DNA 的钳位关闭了缩合蛋白的颈门

admin

意义
DNA 需要被压缩以适应细胞核，并且在细胞分裂过程中，当形成致密的染色单体以进行机械分离时，这一过程取决于蛋白质复合物凝聚素。它通过环挤压在 DNA 中形成和扩大环。我们的工作解决了 ATP 未水解的 DNA 结合状态的凝聚素的原子结构。DNA 被夹在一个隔间内，该隔间已被报道在染色体 (SMC) 复合物的其他结构维护中，包括 Rad50、cohesin 和 MukBEF。需要注意的是重要差异，这意味着所有 SMC 复合物至少循环通过一些相似的状态，并在其头部模块中经历相似的构象变化，同时水解 ATP 和易位 DNA。

摘要

凝聚素是在有丝分裂期间将 DNA 压缩成染色单体所需的染色体结构维持 (SMC) 复合物。ATPase 驱动的环挤出促进了凝聚素对 DNA 的纵向压缩，这一过程被认为是大多数（如果不是全部）SMC 复合物的基本活动。为了获得分子见解，我们在可缓慢水解的 ATP 类似物和线性以及环状 DNA 的存在下获得了酵母凝聚素的电子低温显微镜结构。DNA 显示在接合的异二聚体 SMC ATP 酶头和 Ycs4 亚基之间被“夹住”，其方式类似于先前报道的 DNA 结合的 SMC 复合物结构。Ycg1 是另一个非 SMC 亚基，仅与复合物灵活结合，同时也与 DNA 紧密结合，并且通常与头部模块保持一定距离。在夹紧状态下，DNA 被 kleisin Brn1 和两个接合的 Smc2 和 Smc4 头部结构域包围。Brn1/Smc2/Smc4三方环在所有接口处都是闭合的，包括在Smc2的颈部。我们表明，在没有 DNA 的情况下，颈部门在头部接合时打开，但在 DNA 存在时它仍然关闭。我们的工作表明，凝聚素和其他 SMC 复合物在其 ATP 酶循环期间经历了类似的头部模块构象。相比之下，凝聚素复合物中 Ycg1 亚基的行为可能表明挤出反应的实施存在差异，我们的研究结果将进一步限制 SMC 复合物的环挤出机械模型。

Brn1/Smc2/Smc4三方环在所有接口处都是闭合的，包括在Smc2的颈部。我们表明，在没有 DNA 的情况下，颈部门在头部接合时打开，但在 DNA 存在时它仍然关闭。我们的工作表明，凝聚素和其他 SMC 复合物在其 ATP 酶循环期间经历了类似的头部模块构象。相比之下，凝聚素复合物中 Ycg1 亚基的行为可能表明挤出反应的实施存在差异，我们的研究结果将进一步限制 SMC 复合物的环挤出机械模型。Brn1/Smc2/Smc4三方环在所有接口处都是闭合的，包括在Smc2的颈部。我们表明，在没有 DNA 的情况下，颈部门在头部接合时打开，但在 DNA 存在时它仍然关闭。我们的工作表明，凝聚素和其他 SMC 复合物在其 ATP 酶循环期间经历了类似的头部模块构象。

相比之下，凝聚素复合物中 Ycg1 亚基的行为可能表明挤出反应的实施存在差异，我们的研究结果将进一步限制 SMC 复合物的环挤出机械模型。我们的工作表明，凝聚素和其他 SMC 复合物在其 ATP 酶循环期间经历了类似的头部模块构象。相比之下，凝聚素复合物中 Ycg1 亚基的行为可能表明挤出反应的实施存在差异，我们的研究结果将进一步限制 SMC 复合物的环挤出机械模型。我们的工作表明，凝聚素和其他 SMC 复合物在其 ATP 酶循环期间经历了类似的头部模块构象。相比之下，凝聚素复合物中 Ycg1 亚基的行为可能表明挤出反应的实施存在差异，我们的研究结果将进一步限制 SMC 复合物的环挤出机械模型。

染色体结构维持 (SMC) 复合物是生命各个领域中染色体动力学的驱动因素。在真核生物中，凝聚素在有丝分裂过程中将 DNA 组织成棒状染色单体，黏连蛋白介导姐妹染色单体的凝聚和间期染色体组织，而 Smc5/6 参与 DNA 修复。在细菌中，SMC-ScpAB 和 MukBEF 通过个体化复制的染色体来促进染色体分离。

尽管有这些不同的功能，SMC 复合体共享一个共同的架构，这使得它们很可能也通过共同的机制发挥作用。已显示几种 SMC 复合物通过称为环挤出的过程扩大 DNA 环，该过程由其 ATP 结合盒 (ABC) 型 ATP 酶提供动力。虽然酵母凝聚素和人类黏附素的环挤出已在体外重建 ( 3-5 )，但它们如何将 ATP 结合和水解产生的能量转化为沿 DNA 的运动尚不清楚。

核心 SMC 复合物是由两个 SMC 蛋白和一个 kleisin 组成的异三聚体环，在 condensin 中，它们分别是 Smc2、Smc4 和 Brn1（图1A）。SMC 蛋白在完全伸展时高度伸长，一个顶点有一个球状“铰链”结构域，另一个顶点有一个 ABC 型 ATPase“头”结构域，由 50 nm 反平行卷曲螺旋结构域隔开。两种 SMC 蛋白 Smc2 和 Smc4 通过铰链结构域稳定地结合在一起，形成异二聚体。Brn1 N 端结构域与 Smc2 的头部近端盘绕线圈、“颈部”结合，C 端结构域在称为“帽”的位置与 Smc4 头部结合，从而形成一个封闭的三方环。为了完成 condensin，与 Kleisins (HAWKs) 相关的两种含有 HEAT 重复的蛋白质 Ycs4 和 Ycg1 稳定地结合到 Brn1 的中心区域。
图。1。


（一）酵母凝聚素SMC复合物的结构。添加 DNA 和 ATP 类似物会导致钳位状态的形成，这是本研究的主题。虚线矩形标记了头部模块处于夹紧状态的部分，其中冷冻电镜结构已得到解决。（乙）凝聚素四聚体冷冻电镜图像的二维类平均值，包含亚基 Smc2、Smc4、kleisin Brn1 和 Ycs4。dsDNA 清晰可见，而 Smc2 和 Smc4 的盘绕线圈臂和铰链域相对于解析良好的头部模块具有高度的灵活性。（C）与 DNA 结合的夹紧凝聚素头模块的 2.95-Å 分辨率冷冻电镜图（I 型）。( D) 原子模型的卡通表示，内置并根据C中显示的地图进行了改进。kleisin Brn1 的各个部分是无序的。

