš„构象顺åºï¼Œæ‰èƒ½æè¿° DNA 易ä½å’ŒæŒ¤åŽ‹çš„分å机制。这å¯ä»¥ä½¿ç”¨è¯¸å¦‚è§å…‰å…±æŒ¯èƒ½é‡è½¬ç§» (FRET) ç‰å•åˆ†å方法æ¥å®žçŽ°ï¼Œç‰¹åˆ«æ˜¯å¯¹äºŽå¯èƒ½éžå¸¸çµæ´»çš„ SMC 臂,但我们设想通过冷冻电镜在环挤出过程ä¸è§£å†³ SMC å¤åˆç‰©çš„这些结构最终å¯èƒ½éœ€è¦äº†è§£ä¸Žç»†èƒžéª¨æž¶æˆ–å…¶ä»–æ ¸é…¸è¿åŠ¨è›‹ç™½ç›¸åŒçš„详细程度所涉åŠçš„机制,åªè¦å¤åˆç‰©çš„é‡è¦å’Œç›¸å…³éƒ¨åˆ†ä¿æŒè¶³å¤Ÿçš„刚性以实现或å¯ä»¥å®žçŽ°è‡³å°‘部分å¯è§ã€‚
æ料和方法质粒和蛋白质表达。
野生型å‡èšç´ å…¨å¤åˆç‰©ï¼ˆäº”èšä½“)在æ¥è‡ªä¸¤ä¸ª 2-μm 高拷è´æ•°è´¨ç²’(pGAL7 SMC4-3xStrepII pGAL10-SMC2 pGAL1 BRN1-HA3-His 12 URA3 å’Œ pGAL1 YCG1 pGAL10 YCS4 TRP1)的出芽酵æ¯ä¸è¿‡è¡¨è¾¾ . å«æœ‰ TEV å¯åˆ‡å‰² Brn1 çš„å‡èšç´ å…¨å¤åˆç‰©ä»Ž pGAL7 SMC4-3xStrepII pGAL10-SMC2 pGAL1 BRN1(ybbR æ ‡ç¾æ›¿æ¢æ®‹åŸº 13 至 23ã€æ’入残基 141 çš„ 3 x TEV ä½ç‚¹ï¼‰-HA3-His 12 URA3 å’Œ pGAL1 YCG1 pGAL10 YCS4 TRP1 过度表达。
为了表达å‡èšç´ å››èšä½“,Gibson ç»„è£…åˆ é™¤äº† YCG1 以产生 pGAL1 YCG1 TRP1。培养物在-URA-TRP 脱除培养基+ 2% 棉åç³–ä¸ç”Ÿé•¿ï¼Œç›´åˆ°600 nm (OD 600 ) 处的光密度为0.8 至1。通过å‘培养基ä¸æ·»åŠ 2% åŠä¹³ç³–并在30 °C 下åµè‚²è¿‡å¤œæ¥è¯±å¯¼è›‹ç™½è´¨è¡¨è¾¾ã€‚
蛋白质纯化。
如å‰æ‰€è¿°çº¯åŒ–é‡ç»„å‡èšç´ å¤åˆç‰©ï¼Œç¨ä½œä¿®æ”¹ã€‚将诱导的酵æ¯åŸ¹å…»ç‰©ç¦»å¿ƒï¼Œåœ¨ç£·é…¸ç›ç¼“冲ç›æ°´ä¸æ´—涤一次,然åŽå†æ¬¡ç¦»å¿ƒã€‚用蛋白酶抑制剂 (Roche) å’Œ 300 U/L 苯甲酶将细胞沉淀é‡æ–°æ‚¬æµ®åœ¨ 1× 沉淀体积的缓冲液 A(50 mM Tris·HCl,pH 8.0ã€200 mM NaClã€5% 甘油和 5 mM 2-巯基乙醇)ä¸ï¼ˆè¥¿æ ¼çŽ›ï¼‰ã€‚然åŽå°†ç»†èƒžæ‚¬æµ®æ¶²åœ¨ Spex Freezer Mill ä¸è£‚解(5 个循环,æ¯æ¬¡ 3 分钟,12 cpmï¼Œå¾ªçŽ¯ä¹‹é—´å†·å´ 3 分钟)。