与人血红蛋白结合的葡萄球菌 IsdB 的冷冻电镜结构揭示了...

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与人血红蛋白结合的葡萄球菌 IsdB 的冷冻电镜结构揭示了血红素提取的过程
意义

在感染期间，人类病原体金黄色葡萄球菌表达一种表面暴露受体铁表面决定簇 B (IsdB)，该受体捕获游离人类血红蛋白 (Hb) 并去除血红素以回收铁，铁是宿主体内细菌增殖的必需营养素。使用单粒子低温电子显微镜，我们解决了 Hb 和 IsdB 之间的两个复合物的结构，它们代表了初始相互作用的快照，其中血红素仍与 Hb 结合，以及完成血红素提取后的最终复合物。通过这些结构解锁的结构和动态细节将促进 IsdB:Hb 相互作用抑制剂的设计，这些抑制剂可能用作创新的抗菌剂。

摘要

铁表面决定簇 B (IsdB) 是一种血红蛋白 (Hb) 受体，对于金黄色葡萄球菌获取血铁至关重要。血红素可以从氧化的 Hb (metHb) 转移到 IsdB，但从 Hb 与氧结合 (oxyHb) 或与一氧化碳 (HbCO) 结合的血红素效率低下，并且包含一系列目前知之甚少的结构事件。通过单粒子低温电子显微镜，我们确定了两种 IsdB:Hb 复合物的结构，它们代表了血红素提取途径中的关键物种。IsdB:HbCO 结构，分辨率为 2.9-Å，提供了预提取复合物的快照。在 IsdB:Hb 相互作用的早期阶段，血细胞与 Hb 四聚体的 β 亚基结合，利用可能由顺式/反式触发的折叠结合机制Pro173的异构化。IsdB 与 α-亚基的结合发生在 Hb 四聚体解离为 α/β 二聚体时。IsdB:metHb 复合物的结构揭示了提取过程的最后一步，即完成向 IsdB 的血红素转移。在血红素从 Hb 转移到 IsdB 之前和之后，复合物的稳定性受 Pro173 异构化的影响。这些结果极大地增强了 IsdB 目前对血红素提取机制的结构和动态方面的理解，并提供了对在血红素转移事件之前稳定复合物的相互作用的洞察。该信息将支持未来通过干扰 IsdB:Hb 复合物形成来识别金黄色葡萄球菌获得血红素的抑制剂的努力。


病原体与其宿主的相互作用是由数百万年的共同进化形成的，其中出现的适应性机制之一是高效获取宿主定植所需的必需营养素。在金黄色葡萄球菌的情况下，必需元素 Fe 可以从宿主血红蛋白 (Hb) 中以血红蛋白的形式获得，它存在于血浆中，并随着分泌的细菌溶血素毒素引起的红细胞溶解而增加。血红素提取是通过暴露在细菌表面的两种受体的作用介导的：铁表面决定簇 (Isd) IsdB 和 IsdH。IsdB 和 IsdH 具有高度的序列和结构同源性以及相似的作用机制); 但 IsdB 在感染期间可能占主导地位，并已被用于开发疫苗。干扰 IsdB 活性可能证明是治疗感染的有效方法。
IsdB 是由三个结构域形成的模块化蛋白质：两个 NEAT（NEAr 铁转运蛋白）结构域（IsdB N1和 IsdB N2）由一个中间接头结构域 (IsdB L )  隔开。NEAT 结构域呈现出与血红素结合的免疫球蛋白样折叠，并已在许多革兰氏+细菌中发现，在病原体中的流行率较高。IsdB 的两个 NEAT 域在从 Hb 提取血红素的过程中发挥着不同的作用。IsdB N1通过表面暴露的环 2 与Hb 进行高亲和力结合，并定位 IsdB N2用于血红素提取。IsdB N2带有血红素结合基序 ( 440 YDGQY 444 )，该基序在金黄色葡萄球菌( 11 )的所有 NEAT 结构域中基本上是保守的。在 IsdB：血红素复合体中，基序中的 Tyr440 与半铁配位，Tyr444 通过 H 键稳定 Tyr440 的构象。值得注意的是，IsdB 可以从与氧 (oxyHb) 或一氧化碳 (HbCO) 结合的铁形式的 Hb、metHb 中提取血红素，而不是从亚铁形式中提取血红素。

在其作用中，IsdB 可将 Hb 的自发血红素释放速度提高 2,000 倍。已确定该过程的限速步骤，对于同源血细胞 IsdH，在近端组氨酸和血红素铁之间的配位键的水解裂解中，建议通过形成双组氨酸来辅助中间。该复合物的催化作用可能受到 X 射线晶体学难以捕捉的构象动力学的青睐。已经尝试了许多方法，使用提取缺陷型血细胞突变体和分离的 NEAT 结构域在转移过程的给定步骤中捕获 IsdH/IsdB:Hb 复合物。并确定了 IsdB:Hb 的结构，其中血红素已被置换到受体-Hb 界面。在这里，我们使用单粒子低温电子显微镜 (cryo-EM) 来确定 IsdB 与人类 Hb 的两个复合物的结构。第一个复合物 IsdB:HbCO 无法完成从 Hb 中提取血红素并转移到 IsdB，但在 2.9 Å 分辨率下揭示了血红素提取之前的蛋白质间相互作用；第二个复合体 IsdB:metHb 描述了转移后复合体。虽然后一种复合物的分辨率有限，只有 5.8 Å，但它显示了 IsdB 获取血红素的最后一步。