先前的凝聚素电子低温显微镜 (cryo-EM) 结构表明凝聚素在至少两种状态之间切换 ( 7 )。在没有 ATP 的情况下，Ycs4 与 Smc2 和 Smc4 的头部结构域结合，而相比之下，Ycg1 是可移动的，可能通过 Brn1 内的柔性区域连接到复合体。在与 ATP 结合的结构中，Ycs4 未绑定并且可以移动，而 Ycg1 则绑定到头部。值得注意的是，Smc2 和 Brn1 之间的颈部界面，其中 Brn1 的 N 末端部分与 ATPase 头部附近的 Smc2 的卷曲螺旋颈部结合，在没有 ATP 的情况下关闭，但在 ATP 结合结构中没有解决。生化实验表明，Smc2 和 Brn1 之间颈部界面的开放是由 ATP 结合驱动的。据报道，cohesin 有类似的行为，它与 DNA 的解离需要打开 Smc3-kleisin (Scc1) 颈部界面，这取决于一种称为 Wapl 的辅助蛋白以及 ATP 结合。

cohesin 、SMC-ScpAB和 MukBEF的体内半胱氨酸交联分析已被用于揭示 SMC 复合物中可以截留环状 DNA 的拓扑隔室（SI 附录，图S1A ）。其中包括 SMC-Kleisin (SK) 隔室，以及当头部域接合时，接合头部 - Kleisin (EK) 和接合头部 - SMC (ES) 隔室。姐妹染色单体的凝聚力是由凝聚素的 SK 隔间内姐妹染色单体的共同捕获介导的。相反，目前尚不清楚 DNA 在环挤出过程中位于哪个隔室中，或者是否在任何隔室中。
处于 ATP 结合接合 (E) 状态并与一条 DNA 结合的内聚蛋白的冷冻电镜结构表明，DNA 被 Scc2 和 Smc3 的闭合颈部“夹”在二聚化 SMC ATP 酶结构域的顶部。使用体外半胱氨酸交联对相同的黏连蛋白-DNA 相互作用的分析表明，DNA 没有被困在 SK 环内，而是穿过 ES 和 EK 区室。这有力地表明，在粘连蛋白的钳位状态下，kleisin 在 DNA 顶部运行，并且 DNA 没有通过三聚体界面之一到达 SK。此外，最近在 ATP 和 DNA 结合状态下的 MukBEF 结构最终表明，由于整个 kleisin MukF 被分解，因此被夹住的 DNA 通过 EK 和 ES 区室。有趣的是，在这种结构中，ν-SMC-kleisin 颈界面并不是完全封闭的；然而，MatP DNA 卸载蛋白也被结合。
我们旨在研究凝聚素如何在 ATP 接合状态下与 DNA 相互作用，以及 DNA 相互作用如何调节颈部界面的状态。为了解决这个问题，我们首先使用冷冻电镜解决 DNA、ADP 和 BeF 3存在下凝聚素的结构。

结果“钳位”凝聚素复合物的冷冻电镜结构。

为了揭示凝聚素-DNA 复合物的结构，我们纯化了缺乏 Ycg1 亚基的“四聚体”出芽酵母凝聚素复合物（SI 附录，图 S1 B，包含亚基 Smc2、Scm4、Brn1 和 Ycs4）。我们将凝聚素四聚体与 80-bp 双链 DNA (dsDNA)、ADP 和氟化铍 (BeF 3 - ) 混合，将样品应用于冷冻电镜网格，并收集图像（SI 附录，图 S2 A）。与 ADP.BeF 3结合的 ABC 型 ATP 酶通常代表酶-底物复合物 ( 20 )。由于我们数据中 SMC 盘绕线圈和铰链部件的明显灵活性，我们无法对整个复合体进行分析（SI 附录，图 S2 B），而是专注于头部模块（图 1 B和SI 附录，图 S3，左）。在挑选出重点关注 SMC 头部域的粒子之后，通过二维 (2D) 分类选择了 702,764 个显示 SMC 头部、Ycs4 和 DNA 密度的良好粒子。通过进一步处理，我们重建了两个冷冻电镜图（I 型和 II 型），分辨率分别为 2.95 和 3.05 Å，分别具有 286,294 和 251,999 个粒子（图 1 C和SI 附录，图 S2 C和D）。这些映射使我们能够从两者构建和改进可靠的原子模型（SI 附录，表 S1）。对它们的构象进行比较表明，两个原子模型之间具有很强的相似性，均方根偏差为 1.2 Å（图 1 D和SI 附录，图 S2 E）。

在 I 型和 II 型两种结构中，SMC 头部域和近端盘绕线圈 Ycs4 和 Brn1 形成紧凑的球状结构，即头部模块。大多数 SMC 线圈和铰链未解决，很可能是由于解决部分的灵活性（图 1 B和SI 附录，图 S2 B）。在这两种结构中，DNA 都保持在二聚 SMC 头部结构域的上表面和 Ycs4 中的凹槽之间（图1C）。该图使我们能够追踪到 Brn1 kleisin 亚基的很大一部分（279/754，Brn1 中 37% 的残基），它与 Smc2 的颈部区域结合，通过扩展的相互作用表面和 Smc4 头部的帽与 Ycs4域 (图 1 D）。Smc2 和 kleisin 的 N 末端结构域之间的颈部界面在我们的结构中是封闭的，这可能表明 DNA 结合的钳位构象阻止了该界面的 ATP 依赖性开放，因为之前曾报道过 Smc2/kleisin 颈部在没有 DNA 的情况下，门在 ATP 结合时打开。I 型和 II 型的 DNA 密度不同，它们没有夹在 Ycs4 和 SMC 头之间。虽然 I 型的 DNA 穿过 SMC 头部的整个表面，但 II 型在 Ycs4 远端区域显示分辨率较差的 DNA 密度（SI 附录，图 S2 C-E）。由于 I 型和 II 型因此仅略有不同，我们基于 I 型来描述结构，除非另有说明（图 1C和D )。

ATPase 头部结构域的结构和与 DNA 的相互作用。

Condensin 包含两个 ATPase 位点，每个 SMC 头部结构域都具有来自一个共享或“夹层”活性位点的 Walker A 和 Walker B 基序和来自另一个的“ABC 签名基序”。在该结构中，头部域是二聚体，两个ADP.BeF 3夹在界面中（图2A）。每个活性位点都包含一个 ADP.BeF 3、一个 Mg 2+离子和 Smc2 和 Smc4 中高度保守的残基之间的相互作用网络。SMC 头部结构域的接合在其上侧​​产生了一个假双重对称的 DNA 结合表面，该表面由两个盘绕的线圈接壤（图 2 B）。大约 18 bp 的 DNA 穿过该表面，与大量带正电荷的残基相互作用（SI 附录，图 S4 A）。有趣的是，DNA 并不完全集中在 ATPase 头部的伪二重轴上（图 2 B），因此还与螺旋线圈 Smc2 颈部相互作用，而不是与螺旋线圈 Smc4 相互作用（图 2 B） . Brn1 的 N 端结构域与 Smc2 的颈部结合，也接近我们结构中的 DNA。