通过在 JA 25.50 转åä¸ä»¥ 20,000 rpm 离心 30 分钟澄清裂解物,并通过 Whatman 纸过滤。然åŽé€šè¿‡æ·»åŠ NaOH 将裂解物调节至 pH 8.0。过滤和澄清的裂解物以 1 mL/min çš„æµé€ŸåŠ 载到串è”组装的两个 5 mL His-Trap 柱 (Cytiva) 上。用 100 mL Buffer A + 500 mM NaCl 洗涤柱å,50 mL 缓冲液 A + 40 mM 咪唑,速度为 5 mL/min,50 mL 缓冲液 A + 60 mM 咪唑,速度为 5 mL/min。然åŽåœ¨ç¼“冲液 A + 200 mM 咪唑ä¸æ´—脱蛋白质。峰级分在缓冲液 SB(50 mM Tris·HCl,pH 8,200 mM NaCl,5% 甘油和 1 mM 二硫è‹ç³–醇 [DTT])ä¸æ··åˆå¹¶ç¨€é‡Šä¸¤å€ï¼Œå¹¶åŠ 载到 5-mL Strep-Trap 柱(Cytiva)上以 1 mL/min çš„æµé€Ÿã€‚用 50 mL Buffer SBã€20 mL Buffer SB å’Œ 50 mM KClã€10 mM MgCl2 å’Œ 1 mM ATP (Sigma) 洗涤柱å,然åŽç”¨ 50 mL Buffer SB 洗涤。然åŽåœ¨å«æœ‰ 5 mM åŽ»çš®ç”Ÿç‰©ç´ (IBA) 的缓冲液 SB ä¸æ´—脱蛋白质。用 Vivaspin 20 100,000-Da 离心浓缩器 (Sartorius) 汇集和浓缩峰级分。峰级分在缓冲液 SB(50 mM Tris·HCl,pH 8,200 mM NaCl,5% 甘油和 1 mM 二硫è‹ç³–醇 [DTT])ä¸æ··åˆå¹¶ç¨€é‡Šä¸¤å€ï¼Œå¹¶åŠ 载到 5-mL Strep-Trap 柱(Cytiva)上以 1 mL/min çš„æµé€Ÿã€‚用 50 mL Buffer SBã€20 mL Buffer SB å’Œ 50 mM KClã€10 mM MgCl2 å’Œ 1 mM ATP (Sigma) 洗涤柱å,然åŽç”¨ 50 mL Buffer SB 洗涤。然åŽåœ¨å«æœ‰ 5 mM åŽ»çš®ç”Ÿç‰©ç´ (IBA) 的缓冲液 SB ä¸æ´—脱蛋白质。用 Vivaspin 20 100,000-Da 离心浓缩器 (Sartorius) 汇集和浓缩峰级分。峰级分在缓冲液 SB(50 mM Tris·HCl,pH 8,200 mM NaCl,5% 甘油和 1 mM 二硫è‹ç³–醇 [DTT])ä¸æ··åˆå¹¶ç¨€é‡Šä¸¤å€ï¼Œå¹¶åŠ 载到 5-mL Strep-Trap 柱(Cytiva)上以 1 mL/min çš„æµé€Ÿã€‚用 50 mL Buffer SBã€20 mL Buffer SB å’Œ 50 mM KClã€10 mM MgCl2 å’Œ 1 mM ATP (Sigma) 洗涤柱å,然åŽç”¨ 50 mL Buffer SB 洗涤。