结果识别捕获稳定且均质的 IsdB 与 Hb 复合物的条件。

我们试图在两种状态下捕获 IsdB：Hb 复合物，在血红素提取之前和之后，这在以前没有被分离出来。为了估计这些状态下 IsdB:Hb 复合物的分子量以及它们的低聚状态，我们最初进行了尺寸排阻色谱和多角度光散射 (SEC-MALS) 分析（图 1 A和SI 附录，图 S1） . IsdB 的计算分子量 (MW) 为 42.3 kDa，接近预期值 43.3 kDa。我们观察到化学交联的 oxyHb 的表观分子量为 62.3 kDa（SI 附录，图 S1 B），正如预期的四聚体蛋白（计算 MW = 64 kDa）。然而，metHb、oxyHb 和 HbCO 洗脱为单峰，MW 分别为 38.5、47.8 和 46.2 kDa（SI 附录，图 S1 A），小于四聚体的预期质量，但与整体一致平均来自二聚体-四聚体平衡（32 至 64 kDa）。观察到的 oxyHb 的计算 MW 从 43.8 到 55.2 kDa 的浓度依赖性增加证实了整体行为（SI 附录，图 S1 B）。metHb、oxyHb 和 HbCO 的实验质量平均值的趋势与我们早期发现的更高 K D一致与 oxyHb 和 HbCO 形式相比，氧化 Hb 的四聚体解离 ( 13 )。
图。1。

IsdB 与 metHb、oxyHb 和 HbCO 相互作用的生化特征。( A ) 1 g/L 浓度下不同 IsdB:Hb 复合物样品的 SEC-MALS 分析。MW 的吸光度（线）和重均值（点）相对于洗脱体积作图，在整个峰宽上显示恒定的摩尔质量值。用于制备样品的化学计量比显示在每次运行的括号中（1:1，一个 IsdB 对一个珠蛋白链；1:2，一个 IsdB 对一个珠蛋白二聚体）。( B - E ) 在存在 ( B ) 和不存在 ( C ) IsdB 或存在 ( D ) 和不存在 ( E ) IsdB时的 oxyHb 的时间分辨光谱。( F) Hb 自氧化的时间过程通过B至E中数据的光谱反卷积计算。( G和H )添加 IsdB 前后metHb ( G ) 和 HbCO ( H ) 的吸收光谱。添加 IsdB 后，metHb 在 406 nm 处的 Soret 峰降低，蓝移和 380 nm 处的吸收增加，而当 IsdB 与 HbCO 混合时，没有观察到光谱变化。两个信号在 4 °C 下至少稳定 1 小时，验证了复合物在制备冷冻电镜样品所需的时间范围内的稳定性。在 IsdB:metHb 复合物中，血红素与 IsdB 结合，而在 IsdB:HbCO 复合物中，辅因子既不会转移到血细胞也不会被氧化。(I) IsdB:Hb 相互作用和血红素提取示意图。虽然 IsdB 与 metHb 和 HbCO 结合，但它只能提取含有氧化铁的血红素。

请记住，SEC 配置文件对应于稳定的物种混合物，MALS 提供平均整体质量，我们使用 SEC-MALS 来确定可以分离相关组件以进行进一步结构分析的条件。最初，我们选择了 1:1 的化学计量比（一个 IsdB 与一个珠蛋白链）来复杂地形成 IsdB:metHb、IsdBxyHb 和 IsdB:HbCO，基于之前对 metHb 的研究。IsdB:metHb 复合物以单峰形式洗脱（图 1 A），280 nm 处的洗脱曲线与在血红素最大吸收的 406 nm 处收集的色谱图非常匹配（SI 附录，图 S1 E）。然而，在两个波长收集的色谱图的形状和不完美重叠表明该峰可能是平均 MW 为 47.7 kDa 的物种的稳定混合物。优势物种似乎是由一个 IsdB 与单个 Hb 链 (59 kDa) 结合形成的复合物，并且样品不含大量游离 Hb、游离 IsdB 或更高阶复合物 (2IsdB:Hb二聚体复合物 [118 kDa] 或 4IsdB:Hb四聚体复合物 [236 kDa])。由于 Hb 单体化通常发生在极低浓度（K D在皮摩尔范围内），这一结果表明，在 IsdB 结合后提取血红素会导致 Hb 二聚体不稳定（23）。当 IsdB 与 oxyHb 或 HbCO 以 1:1 的化学计量比结合时，色谱图中可见两个部分分辨的峰，对应于 57.3/57.9 和 48.1/47.6 kDa 的质量（图1A）。重要的是，只有第一个峰显着吸收 415/419 nm 的光，因此含有血红素（SI 附录，图 S1 F和G）。当化学计量比变为 1:2（一个 IsdB 对一个球蛋白二聚体）时，检测到一个尖峰，表明先前观察到的低分子量物质可能对应于游离 IsdB（图 1 A，底部） .

代表提取前状态的 IsdB 和 Hb 之间的稳定复合物的制备需要配体 Hb，该配体 Hb 在冷冻电镜标本制备的时间范围内不会自动氧化。oxyHb 和 HbCO 都经历自氧化，据推测 IsdB 加速了这一过程以解释血红素转移的效率。我们通过吸收光谱的反卷积测量了在存在和不存在 IsdB 的情况下，在 37°C 和 pH 7.4 下的氧化 Hb 分数（图 1 B - F）。正如预期的那样，HbCO 的自氧化速率明显低于 oxyHb。在 IsdB 的存在下，自氧化过程显着加速，导致 oxyHb 在不到 4 小时内完全氧化。同样，HbCO 形式更稳定，5 小时后与 IsdB 复合的氧化 Hb 的比例仅为 0.13。这一发现表明 IsdB:HbCO 足够稳定，可以防止样品制备过程中的血红素转移，从而允许捕获初始的预提取复合物。我们通过在类似于网格制备过程的条件下通过吸收光谱监测转移反应进一步证实了血红素没有从 HbCO 转移到 IsdB（图 1 G和H）。事实上，IsdB 和 Hb 之间携带氧化或还原连接形式血红素的复合物呈现出与血红素所经历的环境和铁氧化态相关的独特吸收峰。Soret 峰代表血红素状态的主要特征，IsdB 和 meHb 之间复合物的形成与辅因子快速转移到血细胞有关，通过 406 和 380 nm 处的吸收变化来识别 。相反，在 IsdB:HbCO 复合物形成后 Soret 峰不受影响，表明还原的血红素与 Hb 稳定结合（图 1G-I）。对于低温 EM 分析，我们使用 1:2 IsdB:HbCO化学计量比制备提取前复合物的网格，而我们使用 1:1 IsdB:metHb 化学计量比制备最终复合物，血红素转移到 IsdB。