图 2。


( A ) Smc2 和 Smc4 的伪二重对称 ATP​​ase 头部结构域的顶视图。两个 ADP.BeF 3分子夹在它们之间，导致 SMC 头部域的接合。（乙）夹紧的 DNA 与 Smc2/4 的 ATPase 头部结构域的大部分带正电的上表面结合，但与伪双轴不完全对齐。DNA 也与 Smc2 和 Brn1 的盘绕线圈颈部接触，但不与 Smc4 的颈部接触。（C）在夹头模块中，Ycs4通过朝向N端的带正电荷的凹槽和C端附近的小触点与DNA进行广泛接触。( D ) Ycs4 与头模块内的其他子单元进行四次接触：(E ) 带有 Smc2 颈部和 Brn1，（F）带有从 Smc2 头域发出的环，该环在 Brn1 与 Ycs4 结合时也与 Brn1 接触，（G）在 Smc4 的背面有一个大补丁，和（H）与靠近 Smc4 的 N 端的一个非结构化和保守性差的部分。
Ycs4 是一个大的钩状蛋白质，由 21 个 HEAT 重复和一个称为“长鼻”的突起组成（SI 附录，图 S4 C）。在我们的冷冻电镜图中，我们观察到两个清晰的蛋白质密度沿着钩子的内部和尖端延伸（SI 附录，图 S4 C）。第一个密度显然对应于早先在 apo condensin 的低温-EM 结构中发现的 Brn1 的一部分，以及 Ycs4-Brn1 晶体结构（残基 184 到 223）（8），而我们将第二个密度分配给Brn1 的区域已被生化鉴定但未早先解决（残基 275 至 323）。

DNA 被 Ycs4 夹在二聚化头部的顶部。在 Ycs4 上，DNA 与蛋白质中间附近的一系列 HEAT 重复边缘形成的带正电表面结合，该表面包括残基 K211、K292、K300、K377、R416、K420 和 R556（图 1）。 2 C和SI 附录，图 S4 B）。在 Ycs4 的另一端和 DNA 的另一端，Ycs4 钩的尖端也通过一个精氨酸残基 (R1122) 与 DNA 的骨架结合。

Ycs4 在四个接口上与 Smc2 和 Smc4 形成广泛的联系（图2D）。第一个是 Ycs4 的 N 端 HEAT 重复 3 和 4、Smc2 的颈部和 Brn1 的螺旋 α3 的上端之间的三方相互作用（图2E）。这种排列将 Brn1 的 α3 捕获在 Ycs4 和 Smc2 之间，可能会阻止 Smc2-Brn1 界面的打开，如前所述，据报道，这种界面在没有 DNA 的情况下发生在头部接合期间。Ycs4 的第二个相互作用位点是从 Smc2 头部结构域（残基 69 至 73）一侧发出的环，该环也与来自 Brn1 的 α 螺旋（残基 189 至 196）接触（图 2F）。第三个相互作用很大，位于 Ycs4 中朝向 C 末端的区域（残基~1010 到 1094）和 Smc4 头部结构域背面的 β-折叠之间（图2G）。最后，在 Smc4 的 N 末端（127 到 131）附近的一个非结构化和不完全保守的区域形成了第四个 Ycs4 界面，使用 Ycs4 钩子的外部（图 2 H和SI 附录，图 S4 F）。

具有多种状态的凝聚素结构（apo、apo 桥接和 ATP 钳位）（蛋白质数据库 [PDB] ID 代码 6YVU、6YVV 和本研究）使我们能够分析伴随它们的构象变化。Ycs4的结构在apo和clamped结构中相似，但C端HEAT重复向外移动10-Å，这导致钩子略微加宽（SI附录，图S4 E，左）。在apo和apo-bridged构象中，Smc4和Ycs4之间的关联是相似的，但是在apo-bridged状态下SMC头部之间的距离变大了，并且Smc2与Ycs4的N端HEAT重复结合（SI附录，图S4 E，中）。Ycs4 和 SMC 磁头的相对方向是相似的。然而，在夹紧状态下，与 apo 和 apo 桥接相比，Ycs4 相对于 SMC 磁头旋转了 55°（SI 附录，图 S4 E，右）。

在钳位状态下，Ycg1 与 DNA 结合，但仅松散地附着在 Condensin 的头部模块上。

凝聚素“五聚体”全复合物（亚基 Smc2、Smc4、Brn1、Ycs4 和 Ycg1）的先前低温 EM 结构表明，在没有 DNA 的情况下，Ycg1 在 ATP 接合状态下与 Smc2 结合。为了确定 Ycg1 是否也与 DNA 结合、夹紧状态的头部模块相互作用，我们将凝聚素五聚体（SI 附录，图 S1 C）与 80-bp DNA、ADP 和 BeF 3像以前一样混合，并通过冷冻检查。 EM（SI 附录，图 S5 A）。使用我们的四聚体结构来指导分析，我们能够在广泛分类后解决两个独立的结构（SI 附录，图 S3，右图和 S5 B）。

首先，我们获得了包含凝聚素头模块的较大子复合体的地图，这与为四聚体确定的几乎没有区别。这张 3.7-Å 分辨率图（由于粒子数量限制，作为单个图处理：45,112 个粒子；SI 附录，图 S3，右）清楚地表明，Ycg1 与 Smc2 或球状头部模块内的任何其他亚基没有严格关联复合体（SI 附录，图 S5 B和C）。

其次，从同一个数据集中，我们以 3.2-Å 的分辨率解析了与 DNA 结合的 Ycg1 的结构（图 3 A和B ）。在这种结构中，与 Ycg1 结合并构成“安全带”（残基 387 至 524）的 Brn1 区域大部分被解决，除了无序的连接环（残基 411 至 458）（图 3丙）。DNA 在通过 Ycg1 的 DNA 结合表面并穿过安全带时会有些弯曲。DNA 覆盖了 Ycg1 的大部分带正电表面，与之前使用 X 射线晶体学的研究相比，我们可以识别出更多的 Ycg1-DNA 相互作用，该研究使用较短的 DNA（SI 附录，图 S5 D和E）。我们观察到 Ycg1 与 Brn1 结合而不与 condensin 的头部模块结合这一事实强烈表明，在 condensin 的钳位状态下，Ycg1 通过 Brn1 提供的灵活连接器与 Ycg1 交互站点的任一侧保持连接到复合体的其余部分(图3A )。
图 3。


（一）夹紧状态下凝聚素五聚体的结构，包含亚基 Smc2、Smc4、Brn1、Ycs4 和 Ycg1。（乙）单独的 Ycg1 分辨率为 3.2-Å 的冷冻电镜图，与 DNA 结合，从凝聚素五聚体上收集的数据集中获得，大概是因为 Ycg1 没有严格地附着在复合物或头部模块上。( C ) 原子模型的卡通表示，该模型内置于B中所示的地图中，并根据地图进行了改进。Brn1形成的“安全带”（21 ）得到了很好的解决，除了一个无序的循环。( D ) kleisin Brn1 通过酵母凝聚素的钳位状态的建议路径。在我们的冷冻电镜图中，有几个区域无法解析（图 1 C)，但有序切片的位置表明 kleisin 仍位于夹紧的 DNA 上方，导致 EK 陷入。大 Brn1 回路将 Ycg1 连接到头部模块，这使得 Ycg1 能够驻留在如图 4A 所示的距离处。

