与人血红蛋白结åˆçš„è‘¡è„çƒèŒ IsdB 的冷冻电镜结构æç¤ºäº†è¡€çº¢ç´ æå–的过程
æ„义
在感染期间,人类病原体金黄色葡è„çƒèŒè¡¨è¾¾ä¸€ç§è¡¨é¢æš´éœ²å—体é“表é¢å†³å®šç°‡ B (IsdB),该å—体æ•èŽ·æ¸¸ç¦»äººç±»è¡€çº¢è›‹ç™½ (Hb) å¹¶åŽ»é™¤è¡€çº¢ç´ ä»¥å›žæ”¶é“,é“是宿主体内细èŒå¢žæ®–的必需è¥å…»ç´ 。使用å•ç²’å低温电å显微镜,我们解决了 Hb å’Œ IsdB 之间的两个å¤åˆç‰©çš„结构,它们代表了åˆå§‹ç›¸äº’作用的快照,其ä¸è¡€çº¢ç´ ä»ä¸Ž Hb 结åˆï¼Œä»¥åŠå®Œæˆè¡€çº¢ç´ æå–åŽçš„最终å¤åˆç‰©ã€‚通过这些结构解é”的结构和动æ€ç»†èŠ‚将促进 IsdB:Hb 相互作用抑制剂的设计,这些抑制剂å¯èƒ½ç”¨ä½œåˆ›æ–°çš„抗èŒå‰‚。
摘è¦
é“表é¢å†³å®šç°‡ B (IsdB) 是一ç§è¡€çº¢è›‹ç™½ (Hb) å—体,对于金黄色葡è„çƒèŒèŽ·å–è¡€é“至关é‡è¦ã€‚è¡€çº¢ç´ å¯ä»¥ä»Žæ°§åŒ–çš„ Hb (metHb) 转移到 IsdB,但从 Hb ä¸Žæ°§ç»“åˆ (oxyHb) 或与一氧化碳 (HbCO) 结åˆçš„è¡€çº¢ç´ æ•ˆçŽ‡ä½Žä¸‹ï¼Œå¹¶ä¸”åŒ…å«ä¸€ç³»åˆ—ç›®å‰çŸ¥ä¹‹ç”šå°‘的结构事件。通过å•ç²’å低温电åæ˜¾å¾®é•œï¼Œæˆ‘ä»¬ç¡®å®šäº†ä¸¤ç§ IsdB:Hb å¤åˆç‰©çš„ç»“æž„ï¼Œå®ƒä»¬ä»£è¡¨äº†è¡€çº¢ç´ æå–途径ä¸çš„关键物ç§ã€‚IsdB:HbCO 结构,分辨率为 2.9-Å,æ供了预æå–å¤åˆç‰©çš„快照。在 IsdB:Hb 相互作用的早期阶段,血细胞与 Hb å››èšä½“çš„ β 亚基结åˆï¼Œåˆ©ç”¨å¯èƒ½ç”±é¡ºå¼/åå¼è§¦å‘的折å 结åˆæœºåˆ¶Pro173的异构化。IsdB 与 α-亚基的结åˆå‘生在 Hb å››èšä½“解离为 α/β 二èšä½“时。IsdB:metHb å¤åˆç‰©çš„结构æ示了æå–过程的最åŽä¸€æ¥ï¼Œå³å®Œæˆå‘ IsdB çš„è¡€çº¢ç´ è½¬ç§»ã€‚åœ¨è¡€çº¢ç´ ä»Ž Hb 转移到 IsdB 之å‰å’Œä¹‹åŽï¼Œå¤åˆç‰©çš„ç¨³å®šæ€§å— Pro173 异构化的影å“。这些结果æžå¤§åœ°å¢žå¼ºäº† IsdB ç›®å‰å¯¹è¡€çº¢ç´ æå–机制的结构和动æ€æ–¹é¢çš„ç†è§£ï¼Œå¹¶æä¾›äº†å¯¹åœ¨è¡€çº¢ç´ è½¬ç§»äº‹ä»¶ä¹‹å‰ç¨³å®šå¤åˆç‰©çš„相互作用的洞察。该信æ¯å°†æ”¯æŒæœªæ¥é€šè¿‡å¹²æ‰° IsdB:Hb å¤åˆç‰©å½¢æˆæ¥è¯†åˆ«é‡‘黄色葡è„çƒèŒèŽ·å¾—è¡€çº¢ç´ çš„æŠ‘åˆ¶å‰‚çš„åŠªåŠ›ã€‚
病原体与其宿主的相互作用是由数百万年的共åŒè¿›åŒ–å½¢æˆçš„,其ä¸å‡ºçŽ°çš„适应性机制之一是高效获å–宿主定æ¤æ‰€éœ€çš„必需è¥å…»ç´ 。在金黄色葡è„çƒèŒçš„æƒ…å†µä¸‹ï¼Œå¿…éœ€å…ƒç´ Fe å¯ä»¥ä»Žå®¿ä¸»è¡€çº¢è›‹ç™½ (Hb) ä¸ä»¥è¡€çº¢è›‹ç™½çš„å½¢å¼èŽ·å¾—,它å˜åœ¨äºŽè¡€æµ†ä¸ï¼Œå¹¶éšç€åˆ†æ³Œçš„细èŒæº¶è¡€ç´ æ¯’ç´ å¼•èµ·çš„çº¢ç»†èƒžæº¶è§£è€Œå¢žåŠ ã€‚è¡€çº¢ç´ æå–是通过暴露在细èŒè¡¨é¢çš„两ç§å—体的作用介导的:é“表é¢å†³å®šç°‡ (Isd) IsdB å’Œ IsdH。IsdB å’Œ IsdH 具有高度的åºåˆ—和结构åŒæºæ€§ä»¥åŠç›¸ä¼¼çš„作用机制); 但 IsdB 在感染期间å¯èƒ½å 主导地ä½ï¼Œå¹¶å·²è¢«ç”¨äºŽå¼€å‘疫苗。干扰 IsdB 活性å¯èƒ½è¯æ˜Žæ˜¯æ²»ç–—感染的有效方法。
IsdB 是由三个结构域形æˆçš„模å—化蛋白质:两个 NEAT(NEAr é“转è¿è›‹ç™½ï¼‰ç»“构域(IsdB N1å’Œ IsdB N2)由一个ä¸é—´æŽ¥å¤´ç»“构域 (IsdB L ) 隔开。NEAT ç»“æž„åŸŸå‘ˆçŽ°å‡ºä¸Žè¡€çº¢ç´ ç»“åˆçš„å…ç–«çƒè›‹ç™½æ ·æŠ˜å ,并已在许多é©å…°æ°+细èŒä¸å‘现,在病原体ä¸çš„æµè¡ŒçŽ‡è¾ƒé«˜ã€‚IsdB 的两个 NEAT 域在从 Hb æå–è¡€çº¢ç´ çš„è¿‡ç¨‹ä¸å‘挥ç€ä¸åŒçš„作用。IsdB N1通过表é¢æš´éœ²çš„环 2 与Hb 进行高亲和力结åˆï¼Œå¹¶å®šä½ IsdB N2ç”¨äºŽè¡€çº¢ç´ æå–。IsdB N2å¸¦æœ‰è¡€çº¢ç´ ç»“åˆåŸºåº ( 440 YDGQY 444 ),该基åºåœ¨é‡‘黄色葡è„çƒèŒ( 11 )的所有 NEAT 结构域ä¸åŸºæœ¬ä¸Šæ˜¯ä¿å®ˆçš„。在 IsdBï¼šè¡€çº¢ç´ å¤åˆä½“ä¸ï¼ŒåŸºåºä¸çš„ Tyr440 与åŠé“é…ä½ï¼ŒTyr444 通过 H 键稳定 Tyr440 的构象。值得注æ„的是,IsdB å¯ä»¥ä»Žä¸Žæ°§ (oxyHb) 或一氧化碳 (HbCO) 结åˆçš„é“å½¢å¼çš„ Hbã€metHb ä¸æå–è¡€çº¢ç´ ï¼Œè€Œä¸æ˜¯ä»Žäºšé“å½¢å¼ä¸æå–è¡€çº¢ç´ ã€‚
在其作用ä¸ï¼ŒIsdB å¯å°† Hb 的自å‘è¡€çº¢ç´ é‡Šæ”¾é€Ÿåº¦æ高 2,000 å€ã€‚已确定该过程的é™é€Ÿæ¥éª¤ï¼Œå¯¹äºŽåŒæºè¡€ç»†èƒž IsdHï¼Œåœ¨è¿‘ç«¯ç»„æ°¨é…¸å’Œè¡€çº¢ç´ é“之间的é…ä½é”®çš„水解裂解ä¸ï¼Œå»ºè®®é€šè¿‡å½¢æˆåŒç»„氨酸æ¥è¾…助ä¸é—´ã€‚该å¤åˆç‰©çš„催化作用å¯èƒ½å—到 X 射线晶体å¦éš¾ä»¥æ•æ‰çš„构象动力å¦çš„é’ç。已ç»å°è¯•äº†è®¸å¤šæ–¹æ³•ï¼Œä½¿ç”¨æå–缺陷型血细胞çªå˜ä½“和分离的 NEAT 结构域在转移过程的给定æ¥éª¤ä¸æ•èŽ· IsdH/IsdB:Hb å¤åˆç‰©ã€‚并确定了 IsdB:Hb 的结构,其ä¸è¡€çº¢ç´ 已被置æ¢åˆ°å—体-Hb ç•Œé¢ã€‚在这里,我们使用å•ç²’å低温电å显微镜 (cryo-EM) æ¥ç¡®å®š IsdB 与人类 Hb 的两个å¤åˆç‰©çš„结构。第一个å¤åˆç‰© IsdB:HbCO æ— æ³•å®Œæˆä»Ž Hb ä¸æå–è¡€çº¢ç´ å¹¶è½¬ç§»åˆ° IsdB,但在 2.9 Ã… 分辨率下æç¤ºäº†è¡€çº¢ç´ æå–之å‰çš„蛋白质间相互作用;第二个å¤åˆä½“ IsdB:metHb æ述了转移åŽå¤åˆä½“。虽然åŽä¸€ç§å¤åˆç‰©çš„分辨率有é™ï¼Œåªæœ‰ 5.8 Å,但它显示了 IsdB 获å–è¡€çº¢ç´ çš„æœ€åŽä¸€æ¥ã€‚