IsdB 复合物与 HbCO：血红素提取步骤的快照。

两种主要成分状态的三维 (3D) 重建（图 2和SI 附录，表 S1）分别以 2.9 和 3.6 Å 的分辨率获得，由傅里叶单元相关性 (FSC)= 0.143 标准确定（图 2 )。主要状态（IsdB：HbCO，超过 70% 的颗粒；蛋白质数据库 [PDB] ID 7PCH）是包含两个 IsdB 分子的复合物，该分子结合 Hb 四聚体的 β-Hb 亚基（图 3）。人口较少的状态 (IsdB:HbCO*, PDB ID 7PCQ) 对应于与 Hb 四聚体的 β-Hb 亚基结合的一个 IsdB 分子（图 4）。
图 2。

IsdB:HbCO 和 IsdB:HbCO* 复合物的单粒子分析。顶部显示了用于生成初始参考图和细化图的代表性显微照片和选定的 2D 类平均值（右流程图）。左中显示了 IsdB:HbCO (1:2) 和 IsdB:HbCO* (1:1) 复合物在两个方向上的局部分辨率低温电磁密度图。左下角显示了具有不同溶剂掩模的两个模型的傅里叶壳相关性以及最佳重建的估计分辨率。
图 3。

IsdB：来自冷冻电镜的 HbCO 复杂结构。（一）IsdB：HbCO复合物的示意图。（乙）2.9_低温电磁图和改进模型的顶视图和底视图。（C，左）IsdB：HbCO复合物的不对称单元，包含一个IsdB和一个αβ-Hb二聚体。二级结构元素被标记，循环 2 被突出显示。( C ,右) IsdB:HbCO 的主要相互作用区域的放大视图，如左图所示：区域 1，Hb 和 IsdB N1之间的分子接触，预计会促进复合物的形成；区域 2，IsdB L和 IsdB N2的触点带 F 螺旋；3 区和 4 区，IsdB N2与 Hb 的血红素结合口袋之间的相互作用网络。
图 4。

IsdB:HbCO* 来自冷冻电镜的复杂结构。（一）IsdB：HbCO*复合物的示意图。（乙）3.6_低温电磁图和改进模型的顶视图和底视图。( C ) IsdB:HbCO（青色）和 IsdB:HbCO*（紫色）复合物的 β-Hb 链上的血红素结合口袋。关键残基显示为棒，IsdB 残基和血红素之间的极性接触用虚线表示。( D ) IsdB:HbCO（青色）和 IsdB:HbCO*（紫色）复合物中分离的 α 1 β 1和 α 2 β 2 Hb 二聚体的排列。( E ) IsdB:HbCO 复合物（青色）和 IsdB:HbCO* 复合物（紫色）中 Hb 四聚体的叠加。

对于野生型金黄色葡萄球菌血细胞和人类 Hb之间的复合物，1:2 IsdB:HbCO 模型具有迄今为止获得的最高分辨率。IsdB 以其特有的哑铃结构折叠，将 IsdB N1结构域置于 Hb 的 A 和 E 螺旋旁边，将提取血红素的 IsdB N2结构域置于血红素结合口袋的入口处（图 3 A和B）。尽管有这种安排，血红素仍然与 Hb 亚基结合。IsdB N2也接近相反的 αβ-Hb 二聚体的 α-Hb 链，形成面积为 106 Å 2的小界面。β-Hb 链和血细胞之间的主要界面尺寸为 1,200 Å 2. IsdB 还与暴露在 β-Hb 亚基 (62 Å 2 ) 处的血红素修复基团相互作用。值得注意的是，冷冻电镜图的分辨率允许手动放置水分子，其中一些介导蛋白质-蛋白质接触（图 3 C）。