Brn1 亚基相对于 DNA 的路径。

DNA 通过 SMC 复合物的路径很重要，因为它决定了环状（或非常长的）DNA 是否在拓扑上被捕获。在以前的 cohesin 钳位结构中，很少有 kleisin 亚基 Scc1 被解析，并且使用半胱氨酸交联实验推断和验证了路径 。在目前的结构中，更多的 kleisin 链是可见的，这有助于确定 DNA 是否穿过 Smc2-Smc4-Brn1 (SK) 的三环并被其包裹（图 3 D）。如上所述，在我们的结构中，Brn1（22 到 106）的 N 端结构域与 Smc2 的颈部结合。然后，Brn1 沿着 Ycs4 的凹面（Brn1：163 到 223）和蛋白质的 C 末端（Brn1：275 到 323）蜿蜒。下一个解析的 Brn1 残基与 Ycg1 结合并在 DNA 周围形成安全带（Brn1：459 至 525），然后 Brn1 的 C 末端有翼螺旋结构域与 Smc4 的帽结合（Brn1：526 至 747）。虽然有几个区域仍未解决，但 Brn1 残基 106 和 163 的位置表明 Brn1 链最有可能通过 DNA 上方。这意味着 DNA 至少穿过 EK 隔室（SI 附录，图 S1 A）。

钳位状态下凝聚素和环状 DNA 之间的相互作用。

到目前为止，本研究中研究的凝聚素-DNA 复合物是使用 80 bp 双链线性 DNA 组装而成的。因此，夹头模块和 Ycg1 可能与分离的 DNA 分子结合，并且任何拓扑约束都被使用线性 DNA 的事实所覆盖。当所有亚基都有机会与同一条 DNA 链结合时，为了检查凝聚素全复合物的排列，我们混合凝聚素五聚体、缺口（松弛）质粒 DNA (1.7 kb)、ADP 和 BeF 3并使用带有 Volta 相位板 (VPP) 的冷冻电镜以增加成像对比度（图 4 A和SI 附录，图 S6）。在单个冷冻电镜图像中，没有平均，我们观察到凝聚素的复合物，其中主体和 Ycg1 最有可能与同一质粒结合。即使没有平均，也可以看到质粒 DNA 以与我们的更高分辨率结构所揭示的相同方式穿过头部模块并穿过 Ycg1（分别为图 1 C和3 B）。
图 4。


（A，左和中）凝聚素五聚体夹紧环状质粒 DNA，如通过带有 VPP 的冷冻电镜观察到的。与 DNA 结合的 Ycg1 与头部模块有一段距离，可能是因为 Ycg1 通过 Brn1 灵活连接。（一，右）中间图像的示意图和叠加的二维类平均值，突出显示头部模块和 Ycg1 之间的 DNA 环已经形成（深灰色）。打开的 SMC 螺旋线圈臂几乎可见。( B ) 夹持环状DNA的凝聚素头模块采用与线性DNA相同的构象(与图1C比较)。( C) 同样，Ycg1 以类似于线性 DNA 的方式与环状 DNA 结合（与图 3 B比较）。（D）头部模块的夹紧结构与 SMC 臂和铰链域的两条不同 DNA 路径兼容，未解决，导致拓扑包埋的不同加载路径。EK + ES 需要 DNA 穿过未接合的头部，而 EK + SK 需要在三方 SK 环 Smc2-Smc4-Brn1 中打开一个门（SI 附录，图 S1 A）。( E ,左) Smc2-Brn1 颈门在凝聚素的夹紧状态下关闭。颈门涉及 Brn1 的 N 末端螺旋结构域与 Smc2 的卷曲螺旋颈结合。Ycs4 的 N 端部分和夹住的 DNA 可能在那里稳定关闭由 Smc2、Smc4 和 Brn1 组成的三方 SK 环的颈门。（E，右）Brn1 N端释放试验。只要颈门没有关闭，工程化的 TEV 切割位点就可以使 N 端 Brn1 结构域从珠子上被切割和洗掉。N-末端片段用荧光染料 (LD555) 标记以进行可视化。在没有 DNA 的情况下，添加 ATP 或 ADP.BeF 3打开大门，而 DNA 的同时存在使大门保持关闭，大概是通过形成凝聚素的钳位状态，如图所示。

然后，我们生成了钳位凝聚素头模块和 Ycg1 的 2D 类平均值和三维 (3D) 模型，每个模型都与环状 DNA 结合（图 4 B和C）。虽然这些结构由于较小的粒子数而具有较低的分辨率，但它们显示出相同的构象，并且 DNA 也被困在 EK 隔室中。鉴于 DNA 是圆形的，DNA 不可能滑入 EK 隔室，因此 DNA 如何进入有两种可能性：1）SMC-kleisin 环中的三个界面之一打开，并且 DNA 在拓扑上被困在这个三方环（EK 和 SK）中或 2）DNA 在它们接合 ATP（EK 和 ES）之前在分离的头部之间通过。在第二个模型中，DNA 同时被困在 ES 和 EK 隔室中，但从未进入 SK 环。需要指出的是，由于盘绕线圈和铰链域的位置在夹紧状态下无法解析，图 4 D ) 以及与 ES（如从内聚素推断出的）或与 SK 的额外拓扑相互作用是可以想象的。SK 卡夹可以通过我们夹紧结构中盘绕线圈的打开来表示，但它需要门打开，正如之前提出的。

Smc2–Brn1 颈部接口在夹紧状态下保持关闭。

之前有报道称，在没有 DNA 的情况下，ATP 结合会导致 Brn1（N 末端结构域）和 Smc2 颈部界面的开放，以及 N-Scc1 和 Smc3 颈部在 cohesin 中的等效界面 。_ 为了支持这一点，在结合素 和凝聚素的核苷酸结合和 SMC 头部接合结构中，在没有 DNA 的情况下，kleisin 的 N 端结构域 (NTD) 不存在，而在kleisin 的 NTD 结合的无核苷酸和非接合结构。

此外，重组 condensin 的生化实验，称为 N 末端 kleisin 释放试验，已被用于证明 ATP 结合打开了这个界面。烟草蚀刻病毒 (TEV) 蛋白酶的识别序列被插入到 Brn1 的非结构化区域（残基 141 之后）。在用 TEV 蛋白酶切割 Brn1 后，在没有 ATP 的情况下，Brn1 N 末端片段与复合物的其余部分共免疫沉淀，报告了一个封闭的界面。然而，当在洗涤步骤中加入 ATP 时，N 末端片段没有与复合物共免疫沉淀，表明 ATP 刺激了界面的脱离。此外，N-末端片段在可以结合但不能水解 ATP 的突变体中释放，但在不能结合 ATP 的突变体中被消除。这表明 ATP 结合，但不是其随后的水解，刺激了 Smc2-Brn1 颈部界面的打开。