结果识别æ•èŽ·ç¨³å®šä¸”å‡è´¨çš„ IsdB 与 Hb å¤åˆç‰©çš„æ¡ä»¶ã€‚
我们试图在两ç§çŠ¶æ€ä¸‹æ•èŽ· IsdB:Hb å¤åˆç‰©ï¼Œåœ¨è¡€çº¢ç´ æå–之å‰å’Œä¹‹åŽï¼Œè¿™åœ¨ä»¥å‰æ²¡æœ‰è¢«åˆ†ç¦»å‡ºæ¥ã€‚为了估计这些状æ€ä¸‹ IsdB:Hb å¤åˆç‰©çš„分åé‡ä»¥åŠå®ƒä»¬çš„低èšçŠ¶æ€ï¼Œæˆ‘们最åˆè¿›è¡Œäº†å°ºå¯¸æŽ’阻色谱和多角度光散射 (SEC-MALS) 分æžï¼ˆå›¾ 1 Aå’ŒSI 附录,图 S1) . IsdB 的计算分åé‡ (MW) 为 42.3 kDa,接近预期值 43.3 kDa。我们观察到化å¦äº¤è”çš„ oxyHb 的表观分åé‡ä¸º 62.3 kDa(SI 附录,图 S1 B),æ£å¦‚预期的四èšä½“蛋白(计算 MW = 64 kDa)。然而,metHbã€oxyHb å’Œ HbCO 洗脱为å•å³°ï¼ŒMW 分别为 38.5ã€47.8 å’Œ 46.2 kDa(SI 附录,图 S1 A),å°äºŽå››èšä½“的预期质é‡ï¼Œä½†ä¸Žæ•´ä½“一致平å‡æ¥è‡ªäºŒèšä½“-å››èšä½“平衡(32 至 64 kDa)。观察到的 oxyHb 的计算 MW 从 43.8 到 55.2 kDa 的浓度ä¾èµ–æ€§å¢žåŠ è¯å®žäº†æ•´ä½“行为(SI 附录,图 S1 B)。metHbã€oxyHb å’Œ HbCO 的实验质é‡å¹³å‡å€¼çš„趋势与我们早期å‘现的更高 K D一致与 oxyHb å’Œ HbCO å½¢å¼ç›¸æ¯”,氧化 Hb çš„å››èšä½“解离 ( 13 )。
图。1。
IsdB 与 metHbã€oxyHb å’Œ HbCO 相互作用的生化特å¾ã€‚( A ) 1 g/L 浓度下ä¸åŒ IsdB:Hb å¤åˆç‰©æ ·å“çš„ SEC-MALS 分æžã€‚MW çš„å¸å…‰åº¦ï¼ˆçº¿ï¼‰å’Œé‡å‡å€¼ï¼ˆç‚¹ï¼‰ç›¸å¯¹äºŽæ´—脱体积作图,在整个峰宽上显示æ’定的摩尔质é‡å€¼ã€‚ç”¨äºŽåˆ¶å¤‡æ ·å“的化å¦è®¡é‡æ¯”显示在æ¯æ¬¡è¿è¡Œçš„括å·ä¸ï¼ˆ1:1,一个 IsdB 对一个ç 蛋白链;1:2,一个 IsdB 对一个ç 蛋白二èšä½“)。( B - E ) 在å˜åœ¨ ( B ) å’Œä¸å˜åœ¨ ( C ) IsdB 或å˜åœ¨ ( D ) å’Œä¸å˜åœ¨ ( E ) IsdB时的 oxyHb 的时间分辨光谱。( F) Hb 自氧化的时间过程通过B至Eä¸æ•°æ®çš„光谱åå·ç§¯è®¡ç®—。( Gå’ŒH )æ·»åŠ IsdB å‰åŽmetHb ( G ) å’Œ HbCO ( H ) çš„å¸æ”¶å…‰è°±ã€‚æ·»åŠ IsdB åŽï¼ŒmetHb 在 406 nm 处的 Soret å³°é™ä½Žï¼Œè“移和 380 nm 处的å¸æ”¶å¢žåŠ ,而当 IsdB 与 HbCO æ··åˆæ—¶ï¼Œæ²¡æœ‰è§‚察到光谱å˜åŒ–。两个信å·åœ¨ 4 °C 下至少稳定 1 å°æ—¶ï¼ŒéªŒè¯äº†å¤åˆç‰©åœ¨åˆ¶å¤‡å†·å†»ç”µé•œæ ·å“所需的时间范围内的稳定性。在 IsdB:metHb å¤åˆç‰©ä¸ï¼Œè¡€çº¢ç´ 与 IsdB 结åˆï¼Œè€Œåœ¨ IsdB:HbCO å¤åˆç‰©ä¸ï¼Œè¾…å› åæ—¢ä¸ä¼šè½¬ç§»åˆ°è¡€ç»†èƒžä¹Ÿä¸ä¼šè¢«æ°§åŒ–。(I) IsdB:Hb ç›¸äº’ä½œç”¨å’Œè¡€çº¢ç´ æå–示æ„图。虽然 IsdB 与 metHb å’Œ HbCO 结åˆï¼Œä½†å®ƒåªèƒ½æå–å«æœ‰æ°§åŒ–é“çš„è¡€çº¢ç´ ã€‚
请记ä½ï¼ŒSEC é…置文件对应于稳定的物ç§æ··åˆç‰©ï¼ŒMALS æ供平å‡æ•´ä½“è´¨é‡ï¼Œæˆ‘们使用 SEC-MALS æ¥ç¡®å®šå¯ä»¥åˆ†ç¦»ç›¸å…³ç»„件以进行进一æ¥ç»“构分æžçš„æ¡ä»¶ã€‚最åˆï¼Œæˆ‘们选择了 1:1 的化å¦è®¡é‡æ¯”(一个 IsdB 与一个ç 蛋白链)æ¥å¤æ‚åœ°å½¢æˆ IsdB:metHbã€IsdBxyHb å’Œ IsdB:HbCO,基于之å‰å¯¹ metHb çš„ç ”ç©¶ã€‚IsdB:metHb å¤åˆç‰©ä»¥å•å³°å½¢å¼æ´—脱(图 1 A),280 nm å¤„çš„æ´—è„±æ›²çº¿ä¸Žåœ¨è¡€çº¢ç´ æœ€å¤§å¸æ”¶çš„ 406 nm 处收集的色谱图éžå¸¸åŒ¹é…(SI 附录,图 S1 E)。然而,在两个波长收集的色谱图的形状和ä¸å®Œç¾Žé‡å 表明该峰å¯èƒ½æ˜¯å¹³å‡ MW 为 47.7 kDa 的物ç§çš„稳定混åˆç‰©ã€‚优势物ç§ä¼¼ä¹Žæ˜¯ç”±ä¸€ä¸ª IsdB 与å•ä¸ª Hb 链 (59 kDa) 结åˆå½¢æˆçš„å¤åˆç‰©ï¼Œå¹¶ä¸”æ ·å“ä¸å«å¤§é‡æ¸¸ç¦» Hbã€æ¸¸ç¦» IsdB 或更高阶å¤åˆç‰© (2IsdB:Hb二èšä½“å¤åˆç‰© [118 kDa] 或 4IsdB:Hbå››èšä½“å¤åˆç‰© [236 kDa])。由于 Hb å•ä½“化通常å‘生在æžä½Žæµ“度(K D在皮摩尔范围内),这一结果表明,在 IsdB 结åˆåŽæå–è¡€çº¢ç´ ä¼šå¯¼è‡´ Hb 二èšä½“ä¸ç¨³å®šï¼ˆ23)。当 IsdB 与 oxyHb 或 HbCO 以 1:1 的化å¦è®¡é‡æ¯”结åˆæ—¶ï¼Œè‰²è°±å›¾ä¸å¯è§ä¸¤ä¸ªéƒ¨åˆ†åˆ†è¾¨çš„峰,对应于 57.3/57.9 å’Œ 48.1/47.6 kDa çš„è´¨é‡ï¼ˆå›¾1A)。é‡è¦çš„是,åªæœ‰ç¬¬ä¸€ä¸ªå³°æ˜¾ç€å¸æ”¶ 415/419 nm çš„å…‰ï¼Œå› æ¤å«æœ‰è¡€çº¢ç´ (SI 附录,图 S1 Få’ŒG)。当化å¦è®¡é‡æ¯”å˜ä¸º 1:2(一个 IsdB 对一个çƒè›‹ç™½äºŒèšä½“)时,检测到一个尖峰,表明先å‰è§‚察到的低分åé‡ç‰©è´¨å¯èƒ½å¯¹åº”于游离 IsdB(图 1 A,底部) .