对复合物的详细分析揭示了 IsdB 和 β-Hb 链之间的四个相互作用热点，如图3C所示，并在SI 附录表 S2 和 S3中进行了总结。确定的一些关键极性相互作用与相关 IsdH 受体中所见的相似，并且与 metHb 和缺少 NEAT2 结构域的 IsdB 蛋白水解片段之间的复合物的 3.6 Å 分辨率结构一致。一个交互网络（区域 1，图 3 C) 包含属于 A 和 H 螺旋和 EF 环的 Hb 残基，它们直接或通过桥接水与 IsdB 上的残基 Phe164-Ala168（环 2）、Gln190、Phe194、Phe242 和 Asn243 相互作用。值得注意的是，环 2 包含 Hb 结合基序 并折叠成稳定的 α-螺旋，这在 Hb 与分离的 IsdB N1和 IsdH N1结构域的复合物中也观察到。环2结合后的折叠可能与脯氨酰顺式/反式有关异构化（见下文）并代表稳定复合物形成的驱动力。一旦折叠，螺旋插入疏水凹槽中，该凹槽由残基 Val11 (A8)、Trp15 (A12) 和 Leu75 (E19) 排列，位于 Hb 的螺旋 A 和 E 之间。第二个区域（区域 2，图 3C）对应于 IsdB L和 IsdB N2与 Hb 的 F 螺旋的相互作用。IsdB L与 F 螺旋建立了直接或水介导的极性接触网络，涉及 Hb 上的 Thr87 (F3) 和 Glu90 (F6) 以及 IsdB 上的 Tyr293 和 Lys297（SI 附录，表 S2）。这些接触可能导致 F 螺旋失真，这是血红素提取的关键步骤，正如观察到孤立的 IsdB 所证明的那样N1和 IsdB N2结构域同时与 Hb 结合不适合提取血红素，但 IsdB:HbCO 复合物中 β-Hb 亚基中的 F 螺旋相对于天然 HbCO 似乎没有改变。Andersen 和同事最近的工作报告了 IsdH 和结合珠蛋白结合的 Hb 之间的复合物的结构。氧化的二聚体形式的 Hb 与 α-和 β-亚基上的两个 IsdH 分子结合，但触珠蛋白的存在阻止了血红素的转移。有趣的是，Hb 的 α-和 β-亚基与 IsdH 的相互作用并不等价，而 Glu90 (F6)-Tyr495（相当于 IsdB 上的 Tyr293，属于 IsdB L) 氢键仅存在于 β-亚基上。值得注意的是，在我们的结构中观察到的 IsdB L与 Hb 的相互作用均未在 IsdB:Hb 复合物中报告，其中 IsdB 与 α-亚基 结合，可能是因为 F 螺旋的部分展开阻碍了残基的正确定位。因此，IsdB L在驱动 IsdB 与 β-亚基结合的选择性方面的任何参与都需要进一步研究。β7-β8 转角上的 Asp439 属于 IsdB N2结构域，与 His97 (FG4) 相互作用（见下文，图 3C ）。

第三和第四接触区域（区域 3 和 4，图 3C ）包括由 IsdB N2域介导的相互作用。在区域 3 内，血细胞与 β-Hb 链中血红素结合口袋的入口相互作用。重要的是，我们的结构分析不需要稳定突变，并提供了血细胞与血红素及其在野生型蛋白质中的结合口袋的预提取相互作用的详细信息。与 IsdB 相互作用的 Hb 残基位于 E 螺旋和螺旋内 CD 环上，而在 IsdB 中，残基主要位于 β7-β8 转角和 β8 链上。在这里，Tyr440 和 Tyr444 直接接触相同的丙酸血红素，而 β7-β8 转角上的 Asp439 与 His97 (FG4) 相互作用。这些残留物与 3 10-螺旋（残基362 MMDTF 366）和 β7 链已显示形成手扣复合物，有助于 Isd 系统的其他蛋白质中的血红素转移。重要的是，区域 3 显示有利于血红素提取的范德华相互作用，因为 IsdB 残基 Ile438 和 Tyr440 与 β-Hb 链中的 Phe41 (C7)、Leu91 (F7) 和 Leu96 (FG3) 接触，它们是血红素的一部分口袋。类似的热点已被证明在 IsdH 中必不可少，并且该水平的突变导致血红素转移的激活能垒更高，血红素提取率更低。在图 3 C中，由 3 10介导的相互作用的特写-螺旋和跨越 IsdB N2上残基 354 至 361 的环区域显示（区域 4）。该热点与 β-Hb 链的 CD 环和 E 螺旋上的关键残基结合，这些残基主要参与血红素稳定化。事实上，CD 环是远端组氨酸稳定所必需的，Lys59 (E3)、Lys65 (E9) 和 Lys66 (E10) 形成稳定血红素基团的静电相互作用。总体而言，这种结构描述了一个复杂的情况，其中在从 Hb 中去除血红素之前已经建立了一些关键的相互作用。Tyr440 和 Tyr444 直接结合辅因子丙酸盐，IsdB L与 F 螺旋形成多重接触。在免费的全息 IsdB N2中Tyr440 直接协调血红素铁和 Tyr444 氢键 Tyr440，可能稳定其位置。Tyr440 和 Tyr444 在参与提取过程中的作用在很大程度上得到了支持，因为它们在 Isd 系统的所有 NEAT 结构域中的保守性以及 Y440A 和 Y444A 突变体的血红素提取不足。

值得注意的是，与四个辅基结合的 CO 分子不存在密度，但血红素保留了通常在配体占据轴向位置时发现的平面构型（SI 附录，图 S2）。与 IsdB 混合的 HbCO 的可见吸收光谱在用于样品制备的条件下至少稳定 1 小时，这表明在溶液中与血细胞形成复合物不会导致配体损失（图 1 H）。与 HbCO 晶体结构相比，远端组氨酸已向 IsdB:HbCO 复合物中血红素结合袋的内部移动，以占据一些原本可以容纳 CO 分子的空间（SI 附录，图 S2 B）。明显的 CO 损失可能是由于配体的紊乱或血红素的氧化或非弹性散射电子引发的光解。释放的 CO 可能会在附近的内部结合口袋中离域，并且在 2.9 Å 分辨率下将无法解析。在低温下，Hb 构象很可能保持不变。