令人惊讶的是，在我们的钳位结构中，尽管 ATPase 头部和核苷酸结合，Smc2-Brn1 界面仍然关闭（图 4 E，左）。有两种可能性可以解释这一发现：1) 与 ATP 不同，ADP.BeF 3的结合不会刺激释放或 2) DNA 的结合并且处于钳位构象会抑制释放。为了检验这些假设，我们使用了相同的 N 端 Brn1 释放试验（图 4 E，右）。我们发现，如前所述，在没有核苷酸的情况下，Brn1 的 N 末端片段被有效地共免疫沉淀。当在免疫沉淀洗涤步骤中加入 ATP 时，N 末端片段不再共免疫沉淀，证实 ATP 刺激了释放。同样，当我们用含有 ADP.BeF 3的缓冲液洗涤珠子时，N 末端片段没有有效共沉淀。这表明，与 ADP.BeF 3刺激的 ATP 头部接合一样，会导致 Smc2-Brn1 颈部界面脱离。相反，当珠子在含有 80-bp dsDNA 和 ADP.BeF 3的缓冲液中洗涤时，N-末端片段被有效地共沉淀。总之，这些实验表明凝聚素在核苷酸驱动的头部接合过程中可以采用两种构象：其中一个 Smc2-Brn1 界面是开放的，如仅与 ATP 或 AMP-PNP ( 7 ) 结合的凝聚素的冷冻电镜结构所示，而在此处报告的另一个中，它被牢牢关闭（SI 附录，图 S7 A和B）。说它采用哪种构象的唯一决定因素似乎是 DNA 的存在与否似乎是合理的。

讨论最近提出了一种凝聚素将间期染色体转变为有丝分裂染色单体的机制：凝聚素在水解 ATP 的同时挤出染色体纤维，以产生跨越整个染色体的 DNA 环阵列。然而，尽管有大量的实验和模型，但这种非凡的运动活动的分子基础仍然是神秘的 ( 24 )。在本文中，我们介绍了与 DNA 和 ADP.BeF 3复合的 condensin 的结构，一种可缓慢水解的 ATP 模拟物。这揭示了 ATPase 循环中凝聚素的几个重要行为。首先，凝聚素采用“钳位”构象，其中 DNA 结合在接合的 SMC 头部结构域、Ycs4 亚基和 Smc2 颈部结构域之间。其次，DNA 通过 kleisin 和头部结构域之间的 EK 隔室。第三，关闭 Smc2 和 Brn1 之间的接口。后者令人惊讶，因为头部接合被认为打开了这个界面（8）。我们还提供了生物化学证据表明这种 ATP 刺激的界面开口受到 DNA 的抑制。

condensin 的钳位状态与 cohesin 的钳位状态密切相关（SI附录，图 S7 C和D），突出了两种蛋白质复合物之间潜在的深层机制相似性。在 cohesin 中，Scc2 cohesin “加载器”亚基在钳位缩合蛋白中占据 Ycs4 的位置，两种复合物在颈门（Smc2-Brn1；Smc3-Scc1）周围显示出非常相似的排列，kleisins 的 N 端域楔入两者之间SMC 颈部、DNA 和夹紧亚基。因此，颈门的打开似乎取决于两种复合物中 DNA 的缺失和 ATP 的存在，这并不奇怪 。因为 MukBEF 的钳位状态类似于黏连蛋白的钳位状态（SI 附录，图 S7 E），它也与凝聚素有关，同时发现 SbcCD (Mre11-Rad50)，一种类似 SMC参与 DNA 修复的蛋白质也以这种方式与 DNA 结合（PDB ID 代码 6S85），似乎 DNA 钳位是这些复合物的一种保守状态，并且可能与它们最基本的功能有关。

结合已发表的结构，我们的数据表明 condensin 可以采用至少四种稳定的构象：核苷酸存在下的两种非常不同的构象（ATP 接合 [ SI 附录，图 S7 A，右] 和 DNA 钳位)，取决于 DNA 的存在和两种无核苷酸的 apo 构象（apo 和 apo 桥接 [ SI 附录，图 S4 E，左和中]）。在 apo 构象中，Ycs4 与 SMC 头部结合，它们的 ATP 酶活性位点彼此背对并置。在 apo-bridged 构象中，头部被位于它们之间的 Ycs4 强制分开。在这两种状态下，Ycg1 仅通过灵活的 Brn1 链接器绑定到复合体。在没有 DNA 的 ATP 结合结构（ATP 接合）中，头部已接合，但现在 Ycs4 不再与主体绑定，而 Ycg1 与 Smc2 头部紧密结合，并且 Smc2-Brn1 颈部接口打开（SI 附录，图 S7 A，右）。最后，在与 ATP 和 DNA 结合的钳形结构中，头部结构域围绕核苷酸接合，然而 Ycs4 与主体相关而不是 Ycg1——并且 Smc2-Brn1 颈部界面是封闭的（本研究）。

可以想象，ADP.BeF 3 + DNA 与 ATP 或 AMP-PNP 结构（Smc2-Brn1 界面开口和 Ycg1/Ycs4 与 SMC 头结合）之间的不同构象是用于接合的不同核苷酸的结果头部结构域而不是 DNA 的存在。由于三个原因，这不太可能。首先，在之前对 ABC 型 ATP 酶的结构研究中，与不同核苷酸类似物接合的头部导致这些结构域的构象几乎相同。其次，在 cohesin 的等效钳位结构中，ATP 与突变 (EQ Walker B) 结合使用，导致 ATP 水解缺陷但不结合 ( 17 )。尽管使用 ATP 而不是 ADP.BeF 3，蛋白质采用相同的钳位构象，Smc3-Scc1界面关闭。第三，我们的Brn1 释放试验显示ATP 或ADP.BeF 3对颈门开口的影响没有明显差异。