代表æå–å‰çŠ¶æ€çš„ IsdB å’Œ Hb 之间的稳定å¤åˆç‰©çš„制备需è¦é…体 Hb,该é…体 Hb åœ¨å†·å†»ç”µé•œæ ‡æœ¬åˆ¶å¤‡çš„æ—¶é—´èŒƒå›´å†…ä¸ä¼šè‡ªåŠ¨æ°§åŒ–。oxyHb å’Œ HbCO 都ç»åŽ†è‡ªæ°§åŒ–,æ®æŽ¨æµ‹ IsdB åŠ é€Ÿäº†è¿™ä¸€è¿‡ç¨‹ä»¥è§£é‡Šè¡€çº¢ç´ è½¬ç§»çš„æ•ˆçŽ‡ã€‚æˆ‘ä»¬é€šè¿‡å¸æ”¶å…‰è°±çš„åå·ç§¯æµ‹é‡äº†åœ¨å˜åœ¨å’Œä¸å˜åœ¨ IsdB 的情况下,在 37°C å’Œ pH 7.4 下的氧化 Hb 分数(图 1 B - F)。æ£å¦‚é¢„æœŸçš„é‚£æ ·ï¼ŒHbCO 的自氧化速率明显低于 oxyHb。在 IsdB çš„å˜åœ¨ä¸‹ï¼Œè‡ªæ°§åŒ–过程显ç€åŠ 速,导致 oxyHb 在ä¸åˆ° 4 å°æ—¶å†…完全氧化。åŒæ ·ï¼ŒHbCO å½¢å¼æ›´ç¨³å®šï¼Œ5 å°æ—¶åŽä¸Ž IsdB å¤åˆçš„氧化 Hb 的比例仅为 0.13。这一å‘现表明 IsdB:HbCO 足够稳定,å¯ä»¥é˜²æ¢æ ·å“制备过程ä¸çš„è¡€çº¢ç´ è½¬ç§»ï¼Œä»Žè€Œå…许æ•èŽ·åˆå§‹çš„预æå–å¤åˆç‰©ã€‚æˆ‘ä»¬é€šè¿‡åœ¨ç±»ä¼¼äºŽç½‘æ ¼åˆ¶å¤‡è¿‡ç¨‹çš„æ¡ä»¶ä¸‹é€šè¿‡å¸æ”¶å…‰è°±ç›‘测转移å应进一æ¥è¯å®žäº†è¡€çº¢ç´ 没有从 HbCO 转移到 IsdB(图 1 Gå’ŒH)。事实上,IsdB å’Œ Hb 之间æºå¸¦æ°§åŒ–或还原连接形å¼è¡€çº¢ç´ çš„å¤åˆç‰©å‘ˆçŽ°å‡ºä¸Žè¡€çº¢ç´ 所ç»åŽ†çš„环境和é“氧化æ€ç›¸å…³çš„独特å¸æ”¶å³°ã€‚Soret å³°ä»£è¡¨è¡€çº¢ç´ çŠ¶æ€çš„主è¦ç‰¹å¾ï¼ŒIsdB å’Œ meHb 之间å¤åˆç‰©çš„å½¢æˆä¸Žè¾…å› å快速转移到血细胞有关,通过 406 å’Œ 380 nm 处的å¸æ”¶å˜åŒ–æ¥è¯†åˆ« 。相å,在 IsdB:HbCO å¤åˆç‰©å½¢æˆåŽ Soret å³°ä¸å—å½±å“ï¼Œè¡¨æ˜Žè¿˜åŽŸçš„è¡€çº¢ç´ ä¸Ž Hb 稳定结åˆï¼ˆå›¾ 1G-I)。对于低温 EM 分æžï¼Œæˆ‘们使用 1:2 IsdB:HbCO化å¦è®¡é‡æ¯”制备æå–å‰å¤åˆç‰©çš„ç½‘æ ¼ï¼Œè€Œæˆ‘ä»¬ä½¿ç”¨ 1:1 IsdB:metHb 化å¦è®¡é‡æ¯”制备最终å¤åˆç‰©ï¼Œè¡€çº¢ç´ 转移到 IsdB。
IsdB å¤åˆç‰©ä¸Ž HbCOï¼šè¡€çº¢ç´ æå–æ¥éª¤çš„快照。
两ç§ä¸»è¦æˆåˆ†çŠ¶æ€çš„三维 (3D) é‡å»ºï¼ˆå›¾ 2å’ŒSI 附录,表 S1)分别以 2.9 å’Œ 3.6 Ã… 的分辨率获得,由傅里å¶å•å…ƒç›¸å…³æ€§ (FSC)= 0.143 æ ‡å‡†ç¡®å®šï¼ˆå›¾ 2 )。主è¦çŠ¶æ€ï¼ˆIsdB:HbCO,超过 70% 的颗粒;蛋白质数æ®åº“ [PDB] ID 7PCH)是包å«ä¸¤ä¸ª IsdB 分åçš„å¤åˆç‰©ï¼Œè¯¥åˆ†åç»“åˆ Hb å››èšä½“çš„ β-Hb 亚基(图 3)。人å£è¾ƒå°‘çš„çŠ¶æ€ (IsdB:HbCO*, PDB ID 7PCQ) 对应于与 Hb å››èšä½“çš„ β-Hb 亚基结åˆçš„一个 IsdB 分å(图 4)。
图 2。
IsdB:HbCO å’Œ IsdB:HbCO* å¤åˆç‰©çš„å•ç²’å分æžã€‚顶部显示了用于生æˆåˆå§‹å‚考图和细化图的代表性显微照片和选定的 2D 类平å‡å€¼ï¼ˆå³æµç¨‹å›¾ï¼‰ã€‚å·¦ä¸æ˜¾ç¤ºäº† IsdB:HbCO (1:2) å’Œ IsdB:HbCO* (1:1) å¤åˆç‰©åœ¨ä¸¤ä¸ªæ–¹å‘上的局部分辨率低温电ç£å¯†åº¦å›¾ã€‚左下角显示了具有ä¸åŒæº¶å‰‚掩模的两个模型的傅里å¶å£³ç›¸å…³æ€§ä»¥åŠæœ€ä½³é‡å»ºçš„估计分辨率。
图 3。
IsdB:æ¥è‡ªå†·å†»ç”µé•œçš„ HbCO å¤æ‚结构。(一)IsdB:HbCOå¤åˆç‰©çš„示æ„图。(乙)2.9_低温电ç£å›¾å’Œæ”¹è¿›æ¨¡åž‹çš„顶视图和底视图。(C,左)IsdB:HbCOå¤åˆç‰©çš„ä¸å¯¹ç§°å•å…ƒï¼ŒåŒ…å«ä¸€ä¸ªIsdB和一个αβ-Hb二èšä½“ã€‚äºŒçº§ç»“æž„å…ƒç´ è¢«æ ‡è®°ï¼Œå¾ªçŽ¯ 2 被çªå‡ºæ˜¾ç¤ºã€‚( C ,å³) IsdB:HbCO 的主è¦ç›¸äº’作用区域的放大视图,如左图所示:区域 1,Hb å’Œ IsdB N1之间的分å接触,预计会促进å¤åˆç‰©çš„å½¢æˆï¼›åŒºåŸŸ 2,IsdB Lå’Œ IsdB N2的触点带 F 螺旋;3 区和 4 区,IsdB N2与 Hb çš„è¡€çº¢ç´ ç»“åˆå£è¢‹ä¹‹é—´çš„相互作用网络。
图 4。
IsdB:HbCO* æ¥è‡ªå†·å†»ç”µé•œçš„å¤æ‚结构。(一)IsdB:HbCO*å¤åˆç‰©çš„示æ„图。(乙)3.6_低温电ç£å›¾å’Œæ”¹è¿›æ¨¡åž‹çš„顶视图和底视图。( C ) IsdB:HbCO(é’色)和 IsdB:HbCO*(紫色)å¤åˆç‰©çš„ β-Hb é“¾ä¸Šçš„è¡€çº¢ç´ ç»“åˆå£è¢‹ã€‚关键残基显示为棒,IsdB æ®‹åŸºå’Œè¡€çº¢ç´ ä¹‹é—´çš„æžæ€§æŽ¥è§¦ç”¨è™šçº¿è¡¨ç¤ºã€‚( D ) IsdB:HbCO(é’色)和 IsdB:HbCO*(紫色)å¤åˆç‰©ä¸åˆ†ç¦»çš„ α 1 β 1å’Œ α 2 β 2 Hb 二èšä½“的排列。( E ) IsdB:HbCO å¤åˆç‰©ï¼ˆé’色)和 IsdB:HbCO* å¤åˆç‰©ï¼ˆç´«è‰²ï¼‰ä¸ Hb å››èšä½“çš„å åŠ ã€‚
对于野生型金黄色葡è„çƒèŒè¡€ç»†èƒžå’Œäººç±» Hb之间的å¤åˆç‰©ï¼Œ1:2 IsdB:HbCO 模型具有迄今为æ¢èŽ·å¾—的最高分辨率。IsdB 以其特有的哑铃结构折å ,将 IsdB N1结构域置于 Hb çš„ A å’Œ E 螺旋æ—边,将æå–è¡€çº¢ç´ çš„ IsdB N2ç»“æž„åŸŸç½®äºŽè¡€çº¢ç´ ç»“åˆå£è¢‹çš„å…¥å£å¤„(图 3 Aå’ŒB)。尽管有这ç§å®‰æŽ’ï¼Œè¡€çº¢ç´ ä»ç„¶ä¸Ž Hb 亚基结åˆã€‚IsdB N2也接近相åçš„ αβ-Hb 二èšä½“çš„ α-Hb 链,形æˆé¢ç§¯ä¸º 106 Ã… 2çš„å°ç•Œé¢ã€‚β-Hb 链和血细胞之间的主è¦ç•Œé¢å°ºå¯¸ä¸º 1,200 Ã… 2. IsdB 还与暴露在 β-Hb 亚基 (62 Ã… 2 ) å¤„çš„è¡€çº¢ç´ ä¿®å¤åŸºå›¢ç›¸äº’作用。值得注æ„的是,冷冻电镜图的分辨率å…许手动放置水分å,其ä¸ä¸€äº›ä»‹å¯¼è›‹ç™½è´¨-蛋白质接触(图 3 C)。