然åŽåœ¨å«æœ‰ 5 mM åŽ»çš®ç”Ÿç‰©ç´ (IBA) 的缓冲液 SB ä¸æ´—脱蛋白质。用 Vivaspin 20 100,000-Da 离心浓缩器 (Sartorius) 汇集和浓缩峰级分。和 1 mM ATP (Sigma),然åŽæ˜¯ 50 mL 缓冲液 SB。然åŽåœ¨å«æœ‰ 5 mM åŽ»çš®ç”Ÿç‰©ç´ (IBA) 的缓冲液 SB ä¸æ´—脱蛋白质。用 Vivaspin 20 100,000-Da 离心浓缩器 (Sartorius) 汇集和浓缩峰级分。和 1 mM ATP (Sigma),然åŽæ˜¯ 50 mL 缓冲液 SB。然åŽåœ¨å«æœ‰ 5 mM åŽ»çš®ç”Ÿç‰©ç´ (IBA) 的缓冲液 SB ä¸æ´—脱蛋白质。用 Vivaspin 20 100,000-Da 离心浓缩器 (Sartorius) 汇集和浓缩峰级分。
对于 TEV å¯è£‚解å‡èšç´ çš„è§å…‰æ ‡è®°ï¼Œåœ¨æ¤é˜¶æ®µï¼ŒCoA-LD555(Lumidyne)用é‡ç»„ SFP åˆé…¶ï¼ˆAddgene Plasmid 75015)与 Brn1-ybbR ç¼€åˆï¼Œå¦‚å‰æ‰€è¿°ã€‚所有蛋白质都在 Superose 6 å¢žåŠ 10/300 GL 柱 (Cytiva) 上通过尺寸排阻色谱法进一æ¥çº¯åŒ–,用å«æœ‰ 1 mM MgCl 2的缓冲液 SB 预平衡。使用 Vivaspin 20 100,000-Da 离心浓缩器浓缩峰级分并冷冻。
组装钳ä½å‡èšç´ å’Œå†·å†»ç”µé•œç½‘æ ¼å‡†å¤‡ã€‚
使用 Zeba Micro Spin 7K MWCO 柱(Thermo Fisher Scientific)在 TNT 缓冲液(30 mM Tris/HClã€60 mM NaClã€1 mM TCEP å’Œ 2 mM MgCl 2,pH 7.5)ä¸å¯¹çº¯åŒ–çš„å‡èšç´ æ ·å“进行缓冲液交æ¢ã€‚然åŽï¼Œå°† 0.5 ∼1-mg/mL æ ·å“与 1∼2 µM 80-bp dsDNA(5'-GAATTCGGTGCGCATAATGTATAATAAGATAAATAAGCTTAAGTTCTTCCGATGCATAATAACATAATACGTGACTTTAC-3' å’Œ 5'-GTAAAGTCACGTATTATGTTATTATGCATCGGAAGAACTTAAGCTTATTTATCTTATTATACATTATGCGCACCGAATTC-3'ï¼›DNA1,78900bp æ¾å¼›çŽ¯çŠ¶, æºè‡ª pUC19) ( 17 ) 在 5 mM ADPã€1 mM BeSO 4å˜åœ¨ä¸‹å’Œ 10 mM NaF 在室温下放置 30 分钟。用 0.1% (wt/vol) β-辛基葡糖苷 (Anatrace) è¡¥å……åŸ¹å…»çš„æ ·å“,并将其应用到新鲜å‘光的 200 æ–¹å½¢ç½‘æ ¼ Ultrafoil R2/2 é‡‘ç½‘æ ¼ (Quantifoil) ä¸Šã€‚å°†æ ·å“用 FEI Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) 在 4 °C å’Œ 100% 湿度(å°è¿¹åŠ› --10 至 -15,å°è¿¹æ—¶é—´ 1.5∼2 s)和液体乙烷低温æ’温器设置为93 åƒã€‚