IsdB:HbCO复合密度图的近原子分辨率使我们能够清楚地识别顺式构型中的 Lys172-Pro173 和 His369-Pro370 肽键。只有 5% 的 X-Pro 肽键处于这种构型，但肽基-脯氨酰顺/反异构化可以作为蛋白质-蛋白质相互作用中的调节分子开关。His369 和 Pro370 位于 3 10螺旋附近，形成与血红素转移有关的手扣复合体。在 IsdB 中，3 10 -螺旋由残基 362 至 366 形成，His369 直接接触 Asp364 和 Val367。这个 X-Pro顺式肽键配置在负责血红素结合和转移的 Isd 系统的所有 NEAT 域（PDB ID 2E7D、2ITE、2ITF、2O6P、3VUA、4XS0、6TB2）（10、20、21、35、36 ）中都保持不变，而与它们无关血红素结合状态（apo 或 holo）；因此，我们得出结论，该键的异构化与复合物的形成无关。另一方面，Lys172 与位于 Hb 结合基序 ( 3 ) 中的残基 Tyr167 和 Ser170 建立极性接触，当与 Hb 结合时折叠成 α-螺旋。值得注意的是，在游离 IsdB N1 (PDB ID 2MOQ)的溶液结构中，Lys172-Pro173 键处于反式构型，并且 Hb 结合基序是非结构化的（SI 附录，图 S3 A），表明该肽键的顺式/反式异构化可能代表生产性结合的分子开关，并在结合时辅助环 2 折叠。使用 P173A 变体 (IsdB P173A ) 评估 Pro173 在复合物形成和血红素提取中的作用。IsdB P173A对 Hb的解离常数至少比野生型 IsdB 通过酶联免疫吸附试验 (ELISA) 测量的解离常数高一个数量级（SI 附录，图 S3 B），单位为纳摩尔范围，并表明 Pro173 的异构化顺式构型显着有助于结合亲和力。在我们测定的实验条件下（ SI 附录，图 S3 C ），结合亲和力的这种降低不会妨碍从 Hb 中提取血红素，这需要高蛋白质浓度（低微摩尔范围）才能从血红素中获得可测量的吸光度信号。高蛋白质浓度可能会稳定 Hb 和 IsdB P173A之间较弱的复合物，并允许血红素转移。然而，虽然 IsdB 与 metHb 的复合物在血红素提取后保持稳定，并且在 SEC-MALS 色谱图中看不到游离 Hb（图1A），但 Pro > Ala 取代使复合物不稳定并有利于其在血红素提取后解离（SI 附录，图 S3 D）。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分析洗脱峰证实它们对应于游离 IsdB 和游离 Hb（ SI 附录，图 S3 E）。

对于人口较少的状态 IsdB:HbCO*（图 4），血细胞和 β-Hb 链之间的界面面积与 IsdB:HbCO 状态（1,200 和 1,209 Å 2）相当，并且大部分接触是保守的. 然而，不存在 IsdB-Tyr440 和血红素之间的相互作用，这可能在从 Hb 中提取辅助因子中起关键作用（图 4 C）。在 IsdB 中观察到几个循环区域级别的小幅调整；然而，它们不参与与 Hb 的相互作用。相比之下，观察到两种复合物中 Hb 的结构存在较大差异，两条 α-Hb 链的 C 末端环有显着的结构重排。此外，即使单独的 Hb 二聚体是高度可叠加的，rmsd 为 0.162 和 0.219 Å（图 4 D），它们的相对位置在两个复合物中也有所不同，从而导致了不同的四元组织（图 4 E）。这种人口较少的物种可能代表膜锚定 IsdB 的第一个或主要结合事件，可能在形成复合物的途中，在此称为 IsdB:HbCO。

早期对与血细胞复合的 Hb 的研究表明，四元排列更接近于 T 状态，但在这两种情况下，Hb 在结晶过程中都已氧化，这可能影响了四元组织。我们比较了在低温 EM 分析中获得的两个配合物中 HbCO 的四级结构与 T 态 Hb (PDB ID 2DN2)、一些参考配体形式 (PDB IDs 2DN1 [Hb R-state]、1BBB [Hb R2-state] 和 1YZI [Hb R3-state])，以及 Hb 与 IsdH N2N3 (PDB ID 4XSO) 或 IsdB (PDB ID 5VMM) 结合。我们在 α 1 β上利用了 BGH 框架（αβ 二聚体中的一个不变结构区域）1二聚体手动叠加 Hb 四聚体，并使用 DynDom 软件计算二聚体间的平移和旋转。在表 1中，报告了 α 1 β 1和 α 2 β 2二聚体的 rmsd ，并评估了 α 1 β 1二聚体相对于 α 2 β 2的旋转/平移二聚体。我们的分析表明，Hb 四聚体的四元结构肯定更类似于配体 Hb，IsdB:HbCO 复合物与 R 相比显示出更小的 rmsd 和中间二聚体旋转/平移，而 IsdB:HbCO* 复合物与相对于 R2 状态。这一结果证实了我们的冷冻电镜模型描述了带有 Hb 的 IsdB 复合物，其四级排列，在没有血红素氧化和/或提取的情况下，血细胞结合没有显着改变。由于在我们的低温电磁条件下不知道孤立 HbCO 的四级结构，因此没有进一步推测在 IsdB:HbCO* 复合物中观察到的 R2 样结构是否应被视为通往 IsdB 路径的中间状态:HbCO。

表格1。
IsdB:HbCO* (PDB ID 7PCQ) 或 IsdB:HbCO (PDB ID 7PCH) 与参考 Hb 结构之间的四元结构比较展开表[td]

血红蛋白结构	数据库 ID	α 1 β 1 rmsd, Å		α 2 β 2 rmsd, Å
		IsdB:HbCO*	IsdB:HbCO	IsdB:HbCO*	IsdB:HbCO
IsdH 绑定	4XS0	2.077 [ 1.284 ]	1.841 [ 1.086 ]	9.471 [ 9.407 ]	7.893 [ 7.750 ]
T状态	2DN2	1.748 [ 1.080 ]	1.485 [ 0.862 ]	7.198 [ 7.099 ]	5.628 [ 5.468 ]
IsdB 界限	5VMM	1.811 [ 1.187 ]	1.533 [ 0.950 ]	3.766 [ 3.574 ]	4.390 [ 4.258 ]
R状态	2DN1	1.579 [ 0.878 ]	1.190 [ 0.619 ]	3.108 [ 2.850 ]	1.833 [ 1.524 ]
R2 状态	1BBB	1.325 [ 0.737 ]	1.696 [ 1.027 ]	2.680 [ 2.246 ]	4.292 [ 4.087 ]
R3 状态	1YZI	1.961 [ 1.282 ]	1.804 [ 1.107 ]	5.078 [ 4.931 ]	4.514 [ 4.281 ]
		旋转，°		翻译，Å
IsdH 绑定	4XS0	22.45	17.85	5.62	5.13
T状态	2DN2	17.26	13.15	2.82	2.05
IsdB 界限	5VMM	9.30	12.33	0.64	0.80
R状态	2DN1	6.69	3.45	1.29	0.74
R2 状态	1BBB	5.06	9.59	0.42	0.95
R3 状态	1YZI	14.33	13.05	1.27	1.26