对å¤åˆç‰©çš„详细分æžæ示了 IsdB å’Œ β-Hb 链之间的四个相互作用çƒç‚¹ï¼Œå¦‚图3C所示,并在SI 附录表 S2 å’Œ S3ä¸è¿›è¡Œäº†æ€»ç»“。确定的一些关键æžæ€§ç›¸äº’作用与相关 IsdH å—体ä¸æ‰€è§çš„相似,并且与 metHb 和缺少 NEAT2 结构域的 IsdB 蛋白水解片段之间的å¤åˆç‰©çš„ 3.6 Ã… 分辨率结构一致。一个交互网络(区域 1,图 3 C) 包å«å±žäºŽ A å’Œ H 螺旋和 EF 环的 Hb 残基,它们直接或通过桥接水与 IsdB 上的残基 Phe164-Ala168(环 2)ã€Gln190ã€Phe194ã€Phe242 å’Œ Asn243 相互作用。值得注æ„的是,环 2 åŒ…å« Hb 结åˆåŸºåº 并折å æˆç¨³å®šçš„ α-螺旋,这在 Hb 与分离的 IsdB N1å’Œ IsdH N1结构域的å¤åˆç‰©ä¸ä¹Ÿè§‚察到。环2结åˆåŽçš„折å å¯èƒ½ä¸Žè„¯æ°¨é…°é¡ºå¼/åå¼æœ‰å…³å¼‚构化(è§ä¸‹æ–‡ï¼‰å¹¶ä»£è¡¨ç¨³å®šå¤åˆç‰©å½¢æˆçš„驱动力。一旦折å ,螺旋æ’å…¥ç–水凹槽ä¸ï¼Œè¯¥å‡¹æ§½ç”±æ®‹åŸº Val11 (A8)ã€Trp15 (A12) å’Œ Leu75 (E19) 排列,ä½äºŽ Hb 的螺旋 A å’Œ E 之间。第二个区域(区域 2,图 3C)对应于 IsdB Lå’Œ IsdB N2与 Hb çš„ F 螺旋的相互作用。IsdB L与 F 螺旋建立了直接或水介导的æžæ€§æŽ¥è§¦ç½‘ç»œï¼Œæ¶‰åŠ Hb 上的 Thr87 (F3) å’Œ Glu90 (F6) ä»¥åŠ IsdB 上的 Tyr293 å’Œ Lys297(SI 附录,表 S2)。这些接触å¯èƒ½å¯¼è‡´ F èžºæ—‹å¤±çœŸï¼Œè¿™æ˜¯è¡€çº¢ç´ æå–的关键æ¥éª¤ï¼Œæ£å¦‚观察到å¤ç«‹çš„ IsdB 所è¯æ˜Žçš„é‚£æ ·N1å’Œ IsdB N2结构域åŒæ—¶ä¸Ž Hb 结åˆä¸é€‚åˆæå–è¡€çº¢ç´ ï¼Œä½† IsdB:HbCO å¤åˆç‰©ä¸ β-Hb 亚基ä¸çš„ F 螺旋相对于天然 HbCO 似乎没有改å˜ã€‚Andersen å’ŒåŒäº‹æœ€è¿‘的工作报告了 IsdH 和结åˆç 蛋白结åˆçš„ Hb 之间的å¤åˆç‰©çš„结构。氧化的二èšä½“å½¢å¼çš„ Hb 与 α-å’Œ β-亚基上的两个 IsdH 分å结åˆï¼Œä½†è§¦ç 蛋白的å˜åœ¨é˜»æ¢äº†è¡€çº¢ç´ 的转移。有趣的是,Hb çš„ α-å’Œ β-亚基与 IsdH 的相互作用并ä¸ç‰ä»·ï¼Œè€Œ Glu90 (F6)-Tyr495(相当于 IsdB 上的 Tyr293,属于 IsdB L) 氢键仅å˜åœ¨äºŽ β-亚基上。值得注æ„的是,在我们的结构ä¸è§‚察到的 IsdB L与 Hb 的相互作用å‡æœªåœ¨ IsdB:Hb å¤åˆç‰©ä¸æŠ¥å‘Šï¼Œå…¶ä¸ IsdB 与 α-亚基 结åˆï¼Œå¯èƒ½æ˜¯å› 为 F 螺旋的部分展开阻ç¢äº†æ®‹åŸºçš„æ£ç¡®å®šä½ã€‚å› æ¤ï¼ŒIsdB L在驱动 IsdB 与 β-亚基结åˆçš„选择性方é¢çš„任何å‚与都需è¦è¿›ä¸€æ¥ç ”究。β7-β8 转角上的 Asp439 属于 IsdB N2结构域,与 His97 (FG4) 相互作用(è§ä¸‹æ–‡ï¼Œå›¾ 3C )。
第三和第四接触区域(区域 3 å’Œ 4,图 3C )包括由 IsdB N2域介导的相互作用。在区域 3 内,血细胞与 β-Hb 链ä¸è¡€çº¢ç´ 结åˆå£è¢‹çš„å…¥å£ç›¸äº’作用。é‡è¦çš„是,我们的结构分æžä¸éœ€è¦ç¨³å®šçªå˜ï¼Œå¹¶æä¾›äº†è¡€ç»†èƒžä¸Žè¡€çº¢ç´ åŠå…¶åœ¨é‡Žç”Ÿåž‹è›‹ç™½è´¨ä¸çš„结åˆå£è¢‹çš„预æå–相互作用的详细信æ¯ã€‚与 IsdB 相互作用的 Hb 残基ä½äºŽ E 螺旋和螺旋内 CD 环上,而在 IsdB ä¸ï¼Œæ®‹åŸºä¸»è¦ä½äºŽ β7-β8 转角和 β8 链上。在这里,Tyr440 å’Œ Tyr444 直接接触相åŒçš„ä¸™é…¸è¡€çº¢ç´ ï¼Œè€Œ β7-β8 转角上的 Asp439 与 His97 (FG4) 相互作用。这些残留物与 3 10-螺旋(残基362 MMDTF 366)和 β7 链已显示形æˆæ‰‹æ‰£å¤åˆç‰©ï¼Œæœ‰åŠ©äºŽ Isd 系统的其他蛋白质ä¸çš„è¡€çº¢ç´ è½¬ç§»ã€‚é‡è¦çš„是,区域 3 æ˜¾ç¤ºæœ‰åˆ©äºŽè¡€çº¢ç´ æå–的范德åŽç›¸äº’ä½œç”¨ï¼Œå› ä¸º IsdB 残基 Ile438 å’Œ Tyr440 与 β-Hb 链ä¸çš„ Phe41 (C7)ã€Leu91 (F7) å’Œ Leu96 (FG3) æŽ¥è§¦ï¼Œå®ƒä»¬æ˜¯è¡€çº¢ç´ çš„ä¸€éƒ¨åˆ†å£è¢‹ã€‚类似的çƒç‚¹å·²è¢«è¯æ˜Žåœ¨ IsdH ä¸å¿…ä¸å¯å°‘,并且该水平的çªå˜å¯¼è‡´è¡€çº¢ç´ è½¬ç§»çš„æ¿€æ´»èƒ½åž’æ›´é«˜ï¼Œè¡€çº¢ç´ æå–率更低。在图 3 Cä¸ï¼Œç”± 3 10介导的相互作用的特写-螺旋和跨越 IsdB N2上残基 354 至 361 的环区域显示(区域 4)。该çƒç‚¹ä¸Ž β-Hb 链的 CD 环和 E 螺旋上的关键残基结åˆï¼Œè¿™äº›æ®‹åŸºä¸»è¦å‚ä¸Žè¡€çº¢ç´ ç¨³å®šåŒ–ã€‚äº‹å®žä¸Šï¼ŒCD 环是远端组氨酸稳定所必需的,Lys59 (E3)ã€Lys65 (E9) å’Œ Lys66 (E10) å½¢æˆç¨³å®šè¡€çº¢ç´ 基团的é™ç”µç›¸äº’作用。总体而言,这ç§ç»“æž„æ述了一个å¤æ‚的情况,其ä¸åœ¨ä»Ž Hb ä¸åŽ»é™¤è¡€çº¢ç´ 之å‰å·²ç»å»ºç«‹äº†ä¸€äº›å…³é”®çš„相互作用。Tyr440 å’Œ Tyr444 直接结åˆè¾…å› å丙酸ç›ï¼ŒIsdB L与 F 螺旋形æˆå¤šé‡æŽ¥è§¦ã€‚在å…è´¹çš„å…¨æ¯ IsdB N2ä¸Tyr440 直接åè°ƒè¡€çº¢ç´ é“å’Œ Tyr444 氢键 Tyr440,å¯èƒ½ç¨³å®šå…¶ä½ç½®ã€‚Tyr440 å’Œ Tyr444 在å‚与æå–过程ä¸çš„作用在很大程度上得到了支æŒï¼Œå› 为它们在 Isd 系统的所有 NEAT 结构域ä¸çš„ä¿å®ˆæ€§ä»¥åŠ Y440A å’Œ Y444A çªå˜ä½“çš„è¡€çº¢ç´ æå–ä¸è¶³ã€‚