冷冻电镜图åƒé‡‡é›†ã€‚
所有冷冻电镜数æ®é›†éƒ½æ˜¯åœ¨ FEI Titan Krios 电å显微镜(Thermo Fisher Scientific)上以 300 kV 获得的。EPU 用于自动数æ®æ”¶é›†ï¼Œå¯¹äºŽéž VPP æ•°æ®é›†ï¼ŒAFISï¼ˆæ— åƒå·®å›¾åƒç§»ä½ï¼‰ç”¨äºŽæ高åžåé‡ã€‚对于å‡èšç´ å››èšä½“:80-bp DNA æ•°æ®é›†ï¼Œä½¿ç”¨å…·æœ‰ 20-eV ç‹ç¼å®½åº¦å’Œ 100-µm 物镜å”径的 GIF é‡å能é‡è¿‡æ»¤å™¨èŽ·å–图åƒï¼›ä½¿ç”¨ Gatan K3 直接电å探测器以超分辨率模å¼è®°å½•äº† 8,784 éƒ¨ç”µå½±ï¼Œæ ‡ç§°æ”¾å¤§å€çŽ‡ä¸º 81,000 å€ï¼Œå¯¹åº”于æ¯åƒç´ 1.07 Ã… çš„åƒç´ 大å°ï¼ˆè¶…分辨率下æ¯åƒç´ 0.535 Ã…ï¼‰å’Œæ ‡ç§°æ•£ç„¦èŒƒå›´ä¸º 1.5∼ 3.3 微米。æ¯éƒ¨ç”µå½±è¢«å‰‚é‡åˆ†å‰²æˆ 55 帧,总剂é‡ä¸º 55 e - /Ã… 2. 对于五èšä½“:80-bp DNA æ•°æ®é›†ï¼Œä½¿ç”¨ Falcon 4 检测器收集了 4,302 å¼ å›¾åƒï¼Œæ ‡ç§°æ”¾å¤§çŽ‡ä¸º 75,000 å€ï¼ˆæ ¡å‡†åƒç´ å¤§å° 1.08 Å)且没有任何物镜å”å¾„ã€‚æ ‡ç§°æ•£ç„¦èŒƒå›´è®¾ç½®ä¸º 1.5∼3.0 µm。æ¯ä¸ªå›¾åƒéƒ½ä»¥ EER(电åäº‹ä»¶è¡¨ç¤ºï¼‰æ ¼å¼è®°å½•ï¼Œæ€»å‰‚é‡ä¸º 40 e - /Ã… 2. 对于五èšä½“:圆形 DNA æ•°æ®é›†ï¼Œä½¿ç”¨ Falcon 4 探测器通过 VPP(散焦范围:0.6∼1.1)获得 3,179 å¼ å›¾åƒï¼Œæ ‡ç§°æ”¾å¤§å€æ•°ä¸º 75,000 å€ï¼ˆåƒç´ å¤§å° = 1.08 Ã…ï¼‰ã€‚ç”±äºŽæ¤ VPP æ•°æ®é›†ä¸çš„å‡èšç´ ç²’åæ•°é‡ä¸è¶³ä»¥èŽ·å¾—良好的 3D ç±»åˆ«ï¼Œå› æ¤ä½¿ç”¨ 100-μm 物镜å”径(散焦范围:1.5∼3.0μm)获得了é¢å¤–çš„ 1,016 ä¸ªéž VPP 图åƒï¼Œä½¿ç”¨ä¸‹èŽ·å¾—çš„ç½‘æ ¼ç›¸åŒçš„æ¡ä»¶ï¼Œä½†æ ·å“浓度更高。两个数æ®é›†å‡ä»¥ EER æ ¼å¼è®°å½•ï¼Œæ€»å‰‚é‡ä¸º 32 e - /Ã… 2。