我们的结构提出了一个有趣的问题，即之前没有 DNA 的凝聚素的 ATP 结合结构的重要性。condensin 是否采用两种不同的 ATP 结合构象作为环挤压过程的一部分？如果不是，当不处于钳位状态时，ATP 结合的相关性是什么？每个结构中 Smc2-Brn1 颈部界面的状态表明了一种可能的解释。在钳位状态下，该界面关闭，而在无 DNA 结构中，Brn1 N 端结构域无法解析，可能表明它是开放的。我们的生化证据进一步支持了这一发现，表明 ATP 结合会释放 Brn1 N 端结构域，除非反应中包含 DNA。因为这个接口的开放会损害三方凝聚环的完整性，ATP 结合状态可能代表假设的卸载反应。Condensin 需要能够以一种受调节的方式从染色质中解离，而 Smc2-Brn1 界面的打开是这种释放的一种可能机制，尤其是当 condensin 的环挤压或其他细胞活动涉及 DNA 的拓扑或假拓扑截留时 。事实上，通过黏附素 中的 Smc3–Scc1 界面卸载，其在细胞中的拓扑捕获已牢固确立，同样由 ATP 结合驱动。最后，最近的 MukBEF 结构与 MatP 卸载器复合，被认为显示了准备好进行 DNA 拓扑卸载的复合物，显示了类似的 N-kleisin 颈门 (MukF-MukB) 处于打开状态（SI 附录，图 S7 B )。

也可以想象，颈部界面处的环开口是 DNA 运动活动的一个组成部分，因为在整个易位周期中 DNA 可能不会与头部结构域保持结合。然而，最近的体外单分子实验表明，当颈部界面永久关闭时，凝聚素和黏附素都能够加载到 DNA 上并挤出环。这与以下发现一致，即等效黏连蛋白或 SMC-ScpAB 界面的闭合分别导致酵母和枯草芽孢杆菌中的功能复合物。

我们的冷冻电镜数据提供了明确的证据，表明凝聚素可以同时通过 Ycg1 和夹头模块与 DNA 结合。根据我们的结构和已发表的单分子实验，我们提出这是环挤出过程中的一个中间步骤，Ycg1 相对于头部模块的可变距离可能决定或允许凝聚素在 DNA 上进行步骤需要挤出循环并扩大它们。似乎还值得指出的是，夹头模块和 Ycg1 上的两个结合位点能够捕获预先形成的 DNA 环，如图4A所示。，这将是开始循环挤压的一个方便的初始反应。在这种情况下，Ycg1 可能充当 DNA 上的静态锚，这意味着在环挤压过程中，被夹紧的 DNA 被转移，这与 ATP 转换对 DNA 夹紧的调节一致。

然而，很明显，需要准确了解环挤压循环中的构象顺序，才能描述 DNA 易位和挤压的分子机制。这可以使用诸如荧光共振能量转移 (FRET) 等单分子方法来实现，特别是对于可能非常灵活的 SMC 臂，但我们设想通过冷冻电镜在环挤出过程中解决 SMC 复合物的这些结构最终可能需要了解与细胞骨架或其他核酸运动蛋白相同的详细程度所涉及的机制，只要复合物的重要和相关部分保持足够的刚性以实现或可以实现至少部分可见。

材料和方法质粒和蛋白质表达。

野生型凝聚素全复合物（五聚体）在来自两个 2-μm 高拷贝数质粒（pGAL7 SMC4-3xStrepII pGAL10-SMC2 pGAL1 BRN1-HA3-His 12 URA3 和 pGAL1 YCG1 pGAL10 YCS4 TRP1）的出芽酵母中过表达 . 含有 TEV 可切割 Brn1 的凝聚素全复合物从 pGAL7 SMC4-3xStrepII pGAL10-SMC2 pGAL1 BRN1（ybbR 标签替换残基 13 至 23、插入残基 141 的 3 x TEV 位点）-HA3-His 12 URA3 和 pGAL1 YCG1 pGAL10 YCS4 TRP1 过度表达。

为了表达凝聚素四聚体，Gibson 组装删除了 YCG1 以产生 pGAL1 YCG1 TRP1。培养物在-URA-TRP 脱除培养基+ 2% 棉子糖中生长，直到600 nm (OD 600 ) 处的光密度为0.8 至1。通过向培养基中添加2% 半乳糖并在30 °C 下孵育过夜来诱导蛋白质表达。

蛋白质纯化。

如前所述纯化重组凝聚素复合物，稍作修改。将诱导的酵母培养物离心，在磷酸盐缓冲盐水中洗涤一次，然后再次离心。用蛋白酶抑制剂 (Roche) 和 300 U/L 苯甲酶将细胞沉淀重新悬浮在 1× 沉淀体积的缓冲液 A（50 mM Tris·HCl，pH 8.0、200 mM NaCl、5% 甘油和 5 mM 2-巯基乙醇）中（西格玛）。然后将细胞悬浮液在 Spex Freezer Mill 中裂解（5 个循环，每次 3 分钟，12 cpm，循环之间冷却 3 分钟）。通过在 JA 25.50 转子中以 20,000 rpm 离心 30 分钟澄清裂解物，并通过 Whatman 纸过滤。然后通过添加 NaOH 将裂解物调节至 pH 8.0。过滤和澄清的裂解物以 1 mL/min 的流速加载到串联组装的两个 5 mL His-Trap 柱 (Cytiva) 上。用 100 mL Buffer A + 500 mM NaCl 洗涤柱子，50 mL 缓冲液 A + 40 mM 咪唑，速度为 5 mL/min，50 mL 缓冲液 A + 60 mM 咪唑，速度为 5 mL/min。然后在缓冲液 A + 200 mM 咪唑中洗脱蛋白质。峰级分在缓冲液 SB（50 mM Tris·HCl，pH 8，200 mM NaCl，5% 甘油和 1 mM 二硫苏糖醇 [DTT]）中混合并稀释两倍，并加载到 5-mL Strep-Trap 柱（Cytiva）上以 1 mL/min 的流速。用 50 mL Buffer SB、20 mL Buffer SB 和 50 mM KCl、10 mM MgCl2 和 1 mM ATP (Sigma) 洗涤柱子，然后用 50 mL Buffer SB 洗涤。然后在含有 5 mM 去皮生物素 (IBA) 的缓冲液 SB 中洗脱蛋白质。用 Vivaspin 20 100,000-Da 离心浓缩器 (Sartorius) 汇集和浓缩峰级分。峰级分在缓冲液 SB（50 mM Tris·HCl，pH 8，200 mM NaCl，5% 甘油和 1 mM 二硫苏糖醇 [DTT]）中混合并稀释两倍，并加载到 5-mL Strep-Trap 柱（Cytiva）上以 1 mL/min 的流速。用 50 mL Buffer SB、20 mL Buffer SB 和 50 mM KCl、10 mM MgCl2 和 1 mM ATP (Sigma) 洗涤柱子，然后用 50 mL Buffer SB 洗涤。然后在含有 5 mM 去皮生物素 (IBA) 的缓冲液 SB 中洗脱蛋白质。用 Vivaspin 20 100,000-Da 离心浓缩器 (Sartorius) 汇集和浓缩峰级分。峰级分在缓冲液 SB（50 mM Tris·HCl，pH 8，200 mM NaCl，5% 甘油和 1 mM 二硫苏糖醇 [DTT]）中混合并稀释两倍，并加载到 5-mL Strep-Trap 柱（Cytiva）上以 1 mL/min 的流速。用 50 mL Buffer SB、20 mL Buffer SB 和 50 mM KCl、10 mM MgCl2 和 1 mM ATP (Sigma) 洗涤柱子，然后用 50 mL Buffer SB 洗涤。然后在含有 5 mM 去皮生物素 (IBA) 的缓冲液 SB 中洗脱蛋白质。用 Vivaspin 20 100,000-Da 离心浓缩器 (Sartorius) 汇集和浓缩峰级分。和 1 mM ATP (Sigma)，然后是 50 mL 缓冲液 SB。然后在含有 5 mM 去皮生物素 (IBA) 的缓冲液 SB 中洗脱蛋白质。用 Vivaspin 20 100,000-Da 离心浓缩器 (Sartorius) 汇集和浓缩峰级分。和 1 mM ATP (Sigma)，然后是 50 mL 缓冲液 SB。然后在含有 5 mM 去皮生物素 (IBA) 的缓冲液 SB 中洗脱蛋白质。用 Vivaspin 20 100,000-Da 离心浓缩器 (Sartorius) 汇集和浓缩峰级分。