值得注æ„的是,与四个辅基结åˆçš„ CO 分åä¸å˜åœ¨å¯†åº¦ï¼Œä½†è¡€çº¢ç´ ä¿ç•™äº†é€šå¸¸åœ¨é…体å æ®è½´å‘ä½ç½®æ—¶å‘现的平é¢æž„型(SI 附录,图 S2)。与 IsdB æ··åˆçš„ HbCO çš„å¯è§å¸æ”¶å…‰è°±åœ¨ç”¨äºŽæ ·å“制备的æ¡ä»¶ä¸‹è‡³å°‘稳定 1 å°æ—¶ï¼Œè¿™è¡¨æ˜Žåœ¨æº¶æ¶²ä¸ä¸Žè¡€ç»†èƒžå½¢æˆå¤åˆç‰©ä¸ä¼šå¯¼è‡´é…体æŸå¤±ï¼ˆå›¾ 1 H)。与 HbCO æ™¶ä½“ç»“æž„ç›¸æ¯”ï¼Œè¿œç«¯ç»„æ°¨é…¸å·²å‘ IsdB:HbCO å¤åˆç‰©ä¸è¡€çº¢ç´ 结åˆè¢‹çš„内部移动,以å æ®ä¸€äº›åŽŸæœ¬å¯ä»¥å®¹çº³ CO 分å的空间(SI 附录,图 S2 B)。明显的 CO æŸå¤±å¯èƒ½æ˜¯ç”±äºŽé…ä½“çš„ç´Šä¹±æˆ–è¡€çº¢ç´ çš„æ°§åŒ–æˆ–éžå¼¹æ€§æ•£å°„电å引å‘的光解。释放的 CO å¯èƒ½ä¼šåœ¨é™„近的内部结åˆå£è¢‹ä¸ç¦»åŸŸï¼Œå¹¶ä¸”在 2.9 Ã… åˆ†è¾¨çŽ‡ä¸‹å°†æ— æ³•è§£æžã€‚在低温下,Hb 构象很å¯èƒ½ä¿æŒä¸å˜ã€‚
IsdB:HbCOå¤åˆå¯†åº¦å›¾çš„近原å分辨率使我们能够清楚地识别顺å¼æž„åž‹ä¸çš„ Lys172-Pro173 å’Œ His369-Pro370 肽键。åªæœ‰ 5% çš„ X-Pro 肽键处于这ç§æž„型,但肽基-脯氨酰顺/å异构化å¯ä»¥ä½œä¸ºè›‹ç™½è´¨-蛋白质相互作用ä¸çš„调节分å开关。His369 å’Œ Pro370 ä½äºŽ 3 10螺旋附近,形æˆä¸Žè¡€çº¢ç´ 转移有关的手扣å¤åˆä½“。在 IsdB ä¸ï¼Œ3 10 -螺旋由残基 362 至 366 å½¢æˆï¼ŒHis369 直接接触 Asp364 å’Œ Val367。这个 X-Pro顺å¼è‚½é”®é…ç½®åœ¨è´Ÿè´£è¡€çº¢ç´ ç»“åˆå’Œè½¬ç§»çš„ Isd 系统的所有 NEAT 域(PDB ID 2E7Dã€2ITEã€2ITFã€2O6Pã€3VUAã€4XS0ã€6TB2)(10ã€20ã€21ã€35ã€36 )ä¸éƒ½ä¿æŒä¸å˜ï¼Œè€Œä¸Žå®ƒä»¬æ— å…³è¡€çº¢ç´ ç»“åˆçŠ¶æ€ï¼ˆapo 或 holoï¼‰ï¼›å› æ¤ï¼Œæˆ‘们得出结论,该键的异构化与å¤åˆç‰©çš„å½¢æˆæ— 关。å¦ä¸€æ–¹é¢ï¼ŒLys172 与ä½äºŽ Hb 结åˆåŸºåº ( 3 ) ä¸çš„残基 Tyr167 å’Œ Ser170 建立æžæ€§æŽ¥è§¦ï¼Œå½“与 Hb 结åˆæ—¶æŠ˜å æˆ Î±-螺旋。值得注æ„的是,在游离 IsdB N1 (PDB ID 2MOQ)的溶液结构ä¸ï¼ŒLys172-Pro173 键处于åå¼æž„型,并且 Hb 结åˆåŸºåºæ˜¯éžç»“构化的(SI 附录,图 S3 A),表明该肽键的顺å¼/åå¼å¼‚构化å¯èƒ½ä»£è¡¨ç”Ÿäº§æ€§ç»“åˆçš„分å开关,并在结åˆæ—¶è¾…助环 2 折å 。使用 P173A å˜ä½“ (IsdB P173A ) 评估 Pro173 在å¤åˆç‰©å½¢æˆå’Œè¡€çº¢ç´ æå–ä¸çš„作用。IsdB P173A对 Hb的解离常数至少比野生型 IsdB 通过酶è”å…ç–«å¸é™„试验 (ELISA) 测é‡çš„解离常数高一个数é‡çº§ï¼ˆSI 附录,图 S3 B),å•ä½ä¸ºçº³æ‘©å°”范围,并表明 Pro173 的异构化顺å¼æž„型显ç€æœ‰åŠ©äºŽç»“åˆäº²å’ŒåŠ›ã€‚在我们测定的实验æ¡ä»¶ä¸‹ï¼ˆ SI 附录,图 S3 C ),结åˆäº²å’ŒåŠ›çš„è¿™ç§é™ä½Žä¸ä¼šå¦¨ç¢ä»Ž Hb ä¸æå–è¡€çº¢ç´ ï¼Œè¿™éœ€è¦é«˜è›‹ç™½è´¨æµ“度(低微摩尔范围)æ‰èƒ½ä»Žè¡€çº¢ç´ ä¸èŽ·å¾—å¯æµ‹é‡çš„å¸å…‰åº¦ä¿¡å·ã€‚高蛋白质浓度å¯èƒ½ä¼šç¨³å®š Hb å’Œ IsdB P173A之间较弱的å¤åˆç‰©ï¼Œå¹¶å…è®¸è¡€çº¢ç´ è½¬ç§»ã€‚ç„¶è€Œï¼Œè™½ç„¶ IsdB 与 metHb çš„å¤åˆç‰©åœ¨è¡€çº¢ç´ æå–åŽä¿æŒç¨³å®šï¼Œå¹¶ä¸”在 SEC-MALS 色谱图ä¸çœ‹ä¸åˆ°æ¸¸ç¦» Hb(图1A),但 Pro > Ala å–代使å¤åˆç‰©ä¸ç¨³å®šå¹¶æœ‰åˆ©äºŽå…¶åœ¨è¡€çº¢ç´ æå–åŽè§£ç¦»ï¼ˆSI 附录,图 S3 D)。åäºŒçƒ·åŸºç¡«é…¸é’ èšä¸™çƒ¯é…°èƒºå‡èƒ¶ç”µæ³³ (SDS-PAGE) 分æžæ´—脱峰è¯å®žå®ƒä»¬å¯¹åº”于游离 IsdB 和游离 Hb( SI 附录,图 S3 E)。
对于人å£è¾ƒå°‘çš„çŠ¶æ€ IsdB:HbCO*(图 4),血细胞和 β-Hb 链之间的界é¢é¢ç§¯ä¸Ž IsdB:HbCO 状æ€ï¼ˆ1,200 å’Œ 1,209 Ã… 2)相当,并且大部分接触是ä¿å®ˆçš„. 然而,ä¸å˜åœ¨ IsdB-Tyr440 å’Œè¡€çº¢ç´ ä¹‹é—´çš„ç›¸äº’ä½œç”¨ï¼Œè¿™å¯èƒ½åœ¨ä»Ž Hb ä¸æå–è¾…åŠ©å› åä¸èµ·å…³é”®ä½œç”¨ï¼ˆå›¾ 4 C)。在 IsdB ä¸è§‚å¯Ÿåˆ°å‡ ä¸ªå¾ªçŽ¯åŒºåŸŸçº§åˆ«çš„å°å¹…调整;然而,它们ä¸å‚与与 Hb 的相互作用。相比之下,观察到两ç§å¤åˆç‰©ä¸ Hb 的结构å˜åœ¨è¾ƒå¤§å·®å¼‚ï¼Œä¸¤æ¡ Î±-Hb 链的 C 末端环有显ç€çš„结构é‡æŽ’。æ¤å¤–,å³ä½¿å•ç‹¬çš„ Hb 二èšä½“是高度å¯å åŠ çš„ï¼Œrmsd 为 0.162 å’Œ 0.219 Å(图 4 D),它们的相对ä½ç½®åœ¨ä¸¤ä¸ªå¤åˆç‰©ä¸ä¹Ÿæœ‰æ‰€ä¸åŒï¼Œä»Žè€Œå¯¼è‡´äº†ä¸åŒçš„四元组织(图 4 E)。这ç§äººå£è¾ƒå°‘的物ç§å¯èƒ½ä»£è¡¨è†œé”šå®š IsdB 的第一个或主è¦ç»“åˆäº‹ä»¶ï¼Œå¯èƒ½åœ¨å½¢æˆå¤åˆç‰©çš„途ä¸ï¼Œåœ¨æ¤ç§°ä¸º IsdB:HbCO。