冷冻电镜图åƒå¤„ç†ã€‚
冷冻电镜数æ®å¤„ç†å·¥ä½œæµç¨‹æ€»ç»“在SI 附录图 S3ä¸ã€‚除éžå¦æœ‰è¯´æ˜Žï¼Œå¦åˆ™ä½¿ç”¨RELION 3.1ã€CtfFind4ã€crYOLO å’Œ cryoSPARC v3.2进行处ç†ï¼Œå¹¶ä½¿ç”¨ RELIONã€‚æ€»ä½“åˆ†è¾¨çŽ‡æ˜¯æ ¹æ®å‚…里å¶å£³ç›¸å…³é‡‘æ ‡å‡†æ ‡å‡† (0.143) 确定的。所有图åƒéƒ½ç»è¿‡äº† RELION 3.1 ä¸å®žæ–½çš„å…‰æŸè¯±å¯¼è¿åŠ¨æ ¡æ£ã€‚使用 7 × 5 å—(用于 K3 æ•°æ®é›†ï¼‰æˆ– 5 × 5 å—(用于 Falcon 4 æ•°æ®é›†ï¼‰å¯¹é½ç”µå½±å¸§å¹¶ç»“åˆå‰‚é‡åŠ æƒã€‚EER æ ¼å¼çš„ Falcon 4 电影被剂é‡åˆ†æˆ 40 帧的组,对应于 1 e - /Ã…2 或 0.8 e -的剂é‡/Ã… 2æ¯ä¸ªåˆ†æ•°çš„五èšä½“:80-bp DNA 或五èšä½“:环状 DNA æ•°æ®é›†ï¼Œåˆ†åˆ«ã€‚使用 CtfFind4 估计 CTF å‚数。
对于å‡èšç´ å››èšä½“:80-bp DNA æ•°æ®é›†ï¼Œä»¥ Laplacian-of-Gaussian blob 作为模æ¿æŒ‘选了约 3 M ç²’å并进行 2D 分类。使用æ¥è‡ªæ˜¾ç¤ºä¸åŒæ–¹å‘的选定 2D 类图åƒçš„ç²’å生æˆå¤´éƒ¨å¤åˆä½“çš„åˆå§‹ 3D 模型。然åŽï¼Œä¸ºäº†ä½¿ç”¨ crYOLO 准确获得更多粒å,使用æ¥è‡ªå½¢æˆæ‰€é€‰ 2D 类的图åƒçš„åæ ‡è®ç»ƒæ¨¡åž‹ã€‚使用 300 2åƒç´ (åƒç´ å¤§å° = 1.07 Å),然åŽæ˜¯ 2D 分类;对 702,764 个接å—çš„ç²’å进行了进一æ¥çš„ 3D 分类,并产生了两个显示二级结构特å¾çš„ 3D 类别。对æ¯ä¸ªç±»åˆ«åˆ†åˆ«è¿›è¡Œè¿›ä¸€æ¥å¤„ç†ï¼Œä½†æ–¹å¼ç›¸åŒã€‚首先,执行 3D è‡ªåŠ¨ç²¾ä¿®å¹¶ç”Ÿæˆ 3.27 Å(Form I)和 3.24 Å(Form II)的图,然åŽé’ˆå¯¹æ”¾å¤§çŽ‡å„å‘异性ã€æ¯ç²’å散焦ã€æ¯æ˜¾å¾®ç…§ç‰‡æ•£å…‰å’Œå…‰æŸå€¾æ–œè¿›è¡Œ CTF 精修。对于光æŸå€¾æ–œå’Œ CTF 细化,粒åæ ¹æ®å…¶å”ä½ç½®åˆ†ä¸ºå…‰å¦ç»„ï¼ˆå› ä¸º AFIS æ•°æ®æ”¶é›†ï¼‰ã€‚然åŽï¼Œè¿›è¡Œè´å¶æ–¯æŠ›å…‰ï¼Œç„¶åŽè¿›è¡Œå¦ä¸€è½® 3D 细化,以分别生æˆå…·æœ‰ 2.95 å’Œ 3.05 Ã… 分辨率的 I åž‹å’Œ II 型最终地图。