所有原子对的 rmsd 值都是常规类型。C α原子对的rmsd 值以斜体显示。

IsdB:metHb 复合物。

IsdB:metHb 复合物的低温-EM 分析产生了估计为 5.8 Å 分辨率的图（SI 附录，图 S4）。虽然这不允许精确定位侧链，但特设模型与地图的对齐清楚地表明该复合物是由两个 IsdB 分子结合 Hb 二聚体形成的（图 5)，一种以前从未在结构上观察到的低聚状态。与 SEC-MALS 实验不同，此处较高的蛋白质浓度有助于稳定 Hb 的二聚体形式，而不是单体形式。在用于样品制备的浓度下，MetHb 本身预计主要是四聚体，但是，当与 IsdB 复合时，Hb 二聚体的存在可能会揭示 IsdB 结合对 Hb 寡聚状态的直接不稳定影响。因此，晶体状态结构研究所需的高蛋白质浓度可能阻碍了对这种复合物的鉴定，事实上，这种复合物可能是生理相关的复合物（金黄色葡萄球菌）仅以细胞外 Hb 为食）。IsdB 和metHb 之间的相互作用预计会导致 IsdB 血红素提取，这得到了吸收光谱的支持（图 1 G ）（4、13）；因此，用于解释低温电磁图的特设模型准备将辅因子绑定到 IsdB。Flex-EM 的灵活拟合改善了原子模型和体积密度的匹配，并允许我们秘密分配血红素位置并揭示两条 Hb 链上 F 螺旋的结构重排（图 5 C和D）。ad hoc 模型中血红素的位置最初是从 PDB ID 3RTL 获得的，这是孤立的 IsdB N2域 的血红素结合形式的晶体结构，并且经过细化的微小变化后很好地拟合地图（图. 5 C ). 因此，冷冻电镜图描述了在完成提取过程后血红素与 IsdB 结合的复合体。IsdB 在血红素提取后仍与 Hb 结合，解离可能需要缓慢的结构重排，可能包括 Pro173顺式/反式异构化。

图 5。

IsdB：来自低温-EM 的metHb 复杂结构。（一）IsdB：metHb复合物的示意图。（乙）通过 5.8 Å 低温电磁图中的 Flex-EM 改进原子模型。（C）血红素在α-（顶部）或β-HB（底部）复合体低温电磁图中的亚单位中的位置。（D ）IsdB中α-（顶部）或β-Hb（底部）亚单位中F螺旋的比较：metHb复合物和分离Hb结构中的天然螺旋（PDB ID 3P5Q）（40）。在相对地图密度内通过低温电磁法细化的结构的颜色与B类似，而原生结构为半透明灰色。

IsdB 从其结合口袋中提取血红素需要 Hb 的 F 螺旋部分展开，同时近端 His 和血红素铁之间的配位键断裂。特设模型与冷冻电镜图的初始对齐揭示了 F 螺旋区域的巨大差异。柔性拟合后，模型显示α-Hb链中的F螺旋部分展开，而β-Hb链中的F螺旋似乎完全展开（图5D ）。该结果证实了早期的发现 (PDB ID 5VMM) 血红素转移与 F 螺旋展开有关，并且另外表明展开持续存在于提取后和 IsdB 解离的两个 Hb 亚基上。IsdB:metHb 复合密度图中的局部分辨率评估表明，两种血细胞的 IsdB L和 IsdB N2域具有最低的定义，可能表明总体灵活性最高（SI 附录，图 S4）。IsdB N2从 Hb 中提取血红素，在此过程完成后，该结构域可能会失去对 Hb 的亲和力并开始解离。这一证据与分子动力学模拟非常一致，但也与 IsdB 之间存在特定的铰链区N1和 IsdB L域有利于复杂的形成和血红素提取，保持 IsdB N1稳定并允许 IsdB L和IsdB N2域的移动。

讨论

IsdB 是能够通过两个 IsdB N1和 IsdB N2域的协调运动催化从 Hb 中提取血红素的受体的一个显着例子，尽管这两个域具有高度的结构和序列同源性，但它们在血红素去除途径中发挥着不同的作用。我们在这里描述的 3D 结构代表了血红素提取过程中两个关键结构状态的快照。难以捉摸的提取前复合物 (IsdB:HbCO复合物) 和血红素转移后的最终状态 (IsdB:metHb 复合物) 已被隔离，允许可视化有效血红素提取的准备相互作用以及最终必须打破以产生后续血红素转移的相互作用受体蛋白。在图 6沿血红素提取途径的事件是使用来自此和已发表作品的结构数据呈现的。