早期对与血细胞å¤åˆçš„ Hb çš„ç ”ç©¶è¡¨æ˜Žï¼Œå››å…ƒæŽ’åˆ—æ›´æŽ¥è¿‘äºŽ T 状æ€ï¼Œä½†åœ¨è¿™ä¸¤ç§æƒ…况下,Hb 在结晶过程ä¸éƒ½å·²æ°§åŒ–,这å¯èƒ½å½±å“了四元组织。我们比较了在低温 EM 分æžä¸èŽ·å¾—的两个é…åˆç‰©ä¸ HbCO 的四级结构与 T æ€ Hb (PDB ID 2DN2)ã€ä¸€äº›å‚考é…ä½“å½¢å¼ (PDB IDs 2DN1 [Hb R-state]ã€1BBB [Hb R2-state] å’Œ 1YZI [Hb R3-state])ï¼Œä»¥åŠ Hb 与 IsdH N2N3 (PDB ID 4XSO) 或 IsdB (PDB ID 5VMM) 结åˆã€‚我们在 α 1 β上利用了 BGH 框架(αβ 二èšä½“ä¸çš„一个ä¸å˜ç»“构区域)1二èšä½“手动å åŠ Hb å››èšä½“,并使用 DynDom 软件计算二èšä½“间的平移和旋转。在表 1ä¸ï¼ŒæŠ¥å‘Šäº† α 1 β 1å’Œ α 2 β 2二èšä½“çš„ rmsd ,并评估了 α 1 β 1二èšä½“相对于 α 2 β 2的旋转/平移二èšä½“。我们的分æžè¡¨æ˜Žï¼ŒHb å››èšä½“的四元结构肯定更类似于é…体 Hb,IsdB:HbCO å¤åˆç‰©ä¸Ž R 相比显示出更å°çš„ rmsd å’Œä¸é—´äºŒèšä½“旋转/平移,而 IsdB:HbCO* å¤åˆç‰©ä¸Žç›¸å¯¹äºŽ R2 状æ€ã€‚这一结果è¯å®žäº†æˆ‘们的冷冻电镜模型æ述了带有 Hb çš„ IsdB å¤åˆç‰©ï¼Œå…¶å››çº§æŽ’åˆ—ï¼Œåœ¨æ²¡æœ‰è¡€çº¢ç´ æ°§åŒ–å’Œ/或æå–的情况下,血细胞结åˆæ²¡æœ‰æ˜¾ç€æ”¹å˜ã€‚由于在我们的低温电ç£æ¡ä»¶ä¸‹ä¸çŸ¥é“å¤ç«‹ HbCO çš„å››çº§ç»“æž„ï¼Œå› æ¤æ²¡æœ‰è¿›ä¸€æ¥æŽ¨æµ‹åœ¨ IsdB:HbCO* å¤åˆç‰©ä¸è§‚察到的 R2 æ ·ç»“æž„æ˜¯å¦åº”被视为通往 IsdB 路径的ä¸é—´çŠ¶æ€:HbCO。
è¡¨æ ¼1。
IsdB:HbCO* (PDB ID 7PCQ) 或 IsdB:HbCO (PDB ID 7PCH) 与å‚考 Hb 结构之间的四元结构比较展开表[td]血红蛋白结构 | æ•°æ®åº“ ID | α 1 β 1 rmsd, Ã… | α 2 β 2 rmsd, Ã… | IsdB:HbCO* | IsdB:HbCO | IsdB:HbCO* | IsdB:HbCO | IsdH 绑定 | 4XS0 | 2.077 [ 1.284 ] | 1.841 [ 1.086 ] | 9.471 [ 9.407 ] | 7.893 [ 7.750 ] |  TçŠ¶æ€ | 2DN2 | 1.748 [ 1.080 ] | 1.485 [ 0.862 ] | 7.198 [ 7.099 ] | 5.628 [ 5.468 ] | IsdB ç•Œé™ | 5VMM | 1.811 [ 1.187 ] | 1.533 [ 0.950 ] | 3.766 [ 3.574 ] | 4.390 [ 4.258 ] |  RçŠ¶æ€ | 2DN1 | 1.579 [ 0.878 ] | 1.190 [ 0.619 ] | 3.108 [ 2.850 ] | 1.833 [ 1.524 ] |  R2 çŠ¶æ€ | 1BBB | 1.325 [ 0.737 ] | 1.696 [ 1.027 ] | 2.680 [ 2.246 ] | 4.292 [ 4.087 ] |  R3 çŠ¶æ€ | 1YZI | 1.961 [ 1.282 ] | 1.804 [ 1.107 ] | 5.078 [ 4.931 ] | 4.514 [ 4.281 ] |
| | 旋转,° | 翻译,Å | IsdH 绑定 | 4XS0 | 22.45 | 17.85 | 5.62 | 5.13 |  TçŠ¶æ€ | 2DN2 | 17.26 | 13.15 | 2.82 | 2.05 | IsdB ç•Œé™ | 5VMM | 9.30 | 12.33 | 0.64 | 0.80 |  RçŠ¶æ€ | 2DN1 | 6.69 | 3.45 | 1.29 | 0.74 |  R2 çŠ¶æ€ | 1BBB | 5.06 | 9.59 | 0.42 | 0.95 |  R3 çŠ¶æ€ | 1YZI | 14.33 | 13.05 | 1.27 | 1.26 |
所有原å对的 rmsd 值都是常规类型。C α原å对的rmsd 值以斜体显示。
IsdB:metHb å¤åˆç‰©ã€‚
IsdB:metHb å¤åˆç‰©çš„低温-EM 分æžäº§ç”Ÿäº†ä¼°è®¡ä¸º 5.8 Ã… 分辨率的图(SI 附录,图 S4)。虽然这ä¸å…许精确定ä½ä¾§é“¾ï¼Œä½†ç‰¹è®¾æ¨¡åž‹ä¸Žåœ°å›¾çš„对é½æ¸…楚地表明该å¤åˆç‰©æ˜¯ç”±ä¸¤ä¸ª IsdB 分åç»“åˆ Hb 二èšä½“å½¢æˆçš„(图 5),一ç§ä»¥å‰ä»Žæœªåœ¨ç»“构上观察到的低èšçŠ¶æ€ã€‚与 SEC-MALS 实验ä¸åŒï¼Œæ¤å¤„较高的蛋白质浓度有助于稳定 Hb 的二èšä½“å½¢å¼ï¼Œè€Œä¸æ˜¯å•ä½“å½¢å¼ã€‚åœ¨ç”¨äºŽæ ·å“制备的浓度下,MetHb 本身预计主è¦æ˜¯å››èšä½“,但是,当与 IsdB å¤åˆæ—¶ï¼ŒHb 二èšä½“çš„å˜åœ¨å¯èƒ½ä¼šæ示 IsdB 结åˆå¯¹ Hb 寡èšçŠ¶æ€çš„直接ä¸ç¨³å®šå½±å“ã€‚å› æ¤ï¼Œæ™¶ä½“状æ€ç»“æž„ç ”ç©¶æ‰€éœ€çš„é«˜è›‹ç™½è´¨æµ“åº¦å¯èƒ½é˜»ç¢äº†å¯¹è¿™ç§å¤åˆç‰©çš„鉴定,事实上,这ç§å¤åˆç‰©å¯èƒ½æ˜¯ç”Ÿç†ç›¸å…³çš„å¤åˆç‰©ï¼ˆé‡‘黄色葡è„çƒèŒï¼‰ä»…以细胞外 Hb 为食)。IsdB å’ŒmetHb 之间的相互作用预计会导致 IsdB è¡€çº¢ç´ æå–,这得到了å¸æ”¶å…‰è°±çš„支æŒï¼ˆå›¾ 1 G )(4ã€13ï¼‰ï¼›å› æ¤ï¼Œç”¨äºŽè§£é‡Šä½Žæ¸©ç”µç£å›¾çš„ç‰¹è®¾æ¨¡åž‹å‡†å¤‡å°†è¾…å› å绑定到 IsdB。Flex-EM çš„çµæ´»æ‹Ÿåˆæ”¹å–„了原å模型和体积密度的匹é…,并å…许我们秘密分é…è¡€çº¢ç´ ä½ç½®å¹¶æç¤ºä¸¤æ¡ Hb 链上 F 螺旋的结构é‡æŽ’(图 5 Cå’ŒD)。ad hoc 模型ä¸è¡€çº¢ç´ çš„ä½ç½®æœ€åˆæ˜¯ä»Ž PDB ID 3RTL 获得的,这是å¤ç«‹çš„ IsdB N2域 çš„è¡€çº¢ç´ ç»“åˆå½¢å¼çš„晶体结构,并且ç»è¿‡ç»†åŒ–çš„å¾®å°å˜åŒ–åŽå¾ˆå¥½åœ°æ‹Ÿåˆåœ°å›¾ï¼ˆå›¾. 5 C ). å› æ¤ï¼Œå†·å†»ç”µé•œå›¾æ述了在完æˆæå–过程åŽè¡€çº¢ç´ 与 IsdB 结åˆçš„å¤åˆä½“。IsdB åœ¨è¡€çº¢ç´ æå–åŽä»ä¸Ž Hb 结åˆï¼Œè§£ç¦»å¯èƒ½éœ€è¦ç¼“慢的结构é‡æŽ’,å¯èƒ½åŒ…括 Pro173顺å¼/åå¼å¼‚构化。
图 5。
IsdB:æ¥è‡ªä½Žæ¸©-EM çš„metHb å¤æ‚结构。(一)IsdB:metHbå¤åˆç‰©çš„示æ„图。(乙)通过 5.8 Ã… 低温电ç£å›¾ä¸çš„ Flex-EM 改进原å模型。(Cï¼‰è¡€çº¢ç´ åœ¨Î±-(顶部)或β-HB(底部)å¤åˆä½“低温电ç£å›¾ä¸çš„亚å•ä½ä¸çš„ä½ç½®ã€‚(D )IsdBä¸Î±-(顶部)或β-Hb(底部)亚å•ä½ä¸F螺旋的比较:metHbå¤åˆç‰©å’Œåˆ†ç¦»Hb结构ä¸çš„天然螺旋(PDB ID 3P5Q)(40)。在相对地图密度内通过低温电ç£æ³•ç»†åŒ–的结构的颜色与B类似,而原生结构为åŠé€æ˜Žç°è‰²ã€‚