对于å‡èšç´ 五èšä½“:80-bp DNA æ•°æ®é›†ï¼Œæœ€åˆä½¿ç”¨å¸¦æœ‰é€šç”¨æ¨¡åž‹çš„ crYOLO 挑选粒å。在 cryoSPARC v3.2 ä¸æŒ‘选了大约 600,000 个粒å,并对 50,000 个粒å的一个å集进行了五类从头算åˆå§‹æ¨¡åž‹é‡å»ºã€‚使用得到的五个模型,对 cryoSPARC ä¸æ‰€æœ‰æŒ‘选的粒å进行了异质细化。选择显示“夹紧â€å¤´éƒ¨æ¨¡å—或 Ycg1-DNA å¤åˆç‰©ç‰¹å¾çš„类,并对æ¯ä¸ªç±»çš„相应粒å分别进行 crYOLO 模型è®ç»ƒï¼Œç„¶åŽè¿›è¡Œè‡ªåŠ¨ç²’å拾å–。通过对æ¯ä¸ªæ¨¡åž‹è¿›è¡Œ crYOLO 拾å–,分别获得了 476,997 个用于头部模å—çš„ç²’åå’Œ 640,437 个用于 Ycg1-DNA çš„ç²’å。æ¯ä¸ªæ¨¡åž‹çš„ç²’å首先使用æ¥è‡ªç¬¬ä¸€æ¬¡ä»Žå¤´é‡å»ºçš„五个模型通过 cryoSPARC 异质细化æ¥æ¸…ç†ã€‚在 RELION ä¸æ²¡æœ‰å¯¹é½çš„其他 2D å’Œ 3D 分类导致头部模å—有 45,112 个粒å,Ycg1-DNA 有 91,024 个粒å。æ¯ä¸ªç²’å都用 320 çš„ç›’å大å°é‡æ–°æå–2å’Œ 300 2åƒç´ (åƒç´ å¤§å° = 1.08 Å),分别。对æ¯ä¸ªç²’å进行三维自动细化,然åŽè¿›è¡Œ CTF 细化(放大å„å‘异性ã€æ¯ç²’å散焦ã€æ¯æ˜¾å¾®ç…§ç‰‡æ•£å…‰å’Œå…‰æŸå€¾æ–œï¼‰å’Œè´å¶æ–¯æŠ›å…‰ã€‚在 3D 细化åŽï¼Œåˆ†åˆ«èŽ·å¾—了头部å¤åˆç‰©å’Œ Ycg1-DNA 分辨率为 3.68-Ã… å’Œ 3.20-Ã… 的图谱。
对于å‡èšç´ 五èšä½“:环状 DNA,分别使用带有通用模型的 crYOLO 对两个数æ®é›† VPP å’Œéž VPP 进行粒å拾å–,然åŽä»¥ 360 2åƒç´ 的框大å°å’Œ 2× binning(180 2åƒç´ )进行æå–大å°ï¼Œåƒç´ å¤§å° = 2.16 Å)。然åŽå°†æ¥è‡ªä¸¤ä¸ªæ•°æ®é›†çš„ç²’ååˆå¹¶ï¼ŒèŽ·å¾—从头算é‡å»ºï¼Œç„¶åŽåœ¨ cryoSPARC ä¸è¿›è¡Œå¤šè½®å¼‚构细化;选择了分别对应于头部模å—å’Œ Ycg1-DNA çš„ 36,588 å’Œ 27,040 个粒å,并在 cryoSPARC ä¸è¿›è¡Œ 3D å‡åŒ€ç»†åŒ–,分别为头部å¤åˆç‰©å’Œ Ycg1-DNA ç”Ÿæˆ 8.75-å’Œ 8.95-Ã… 图。
在处ç†æ•°æ®é›†çš„过程ä¸ï¼Œæˆ‘们还å‘现了å‡å®šä¸º SMC 线圈臂或铰链的 2D 类(SI 附录,图 S2 Bï¼‰ï¼Œä½†æ˜¯ï¼Œæˆ‘ä»¬æ— æ³•èŽ·å¾—è¿™äº›éƒ¨ä»¶çš„å¯é 3D 地图,å¯èƒ½æ˜¯ç”±äºŽä»–们的çµæ´»æ€§ã€‚