对于 TEV 可裂解凝聚素的荧光标记，在此阶段，CoA-LD555（Lumidyne）用重组 SFP 合酶（Addgene Plasmid 75015）与 Brn1-ybbR 缀合，如前所述。所有蛋白质都在 Superose 6 增加 10/300 GL 柱 (Cytiva) 上通过尺寸排阻色谱法进一步纯化，用含有 1 mM MgCl 2的缓冲液 SB 预平衡。使用 Vivaspin 20 100,000-Da 离心浓缩器浓缩峰级分并冷冻。

组装钳位凝聚素和冷冻电镜网格准备。

使用 Zeba Micro Spin 7K MWCO 柱（Thermo Fisher Scientific）在 TNT 缓冲液（30 mM Tris/HCl、60 mM NaCl、1 mM TCEP 和 2 mM MgCl 2，pH 7.5）中对纯化的凝聚素样品进行缓冲液交换。然后，将 0.5 ∼1-mg/mL 样品与 1∼2 µM 80-bp dsDNA（5'-GAATTCGGTGCGCATAATGTATAATAAGATAAATAAGCTTAAGTTCTTCCGATGCATAATAACATAATACGTGACTTTAC-3' 和 5'-GTAAAGTCACGTATTATGTTATTATGCATCGGAAGAACTTAAGCTTATTTATCTTATTATACATTATGCGCACCGAATTC-3'；DNA1，78900bp 松弛环状, 源自 pUC19) ( 17 ) 在 5 mM ADP、1 mM BeSO 4存在下和 10 mM NaF 在室温下放置 30 分钟。用 0.1% (wt/vol) β-辛基葡糖苷 (Anatrace) 补充培养的样品，并将其应用到新鲜发光的 200 方形网格 Ultrafoil R2/2 金网格 (Quantifoil) 上。将样品用 FEI Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) 在 4 °C 和 100% 湿度（印迹力 --10 至 -15，印迹时间 1.5∼2 s）和液体乙烷低温恒温器设置为93 千。

冷冻电镜图像采集。

所有冷冻电镜数据集都是在 FEI Titan Krios 电子显微镜（Thermo Fisher Scientific）上以 300 kV 获得的。EPU 用于自动数据收集，对于非 VPP 数据集，AFIS（无像差图像移位）用于提高吞吐量。对于凝聚素四聚体：80-bp DNA 数据集，使用具有 20-eV 狭缝宽度和 100-µm 物镜孔径的 GIF 量子能量过滤器获取图像；使用 Gatan K3 直接电子探测器以超分辨率模式记录了 8,784 部电影，标称放大倍率为 81,000 倍，对应于每像素 1.07 Å 的像素大小（超分辨率下每像素 0.535 Å）和标称散焦范围为 1.5∼ 3.3 微米。每部电影被剂量分割成 55 帧，总剂量为 55 e - /Å 2. 对于五聚体：80-bp DNA 数据集，使用 Falcon 4 检测器收集了 4,302 张图像，标称放大率为 75,000 倍（校准像素大小 1.08 Å）且没有任何物镜孔径。标称散焦范围设置为 1.5∼3.0 µm。每个图像都以 EER（电子事件表示）格式记录，总剂量为 40 e - /Å 2. 对于五聚体：圆形 DNA 数据集，使用 Falcon 4 探测器通过 VPP（散焦范围：0.6∼1.1）获得 3,179 张图像，标称放大倍数为 75,000 倍（像素大小 = 1.08 Å）。由于此 VPP 数据集中的凝聚素粒子数量不足以获得良好的 3D 类别，因此使用 100-μm 物镜孔径（散焦范围：1.5∼3.0μm）获得了额外的 1,016 个非 VPP 图像，使用下获得的网格相同的条件，但样品浓度更高。两个数据集均以 EER 格式记录，总剂量为 32 e - /Å 2。

冷冻电镜图像处理。

冷冻电镜数据处理工作流程总结在SI 附录图 S3中。除非另有说明，否则使用RELION 3.1、CtfFind4、crYOLO 和 cryoSPARC v3.2进行处理，并使用 RELION。总体分辨率是根据傅里叶壳相关金标准标准 (0.143)  确定的。所有图像都经过了 RELION 3.1 中实施的光束诱导运动校正。使用 7 × 5 块（用于 K3 数据集）或 5 × 5 块（用于 Falcon 4 数据集）对齐电影帧并结合剂量加权。EER 格式的 Falcon 4 电影被剂量分成 40 帧的组，对应于 1 e - /Å2 或 0.8 e -的剂量/Å 2每个分数的五聚体：80-bp DNA 或五聚体：环状 DNA 数据集，分别。使用 CtfFind4 估计 CTF 参数。

对于凝聚素四聚体：80-bp DNA 数据集，以 Laplacian-of-Gaussian blob 作为模板挑选了约 3 M 粒子并进行 2D 分类。使用来自显示不同方向的选定 2D 类图像的粒子生成头部复合体的初始 3D 模型。然后，为了使用 crYOLO 准确获得更多粒子，使用来自形成所选 2D 类的图像的坐标训练模型。使用 300 2像素（像素大小 = 1.07 Å），然后是 2D 分类；对 702,764 个接受的粒子进行了进一步的 3D 分类，并产生了两个显示二级结构特征的 3D 类别。对每个类别分别进行进一步处理，但方式相同。首先，执行 3D 自动精修并生成 3.27 Å（Form I）和 3.24 Å（Form II）的图，然后针对放大率各向异性、每粒子散焦、每显微照片散光和光束倾斜进行 CTF 精修。对于光束倾斜和 CTF 细化，粒子根据其孔位置分为光学组（因为 AFIS 数据收集）。然后，进行贝叶斯抛光，然后进行另一轮 3D 细化，以分别生成具有 2.95 和 3.05 Å 分辨率的 I 型和 II 型最终地图。