IsdB 从其结åˆå£è¢‹ä¸æå–è¡€çº¢ç´ éœ€è¦ Hb çš„ F 螺旋部分展开,åŒæ—¶è¿‘端 His å’Œè¡€çº¢ç´ é“之间的é…ä½é”®æ–裂。特设模型与冷冻电镜图的åˆå§‹å¯¹é½æ示了 F 螺旋区域的巨大差异。柔性拟åˆåŽï¼Œæ¨¡åž‹æ˜¾ç¤ºÎ±-Hb链ä¸çš„F螺旋部分展开,而β-Hb链ä¸çš„F螺旋似乎完全展开(图5D )。该结果è¯å®žäº†æ—©æœŸçš„å‘现 (PDB ID 5VMM) è¡€çº¢ç´ è½¬ç§»ä¸Ž F 螺旋展开有关,并且å¦å¤–表明展开æŒç»å˜åœ¨äºŽæå–åŽå’Œ IsdB 解离的两个 Hb 亚基上。IsdB:metHb å¤åˆå¯†åº¦å›¾ä¸çš„局部分辨率评估表明,两ç§è¡€ç»†èƒžçš„ IsdB Lå’Œ IsdB N2域具有最低的定义,å¯èƒ½è¡¨æ˜Žæ€»ä½“çµæ´»æ€§æœ€é«˜ï¼ˆSI 附录,图 S4)。IsdB N2从 Hb ä¸æå–è¡€çº¢ç´ ï¼Œåœ¨æ¤è¿‡ç¨‹å®ŒæˆåŽï¼Œè¯¥ç»“构域å¯èƒ½ä¼šå¤±åŽ»å¯¹ Hb 的亲和力并开始解离。这一è¯æ®ä¸Žåˆ†å动力å¦æ¨¡æ‹Ÿéžå¸¸ä¸€è‡´ï¼Œä½†ä¹Ÿä¸Ž IsdB 之间å˜åœ¨ç‰¹å®šçš„铰链区N1å’Œ IsdB L域有利于å¤æ‚çš„å½¢æˆå’Œè¡€çº¢ç´ æå–,ä¿æŒ IsdB N1稳定并å…许 IsdB Lå’ŒIsdB N2域的移动。
讨论
IsdB 是能够通过两个 IsdB N1å’Œ IsdB N2域的åè°ƒè¿åŠ¨å‚¬åŒ–从 Hb ä¸æå–è¡€çº¢ç´ çš„å—体的一个显ç€ä¾‹å,尽管这两个域具有高度的结构和åºåˆ—åŒæºæ€§ï¼Œä½†å®ƒä»¬åœ¨è¡€çº¢ç´ 去除途径ä¸å‘挥ç€ä¸åŒçš„作用。我们在这里æè¿°çš„ 3D ç»“æž„ä»£è¡¨äº†è¡€çº¢ç´ æå–过程ä¸ä¸¤ä¸ªå…³é”®ç»“构状æ€çš„快照。难以æ‰æ‘¸çš„æå–å‰å¤åˆç‰© (IsdB:HbCOå¤åˆç‰©) å’Œè¡€çº¢ç´ è½¬ç§»åŽçš„æœ€ç»ˆçŠ¶æ€ (IsdB:metHb å¤åˆç‰©) 已被隔离,å…许å¯è§†åŒ–æœ‰æ•ˆè¡€çº¢ç´ æå–的准备相互作用以åŠæœ€ç»ˆå¿…é¡»æ‰“ç ´ä»¥äº§ç”ŸåŽç»è¡€çº¢ç´ 转移的相互作用å—体蛋白。在图 6æ²¿è¡€çº¢ç´ æå–途径的事件是使用æ¥è‡ªæ¤å’Œå·²å‘表作å“的结构数æ®å‘ˆçŽ°çš„。
图 6。
IsdB çš„ Hb 结åˆå’Œè¡€çº¢ç´ æå–。从 IsdB 结åˆåˆ° Hb å¹¶å¯¼è‡´è¡€çº¢ç´ æå–的事件的åˆç†åºåˆ—是基于这项工作和已å‘布的数æ®æž„建的。基于沉积的 3D ç»“æž„çš„è¡€çº¢ç´ ç»“åˆå£è¢‹å’Œ Hb çš„ E å’Œ F 螺旋的特写显示在å¡é€šä¸‹æ–¹ã€‚IsdB:HbCO å¤åˆç‰© (PDB ID 7PCH) 的低温 EM 结构被用作对é½æ‰€æœ‰å…¶ä»– PDB 模型的å‚考。æ¥éª¤ 1 到 7 的对é½åŸºäºŽ Hb,而æ¥éª¤ 8 ä¸çš„对é½åˆ™ä½¿ç”¨ IsdB。
IsdB å¯ä»¥é€æ¥æ–¹å¼ï¼ˆå›¾ 6 ,æ¥éª¤ 2 å’Œ 3)与四èšä½“连接的 Hb(图 6 ,æ¥éª¤ 1)结åˆï¼Œå¾—到最终å¤åˆç‰©ï¼Œå…¶ä¸ Hb ä¿ç•™å…¶å››çº§ç»“构,两个 IsdB 分å与 β-结åˆè¡€çº¢è›‹ç™½äºšåŸºã€‚一个 IsdB 分å与一个 Hb å››èšä½“结åˆçš„装é…体通过冷冻电镜分离出æ¥ï¼Œå¾ˆå¯èƒ½ä»£è¡¨å½¢æˆé¥±å’Œå¤åˆç‰©çš„途径上的ä¸é—´ä½“。组装过程ä¸çŸ¥é“是ååŒçš„,但由于 IsdB 在细胞表é¢ä¸Šçš„空间共定ä½ï¼Œå®ƒå¯èƒ½è¡¨çŽ°å‡ºèž¯åˆç‰©çš„ååŒä½œç”¨ã€‚公认的循环 Hb 模型是一ç§æ°§åŒ–的二èšä½“å½¢å¼ï¼Œå› 为预计细胞外 Hb 会被æžåº¦ç¨€é‡Šå¹¶æ˜“于氧化。然而,金黄色葡è„çƒèŒå¯èƒ½ä½¿ç”¨æº¶è¡€æ¯’ç´ åœ¨æ„ŸæŸ“éƒ¨ä½å±€éƒ¨ä»Žçº¢ç»†èƒžä¸é‡Šæ”¾ Hbã€‚å› æ¤ï¼Œæ¤å¤„用于æ•èŽ· IsdB å’Œ Hb 之间的åˆå§‹å¤åˆç‰©ï¼ˆå³ HbCO)的 Hb å½¢å¼å¯èƒ½æ¨¡æ‹Ÿäº† IsdB å¯ä»¥æ•èŽ·åˆšä»Žçº¢ç»†èƒžé‡Šæ”¾çš„å››èšä½“ oxyHb 并促进其自动氧化的生ç†æƒ…况(图 1 F)。
IsdB 与 α-Hb 或 β-Hb 结åˆçš„å好一直å˜åœ¨äº‰è®®ï¼Œè¿„今为æ¢å°šæœªèŽ·å¾—ç»“è®ºæ€§ç»“æžœï¼Œéƒ¨åˆ†åŽŸå› æ˜¯ç”¨äºŽæ•èŽ·ä¸é—´ä½“的方法总是会影å“结åˆçš„链å好。在 IsdB 与 Hb å¤åˆçš„唯一å¯ç”¨ç»“æž„ä¸ï¼Œå…¨é•¿ IsdB 链与 α-Hb 结åˆï¼›Î²-Hb 亚基与åªæœ‰ IsdB N1结构域的å¤åˆç‰©ç»“åˆï¼ŒÎ²-Hb çš„è¡€çº¢ç´ å£è¢‹æ˜¯ç©ºçš„。这一å‘现强烈暗示æå–事件首先å‘生在 β-Hb 亚基,然åŽæ˜¯ α-Hb 亚基接åˆã€‚我们的结构清楚地表明,第一个结åˆäº‹ä»¶å‘生在 β-Hb 亚基上,并且 α-Hb äºšåŸºä»…åœ¨äºŒèš Hb 内å¯ç”¨äºŽ IsdB 结åˆï¼ˆå›¾ 6,第 5 æ¥ï¼‰ã€‚è¿™ç§ç»“åˆå好的分åèµ·æºå¯èƒ½æ˜¯å…ƒç´ 的组åˆã€‚本工作ä¸é‰´å®šçš„ IsdB å’Œ β-Hb 之间相互作用的类型和数é‡ä¸Ž Bowden ç‰äººé‰´å®šçš„ IsdB å’Œ α-Hb 之间的相互作用并ä¸å®Œå…¨åŒ¹é…。(SI附录,图S5 Bå’ŒC)。在 α-Hb [å³ Lys8 (A5)-Glu190ã€Ser9 (A6)-Tyr165ã€Arg40 (C6)-Thr437ã€Glu43 (CD2)-Thr437 å’Œ Ser44 (CD3)-Thr365] ä¸ä¸¢å¤±äº†äº”ç§ç›¸äº’作用,这å¯èƒ½æ˜¯å¯¹ β-Hb 的选择性。事实上,Gell 和他的åŒäº‹æŠ¥å‘Šè¯´ï¼ŒÎ±-Hb 与 IsdH N1相互作用的关键残基的å•ä¸€æ›¿ä»£è¶³ä»¥å®Œå…¨æ¶ˆé™¤ç»“åˆï¼ˆ17)。