模型构建和细化。
对于原å模型构建,使用 DeepEMhancer进一æ¥æ”¹è¿›äº†æ¥è‡ªå››èšä½“æ•°æ®é›†çš„头模å—å’Œæ¥è‡ªäº”èšä½“æ•°æ®é›†çš„ Ycg1-DNA å¤åˆç‰©çš„两ç§å½¢å¼ I å’Œ II çš„æ˜ å°„ã€‚åœ¨ Cootå’Œ ISOLDEä¸è¿›è¡Œäº†æ¨¡åž‹æž„建。使用 phenix.real_space_refine优化åæ ‡ã€‚ä½¿ç”¨ MolProbity进行模型验è¯ã€‚头部模å—的原å模型首先被构建到æ¥è‡ªå››èšä½“:80-bp DNA æ•°æ®é›†çš„ 2.95-Ã… 低温-EM 密度ä¸ã€‚Smc2 head-Brn1 25–108ã€Smc4 head-Brn1 643–668,685–747å’Œ Ycs4-Brn1 166–174,184–195,199–220çš„åž‹å·å–自酿酒酵æ¯(PDB ID 代ç 6YVU)的载脂蛋白å‡èšç´ 冷冻电镜结构并用作模æ¿ã€‚DNA 模型最åˆå–自S. cerevisiae cohesin cryo-EM 结构(PDB ID 代ç 6ZZ6))。使用 UCSF Chimera å°†æ¯ä¸ªåŽŸå模型对接到 EM 图ä¸ã€‚然åŽåœ¨ Coot ä¸æ‰‹åŠ¨è°ƒæ•´å’Œé‡å»ºåæ ‡ã€‚ä½¿ç”¨ ISOLDE ä¸çš„退ç«åŠŸèƒ½è¿›ä¸€æ¥å®Œå–„ DNA 模型。在使用模æ¿æž„建åŽï¼ŒYcs4 çš„ HEAT é‡å¤ 14 到 18 附近的清晰图谱密度很明显,并且使用二级结构预测和 cryoID 被鉴定为 Smc4(126-144)和 Brn1(275-323),然åŽåœ¨ Coot ä¸é‡æ–°æž„建。Ycs4(26-92 å’Œ 1159-1168)的 N 端和 C 端低分辨率区域是使用由 AlphaFold2 生æˆçš„S. cerevisiae Ycs4 的从头算模型构建的作为模æ¿ã€‚对于æ¥è‡ªå››èšä½“æ•°æ®é›†çš„头部模å—çš„å½¢å¼ IIï¼Œå½¢å¼ I 的精化模型åœé 在 3.05-Ã… 地图ä¸ï¼Œå¹¶åœ¨ PHENIX ä¸è¿›è¡Œäº†åˆšä½“精化,​​然åŽåœ¨ Coot ä¸è¿›è¡Œæ‰‹åŠ¨è°ƒæ•´ã€‚对于 Ycg1-DNA 原å模型,Ycg1-Brn1 å¤åˆç‰©çš„晶体结构(PDB ID 代ç 5OQQ)与 Chimera ä¸äº”èšä½“æ•°æ®é›†çš„ Ycg1-DNA 图进行对接,并使用 ISOLDE çµæ´»æ‹Ÿåˆ DNA 模型。然åŽåœ¨ Coot ä¸æ‰‹åŠ¨è°ƒæ•´å’Œé‡å»ºæ¨¡åž‹ï¼Œç„¶åŽåœ¨ PHENIX ä¸è¿›è¡Œå®žç©ºé—´ç»†åŒ–。图形和电影是使用 PyMOL 2.5 (Schrödinger)ã€UCSF Chimera å’Œ ChimeraX 生æˆçš„。计算é™ç”µåŠ¿å¹¶åœ¨ PyMOL ä¸æ˜¾ç¤ºã€‚