对于凝聚素五聚体：80-bp DNA 数据集，最初使用带有通用模型的 crYOLO 挑选粒子。在 cryoSPARC v3.2 中挑选了大约 600,000 个粒子，并对 50,000 个粒子的一个子集进行了五类从头算初始模型重建。使用得到的五个模型，对 cryoSPARC 中所有挑选的粒子进行了异质细化。选择显示“夹紧”头部模块或 Ycg1-DNA 复合物特征的类，并对每个类的相应粒子分别进行 crYOLO 模型训练，然后进行自动粒子拾取。通过对每个模型进行 crYOLO 拾取，分别获得了 476,997 个用于头部模块的粒子和 640,437 个用于 Ycg1-DNA 的粒子。每个模型的粒子首先使用来自第一次从头重建的五个模型通过 cryoSPARC 异质细化来清理。在 RELION 中没有对齐的其他 2D 和 3D 分类导致头部模块有 45,112 个粒子，Ycg1-DNA 有 91,024 个粒子。每个粒子都用 320 的盒子大小重新提取2和 300 2像素（像素大小 = 1.08 Å），分别。对每个粒子进行三维自动细化，然后进行 CTF 细化（放大各向异性、每粒子散焦、每显微照片散光和光束倾斜）和贝叶斯抛光。在 3D 细化后，分别获得了头部复合物和 Ycg1-DNA 分辨率为 3.68-Å 和 3.20-Å 的图谱。

对于凝聚素五聚体：环状 DNA，分别使用带有通用模型的 crYOLO 对两个数据集 VPP 和非 VPP 进行粒子拾取，然后以 360 2像素的框大小和 2× binning（180 2像素）进行提取大小，像素大小 = 2.16 Å）。然后将来自两个数据集的粒子合并，获得从头算重建，然后在 cryoSPARC 中进行多轮异构细化；选择了分别对应于头部模块和 Ycg1-DNA 的 36,588 和 27,040 个粒子，并在 cryoSPARC 中进行 3D 均匀细化，分别为头部复合物和 Ycg1-DNA 生成 8.75-和 8.95-Å 图。

在处理数据集的过程中，我们还发现了假定为 SMC 线圈臂或铰链的 2D 类（SI 附录，图 S2 B），但是，我们无法获得这些部件的可靠 3D 地图，可能是由于他们的灵活性。

模型构建和细化。

对于原子模型构建，使用 DeepEMhancer进一步改进了来自四聚体数据集的头模块和来自五聚体数据集的 Ycg1-DNA 复合物的两种形式 I 和 II 的映射。在 Coot和 ISOLDE中进行了模型构建。使用 phenix.real_space_refine优化坐标。使用 MolProbity进行模型验证。头部模块的原子模型首先被构建到来自四聚体：80-bp DNA 数据集的 2.95-Å 低温-EM 密度中。Smc2 head-Brn1 25–108、Smc4 head-Brn1 643–668,685–747和 Ycs4-Brn1 166–174,184–195,199–220的型号取自酿酒酵母(PDB ID 代码 6YVU)的载脂蛋白凝聚素冷冻电镜结构并用作模板。DNA 模型最初取自S. cerevisiae cohesin cryo-EM 结构（PDB ID 代码 6ZZ6））。使用 UCSF Chimera 将每个原子模型对接到 EM 图中。然后在 Coot 中手动调整和重建坐标。使用 ISOLDE 中的退火功能进一步完善 DNA 模型。在使用模板构建后，Ycs4 的 HEAT 重复 14 到 18 附近的清晰图谱密度很明显，并且使用二级结构预测和 cryoID 被鉴定为 Smc4（126-144）和 Brn1（275-323），然后在 Coot 中重新构建。Ycs4（26-92 和 1159-1168）的 N 端和 C 端低分辨率区域是使用由 AlphaFold2 生成的S. cerevisiae Ycs4 的从头算模型构建的作为模板。对于来自四聚体数据集的头部模块的形式 II，形式 I 的精化模型停靠在 3.05-Å 地图中，并在 PHENIX 中进行了刚体精化，​​然后在 Coot 中进行手动调整。对于 Ycg1-DNA 原子模型，Ycg1-Brn1 复合物的晶体结构（PDB ID 代码 5OQQ）与 Chimera 中五聚体数据集的 Ycg1-DNA 图进行对接，并使用 ISOLDE 灵活拟合 DNA 模型。然后在 Coot 中手动调整和重建模型，然后在 PHENIX 中进行实空间细化。图形和电影是使用 PyMOL 2.5 (Schrödinger)、UCSF Chimera 和 ChimeraX 生成的。计算静电势并在 PyMOL 中显示。

Brn1 N-末端释放测定。

如前所述进行 N 端释放测定，并进行修改。25 微克含有 Brn1 TEV（残基 141 之后）并用 LD555（Lumidyne）（1 µg/µL）、1× acTEV 缓冲液（Thermo）和 20 U acTEV 蛋白酶（Thermo）标记的凝聚素全复合物在 4 °C 16 小时以切割 Brn1。

对于每种核苷酸条件，20 µL 蛋白 A 磁珠（Thermo）在 500 µL 洗涤缓冲液（50 mM Tris·HCl，pH 7.5、125 mM NaCl、50 mM KCl、5 mM MgCl 2和 5% 甘油）中洗涤两次、1 mM DTT、0.2 mM 苯甲基磺酰氟和 0.01% [vol/vol] Tween-20)。将珠子重新悬浮在 300 µL 洗涤缓冲液中，加入 3 µg 抗 HA 标签抗体 (Roche)，并在 4 °C 下混合 1 小时。将抗体结合的珠子洗涤两次并重新悬浮在 300 µL 洗涤缓冲液中。每种条件下将 5 微克裂解的 Brn1-凝聚素添加到珠子中，并在 4 °C 下混合 1 小时。珠子在洗涤缓冲液中洗涤 3 次，然后在 300 µL 洗涤缓冲液中洗涤 3 次，洗涤缓冲液含 1 mM ATP，洗涤缓冲液含 ADP.BeF 3（0.5 mM ADP，0.5 mM BeSO 4, 和 10 mM NaF)，或含有 80-bp dsDNA 和 ADP.BeF 3的洗涤缓冲液（在添加 0.5 mM ADP、0.5 mM BeSO4 和 10 mM NaF 之前添加并混合 10 µM DNA）。然后将珠子重新悬浮在 50 µL 2× 十二烷基硫酸钠 (SDS) (100 mM Tris·HCl, pH 6.8, 4% [wt/vol] SDS, 20% 甘油 [vol/vol], 0.2% [wt/vol] ] 溴酚蓝和 0.2 M DTT) 缓冲液并在 65 °C 下孵育 5 分钟以洗脱蛋白质。洗脱液通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，保留的 Brn1 N 末端片段在台风扫描仪 (Amersham) 上可视化，通过对洗脱液进行考马斯染色确认凝聚素的免疫沉淀和等负荷。