图 6。


IsdB 的 Hb 结合和血红素提取。从 IsdB 结合到 Hb 并导致血红素提取的事件的合理序列是基于这项工作和已发布的数据构建的。基于沉积的 3D 结构的血红素结合口袋和 Hb 的 E 和 F 螺旋的特写显示在卡通下方。IsdB:HbCO 复合物 (PDB ID 7PCH) 的低温 EM 结构被用作对齐所有其他 PDB 模型的参考。步骤 1 到 7 的对齐基于 Hb，而步骤 8 中的对齐则使用 IsdB。
IsdB 可以逐步方式（图 6 ，步骤 2 和 3）与四聚体连接的 Hb（图 6 ，步骤 1）结合，得到最终复合物，其中 Hb 保留其四级结构，两个 IsdB 分子与 β-结合血红蛋白亚基。一个 IsdB 分子与一个 Hb 四聚体结合的装配体通过冷冻电镜分离出来，很可能代表形成饱和复合物的途径上的中间体。组装过程不知道是协同的，但由于 IsdB 在细胞表面上的空间共定位，它可能表现出螯合物的协同作用。公认的循环 Hb 模型是一种氧化的二聚体形式，因为预计细胞外 Hb 会被极度稀释并易于氧化。然而，金黄色葡萄球菌可能使用溶血毒素在感染部位局部从红细胞中释放 Hb。因此，此处用于捕获 IsdB 和 Hb 之间的初始复合物（即 HbCO）的 Hb 形式可能模拟了 IsdB 可以捕获刚从红细胞释放的四聚体 oxyHb 并促进其自动氧化的生理情况（图 1 F）。

IsdB 与 α-Hb 或 β-Hb 结合的偏好一直存在争议，迄今为止尚未获得结论性结果，部分原因是用于捕获中间体的方法总是会影响结合的链偏好。在 IsdB 与 Hb 复合的唯一可用结构中，全长 IsdB 链与 α-Hb 结合；β-Hb 亚基与只有 IsdB N1结构域的复合物结合，β-Hb 的血红素口袋是空的。这一发现强烈暗示提取事件首先发生在 β-Hb 亚基，然后是 α-Hb 亚基接合。我们的结构清楚地表明，第一个结合事件发生在 β-Hb 亚基上，并且 α-Hb 亚基仅在二聚 Hb 内可用于 IsdB 结合（图 6，第 5 步）。这种结合偏好的分子起源可能是元素的组合。本工作中鉴定的 IsdB 和 β-Hb 之间相互作用的类型和数量与 Bowden 等人鉴定的 IsdB 和 α-Hb 之间的相互作用并不完全匹配。（SI附录，图S5 B和C）。在 α-Hb [即 Lys8 (A5)-Glu190、Ser9 (A6)-Tyr165、Arg40 (C6)-Thr437、Glu43 (CD2)-Thr437 和 Ser44 (CD3)-Thr365] 中丢失了五种相互作用，这可能是对 β-Hb 的选择性。事实上，Gell 和他的同事报告说，α-Hb 与 IsdH N1相互作用的关键残基的单一替代足以完全消除结合（17）。此外，两个 IsdB 分子在 Hb 上与 α 链和 β 链结合后的排列完全不同（SI 附录，图 S5 A）；与 α 链结合的 IsdB 分子产生广泛的接触，这可能在结晶过程中稳定了复合物。然而，这种排列所需的两个 IsdB 分子的空间接近度在体内可能不太有利，因为 IsdB 锚定在细胞壁上。IsdB 对结合 β-Hb 链的偏好可能利用了 β-Hb 释放血红素的自然倾向，其释放血红素的速度比 α-Hb 快约 25 倍；事实上，一些作者推测 β 亚基的血红素释放可能在没有 F 螺旋展开的情况下发生。然而，我们的结果以及 Murphy 和同事的结果表明 F 螺旋也在 β 链上展开（图 6，步骤 6）并在最终复合物中保持展开（图 6，步骤 7）。已知 β-亚基中的 F 螺旋比 α-亚基的相应区域更灵活，并且可能有利于松开与位于同一螺旋上的近端组氨酸的配位键。一旦 IsdB 和 β-Hb 链之间形成紧密复合物，就会发生结构重排，可能包括四聚体破坏，从而使血细胞能够随后与 α-Hb 链结合（图 6），步骤 4 和 5）。IsdB 与四聚体的 β 链结合可以引发四元组织的不稳定和血红素腔重排，从而发生辅基转移。众所周知，Hb 四聚体破坏会增加半铁自氧化和辅因子释放速率，相反，血红素氧化会促进四聚体分解。因此，这两个过程交织在一起，但我们的结果表明，与 β-亚基的特异性结合更多地通过对血红素微环境的直接影响而不是对四聚体的稳定性的直接影响来引发血红素提取。这一结果显然与早期模型相反，在早期模型中，Hb 二聚化是通过由 Hb 四聚体上的四个血细胞同时结合引起的空间排斥引起的。

IsdB:HbCO 复合物的结构还揭示了Pro173 和 Lys172 之间存在顺式肽骨架构象，一旦血红素提取完成，该构象在触发 Hb 结合和/或复合物解离方面具有功能相关性。在这种构象中，Lys172 与属于 Hb 结合基序的残基建立极性键，通常表示为环 2。我们观察到的是环 2 的折叠状态与 Pro-Lys 键的构型之间的关联。在此处呈现的结构中，环 2 折叠成 α-螺旋，键呈顺式构型。相反，在孤立的 IsdB N1结构域 (PDB ID 2MOQ) ( 9 ) 的结构中，环 2 是非结构化的并且键是反式的配置。确定是否首先发生环 2 折叠或顺/反异构化需要进一步研究。IsdB P173A变体在血红素提取后复合物形成和解离都受到损害，这一发现强烈暗示 Pro173 在复合物形成和稳定性动力学中的关键作用，并且可能需要促进或控制血红素转移的以下步骤到下游接受者。

这里报告的高分辨率结构允许识别稳定预提取复合物的关键接触，其中一些以前从未报道过。未来可能会利用这些信息来识别能够干扰 IsdB:Hb 复合物形成的小分子，从而切断金黄色葡萄球菌所需的铁供应在宿主内生存。此外，这里报道的 IsdB:HbCO 复合物也为使用单粒子方法在高分辨率下进一步研究配体状态下的血红蛋白结构提供了机会。高分辨率，允许欣赏二级结构细节，以及冷冻电镜提供的确定混合构象结构的可能性，可能是最终解决在不久的将来长期存在的关于三级和四级异质性争议的关键Hb 的状态以及高亲和力和低亲和力构象的结构起源。