Brn1 N-末端释放测定。
如å‰æ‰€è¿°è¿›è¡Œ N 端释放测定,并进行修改。25 微克å«æœ‰ Brn1 TEV(残基 141 之åŽï¼‰å¹¶ç”¨ LD555(Lumidyne)(1 µg/µL)ã€1× acTEV 缓冲液(Thermo)和 20 U acTEV 蛋白酶(Thermoï¼‰æ ‡è®°çš„å‡èšç´ å…¨å¤åˆç‰©åœ¨ 4 °C 16 å°æ—¶ä»¥åˆ‡å‰² Brn1。
对于æ¯ç§æ ¸è‹·é…¸æ¡ä»¶ï¼Œ20 µL 蛋白 A ç£ç (Thermo)在 500 µL 洗涤缓冲液(50 mM Tris·HCl,pH 7.5ã€125 mM NaClã€50 mM KClã€5 mM MgCl 2å’Œ 5% 甘油)ä¸æ´—涤两次ã€1 mM DTTã€0.2 mM 苯甲基磺酰氟和 0.01% [vol/vol] Tween-20)。将ç åé‡æ–°æ‚¬æµ®åœ¨ 300 µL 洗涤缓冲液ä¸ï¼ŒåŠ å…¥ 3 µg 抗 HA æ ‡ç¾æŠ—体 (Roche),并在 4 °C ä¸‹æ··åˆ 1 å°æ—¶ã€‚将抗体结åˆçš„ç å洗涤两次并é‡æ–°æ‚¬æµ®åœ¨ 300 µL 洗涤缓冲液ä¸ã€‚æ¯ç§æ¡ä»¶ä¸‹å°† 5 微克裂解的 Brn1-å‡èšç´ æ·»åŠ åˆ°ç åä¸ï¼Œå¹¶åœ¨ 4 °C ä¸‹æ··åˆ 1 å°æ—¶ã€‚ç å在洗涤缓冲液ä¸æ´—涤 3 次,然åŽåœ¨ 300 µL 洗涤缓冲液ä¸æ´—涤 3 æ¬¡ï¼Œæ´—æ¶¤ç¼“å†²æ¶²å« 1 mM ATPï¼Œæ´—æ¶¤ç¼“å†²æ¶²å« ADP.BeF 3(0.5 mM ADP,0.5 mM BeSO 4, å’Œ 10 mM NaF),或å«æœ‰ 80-bp dsDNA å’Œ ADP.BeF 3çš„æ´—æ¶¤ç¼“å†²æ¶²ï¼ˆåœ¨æ·»åŠ 0.5 mM ADPã€0.5 mM BeSO4 å’Œ 10 mM NaF 之å‰æ·»åŠ å¹¶æ··åˆ 10 µM DNA)。然åŽå°†ç åé‡æ–°æ‚¬æµ®åœ¨ 50 µL 2× åäºŒçƒ·åŸºç¡«é…¸é’ (SDS) (100 mM Tris·HCl, pH 6.8, 4% [wt/vol] SDS, 20% 甘油 [vol/vol], 0.2% [wt/vol] ] 溴酚è“å’Œ 0.2 M DTT) 缓冲液并在 65 °C 下åµè‚² 5 分钟以洗脱蛋白质。洗脱液通过 SDS èšä¸™çƒ¯é…°èƒºå‡èƒ¶ç”µæ³³åˆ†ç¦»ï¼Œä¿ç•™çš„ Brn1 N 末端片段在å°é£Žæ‰«æ仪 (Amersham) 上å¯è§†åŒ–,通过对洗脱液进行考马斯染色确认å‡èšç´ çš„å…疫沉淀和ç‰è´Ÿè·ã€‚
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