材料和方法

详细的材料和方法包含在SI 附录中。

冷冻电镜标本制备。

IsdB 与 meHb 以 1:1 的化学计量比混合（例如，每个 Hb 链一个 IsdB 分子）以达到 2 g/L 的最终浓度，而与 HbCO 的复合物以 8 g/L 的最终浓度制备通过以 1:2 的化学计量比将血细胞与 Hb 混合。根据 SEC-MALS 分析结果选择两种复合物中 IsdB 和 Hb 的不同比例。

样品在 10 mM Hepes 缓冲液 (pH 7.3) 中制备，以降低用于低温 EM 数据收集的背景电子密度，以及两性离子去污剂 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate ( CHAPSO）在急速冷冻前立即加入，最终浓度为 8 mM，以克服玻璃冰中颗粒的优选取向。将总共​​ 3 µL 的复合溶液施加到发光放电的 300 目 R1.2/1.3 UltrAuFoil 网格上，然后吸干 3 秒，然后在液体乙烷中快速冷冻。为了印迹和冷冻网格，使用了 Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) 装置，样品室保持在 4°C 和 99% 的湿度。

冷冻电镜数据收集。

对于高分辨率研究，IsdB:metHb 和 IsdB:HbCO 复合物均在 Titan Krios 低温电子显微镜（Thermo Fisher Scientific）中以 300 kV 成像，Gatan K3 直接电子探测器在校准放大倍率下以超分辨率模式工作×130,000，像素大小为 0.326 Å。显微照片由 EPU 软件 (Thermo Fisher Scientific) 在电影模式下记录，其中每张图像由 40 个单独的帧组成，曝光时间为 1.1 秒，剂量率为 15.3 电子/秒/Å 2。IsdB:metHb 和 IsdB:HbCO 复杂数据集总共产生 3,050 和 2,852 个电影堆栈，散焦范围分别为 -1.0/-3.1 和 -0.8/-2.8 μm。

图像处理。

使用 WARP分析 IsdB:HbCO 复合物以识别 460,000 个粒子，这些粒子使用 cryoSPARC 处理以分类二维 (2D) 和 3D 类别并通过施加 C2 对称性来细化粒子取向参数。2D 分类使我们能够区分 IsdB:HbCO 复合物的两种不同状态，呈现出成分异质性。在由 225,000 个粒子定义的第一种状态中，HbCO 四聚体由两个血细胞分子 (IsdB:HbCO) 结合，而在第二种状态（90,000 个粒子）中，只有一个血细胞与 HbCO 四聚体 (IsdB:HbCO*) 结合。使用 Phenix 包的 auto_sharpen 工具对地图进行了修改以进行解释。

IsdB:metHb 复合物的单粒子分析使用 RELION进行。使用在 RELION 中实现的 MOTIONCOR2 对所有显微照片进行运动校正，并使用 Kai Zhang 的 GCTF 估计对比度传递函数。粒子是使用 RELION 中的自动拾取选项找到的，提取了大约 300,000 个粒子，这些粒子通过多轮 2D 和 3D 分类进行筛选，以找到最佳集合。最后的细化是在 RELION 中的 CFTRefine 和贝叶斯抛光作业之后运行的，最终选择了大约 100,000 个粒子。
冷冻电镜数据处理分别为 IsdB:HbCO、IsdB:HbCO* 和 IsdB:metHb 复合物产生 2.9、3.6 和 5.8 Å 图。最终地图的这些分辨率是通过 FSC 曲线的 0.143 标准估计的。

建筑模型。

IsdB:HbCO 复合物的原子模型是通过在 Coot中手动调整和细化来制备的，这是一个使用两种不同晶体结构制成的起始模型，描述 IsdB:Hb 复合物 (PDB ID 5VMM)和天然 meHb (PDB ID 3P5Q）。该蛋白质复合物的晶体结构是迄今为止发表的唯一一种蛋白质复合物，其呈现与 β-Hb 链结合的蛋白水解血团和与 α-Hb 链结合的天然 IsdB 分子。血细胞的蛋白水解部分用于创建模型，其中天然血细胞与 β-Hb 链结合。IsdB:Hb 复合物的晶体结构还包括缺少原子和未折叠部分的 Hb；因此，它已被替换为原生metHb（PDB ID 3P5Q）的PDB坐标。最终，模型中血细胞的序列被修改以添加 Strep-tag ® II，这在已发布的结构中不存在。使用 Coot ( 53 )放置水分子，只有与 2DN3 模型一致的水分子才保留在最终结构中。

IsdB:metHb 复合物的冷冻电镜图密度不够详细，无法准确推导复合物中蛋白质残基的位置。因此，通过使用 Flex-EM ( 55 )对 Hb 二聚体与两个 IsdB 分子（每个 Hb 链一个分子）结合的特殊模型进行灵活拟合，然后在 Coot 中手动改进。IsdB:metHb 复杂模型是从 PDB ID 5VMM 结构开始构建的。IsdB 序列，包括 C 末端 Strep-tag ® II，是使用 Swiss Model 网络服务器在 5VMM 中的 IsdB 模板结构上建模的。由于在 5VMM 中 Hb 二级结构被严重改变，在我们的模型中，我们使用天然人类血红蛋白结构 (PDB ID 3P5Q)。如果供体和受体之间的距离在 3.5 埃（氢键）或 4.0 埃（离子相互作用）内，则表明极性接触。在 4.0 Å 内的链之间显示非极性接触。

使用 UCSF Chimera ( 56 ) 和欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息学研究所 (EMBL-EBI) PDBePISA将原子模型与已发表的高分辨率结构进行比较。使用 PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4.1 Schrödinger, LLC 制备图像。