æ¤å¤–,两个 IsdB 分å在 Hb 上与 α 链和 β 链结åˆåŽçš„排列完全ä¸åŒï¼ˆSI 附录,图 S5 A);与 α 链结åˆçš„ IsdB 分å产生广泛的接触,这å¯èƒ½åœ¨ç»“晶过程ä¸ç¨³å®šäº†å¤åˆç‰©ã€‚然而,这ç§æŽ’列所需的两个 IsdB 分å的空间接近度在体内å¯èƒ½ä¸å¤ªæœ‰åˆ©ï¼Œå› 为 IsdB 锚定在细胞å£ä¸Šã€‚IsdB å¯¹ç»“åˆ Î²-Hb 链的å好å¯èƒ½åˆ©ç”¨äº† β-Hb é‡Šæ”¾è¡€çº¢ç´ çš„è‡ªç„¶å€¾å‘ï¼Œå…¶é‡Šæ”¾è¡€çº¢ç´ çš„é€Ÿåº¦æ¯” α-Hb 快约 25 å€ï¼›äº‹å®žä¸Šï¼Œä¸€äº›ä½œè€…推测 β äºšåŸºçš„è¡€çº¢ç´ é‡Šæ”¾å¯èƒ½åœ¨æ²¡æœ‰ F 螺旋展开的情况下å‘ç”Ÿã€‚ç„¶è€Œï¼Œæˆ‘ä»¬çš„ç»“æžœä»¥åŠ Murphy å’ŒåŒäº‹çš„结果表明 F 螺旋也在 β 链上展开(图 6,æ¥éª¤ 6)并在最终å¤åˆç‰©ä¸ä¿æŒå±•å¼€ï¼ˆå›¾ 6,æ¥éª¤ 7)。已知 β-亚基ä¸çš„ F 螺旋比 α-亚基的相应区域更çµæ´»ï¼Œå¹¶ä¸”å¯èƒ½æœ‰åˆ©äºŽæ¾å¼€ä¸Žä½äºŽåŒä¸€èžºæ—‹ä¸Šçš„近端组氨酸的é…ä½é”®ã€‚一旦 IsdB å’Œ β-Hb 链之间形æˆç´§å¯†å¤åˆç‰©ï¼Œå°±ä¼šå‘生结构é‡æŽ’,å¯èƒ½åŒ…括四èšä½“ç ´å,从而使血细胞能够éšåŽä¸Ž α-Hb 链结åˆï¼ˆå›¾ 6),æ¥éª¤ 4 å’Œ 5)。IsdB 与四èšä½“çš„ β 链结åˆå¯ä»¥å¼•å‘四元组织的ä¸ç¨³å®šå’Œè¡€çº¢ç´ è…”é‡æŽ’,从而å‘生辅基转移。众所周知,Hb å››èšä½“ç ´åä¼šå¢žåŠ åŠé“è‡ªæ°§åŒ–å’Œè¾…å› å释放速率,相åï¼Œè¡€çº¢ç´ æ°§åŒ–ä¼šä¿ƒè¿›å››èšä½“åˆ†è§£ã€‚å› æ¤ï¼Œè¿™ä¸¤ä¸ªè¿‡ç¨‹äº¤ç»‡åœ¨ä¸€èµ·ï¼Œä½†æˆ‘们的结果表明,与 β-亚基的特异性结åˆæ›´å¤šåœ°é€šè¿‡å¯¹è¡€çº¢ç´ 微环境的直接影å“而ä¸æ˜¯å¯¹å››èšä½“的稳定性的直接影å“æ¥å¼•å‘è¡€çº¢ç´ æå–。这一结果显然与早期模型相å,在早期模型ä¸ï¼ŒHb 二èšåŒ–是通过由 Hb å››èšä½“上的四个血细胞åŒæ—¶ç»“åˆå¼•èµ·çš„空间排斥引起的。
IsdB:HbCO å¤åˆç‰©çš„结构还æ示了Pro173 å’Œ Lys172 之间å˜åœ¨é¡ºå¼è‚½éª¨æž¶æž„è±¡ï¼Œä¸€æ—¦è¡€çº¢ç´ æå–完æˆï¼Œè¯¥æž„è±¡åœ¨è§¦å‘ Hb 结åˆå’Œ/或å¤åˆç‰©è§£ç¦»æ–¹é¢å…·æœ‰åŠŸèƒ½ç›¸å…³æ€§ã€‚在这ç§æž„象ä¸ï¼ŒLys172 与属于 Hb 结åˆåŸºåºçš„残基建立æžæ€§é”®ï¼Œé€šå¸¸è¡¨ç¤ºä¸ºçŽ¯ 2。我们观察到的是环 2 的折å 状æ€ä¸Ž Pro-Lys 键的构型之间的关è”。在æ¤å¤„呈现的结构ä¸ï¼ŒçŽ¯ 2 折å æˆ Î±-螺旋,键呈顺å¼æž„型。相å,在å¤ç«‹çš„ IsdB N1结构域 (PDB ID 2MOQ) ( 9 ) 的结构ä¸ï¼ŒçŽ¯ 2 是éžç»“构化的并且键是åå¼çš„é…置。确定是å¦é¦–å…ˆå‘生环 2 折å 或顺/å异构化需è¦è¿›ä¸€æ¥ç ”究。IsdB P173Aå˜ä½“åœ¨è¡€çº¢ç´ æå–åŽå¤åˆç‰©å½¢æˆå’Œè§£ç¦»éƒ½å—到æŸå®³ï¼Œè¿™ä¸€å‘现强烈暗示 Pro173 在å¤åˆç‰©å½¢æˆå’Œç¨³å®šæ€§åŠ¨åŠ›å¦ä¸çš„关键作用,并且å¯èƒ½éœ€è¦ä¿ƒè¿›æˆ–æŽ§åˆ¶è¡€çº¢ç´ è½¬ç§»çš„ä»¥ä¸‹æ¥éª¤åˆ°ä¸‹æ¸¸æŽ¥å—者。
这里报告的高分辨率结构å…许识别稳定预æå–å¤åˆç‰©çš„关键接触,其ä¸ä¸€äº›ä»¥å‰ä»ŽæœªæŠ¥é“过。未æ¥å¯èƒ½ä¼šåˆ©ç”¨è¿™äº›ä¿¡æ¯æ¥è¯†åˆ«èƒ½å¤Ÿå¹²æ‰° IsdB:Hb å¤åˆç‰©å½¢æˆçš„å°åˆ†å,从而切æ–金黄色葡è„çƒèŒæ‰€éœ€çš„é“供应在宿主内生å˜ã€‚æ¤å¤–,这里报é“çš„ IsdB:HbCO å¤åˆç‰©ä¹Ÿä¸ºä½¿ç”¨å•ç²’å方法在高分辨率下进一æ¥ç ”究é…体状æ€ä¸‹çš„血红蛋白结构æ供了机会。高分辨率,å…许欣èµäºŒçº§ç»“构细节,以åŠå†·å†»ç”µé•œæ供的确定混åˆæž„象结构的å¯èƒ½æ€§ï¼Œå¯èƒ½æ˜¯æœ€ç»ˆè§£å†³åœ¨ä¸ä¹…çš„å°†æ¥é•¿æœŸå˜åœ¨çš„关于三级和四级异质性争议的关键Hb 的状æ€ä»¥åŠé«˜äº²å’ŒåŠ›å’Œä½Žäº²å’ŒåŠ›æž„象的结构起æºã€‚
æ料和方法
详细的æ料和方法包å«åœ¨SI 附录ä¸ã€‚
å†·å†»ç”µé•œæ ‡æœ¬åˆ¶å¤‡ã€‚
IsdB 与 meHb 以 1:1 的化å¦è®¡é‡æ¯”æ··åˆï¼ˆä¾‹å¦‚,æ¯ä¸ª Hb 链一个 IsdB 分å)以达到 2 g/L 的最终浓度,而与 HbCO çš„å¤åˆç‰©ä»¥ 8 g/L 的最终浓度制备通过以 1:2 的化å¦è®¡é‡æ¯”将血细胞与 Hb æ··åˆã€‚æ ¹æ® SEC-MALS 分æžç»“果选择两ç§å¤åˆç‰©ä¸ IsdB å’Œ Hb çš„ä¸åŒæ¯”例。
æ ·å“在 10 mM Hepes 缓冲液 (pH 7.3) ä¸åˆ¶å¤‡ï¼Œä»¥é™ä½Žç”¨äºŽä½Žæ¸© EM æ•°æ®æ”¶é›†çš„背景电å密度,以åŠä¸¤æ€§ç¦»å去污剂 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate ( CHAPSO)在急速冷冻å‰ç«‹å³åŠ 入,最终浓度为 8 mM,以克æœçŽ»ç’ƒå†°ä¸é¢—粒的优选å–å‘。将总共​​ 3 µL çš„å¤åˆæº¶æ¶²æ–½åŠ 到å‘光放电的 300 ç›® R1.2/1.3 UltrAuFoil ç½‘æ ¼ä¸Šï¼Œç„¶åŽå¸å¹² 3 秒,然åŽåœ¨æ¶²ä½“乙烷ä¸å¿«é€Ÿå†·å†»ã€‚为了å°è¿¹å’Œå†·å†»ç½‘æ ¼ï¼Œä½¿ç”¨äº† Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) è£…ç½®ï¼Œæ ·å“室ä¿æŒåœ¨ 4°C å’Œ 99% 的湿度。
冷冻电镜数æ®æ”¶é›†ã€‚
å¯¹äºŽé«˜åˆ†è¾¨çŽ‡ç ”ç©¶ï¼ŒIsdB:metHb å’Œ IsdB:HbCO å¤åˆç‰©å‡åœ¨ Titan Krios 低温电å显微镜(Thermo Fisher Scientific)ä¸ä»¥ 300 kV æˆåƒï¼ŒGatan K3 直接电åæŽ¢æµ‹å™¨åœ¨æ ¡å‡†æ”¾å¤§å€çŽ‡ä¸‹ä»¥è¶…分辨率模å¼å·¥ä½œÃ—130,000,åƒç´ 大å°ä¸º 0.326 Å。显微照片由 EPU 软件 (Thermo Fisher Scientific) 在电影模å¼ä¸‹è®°å½•ï¼Œå…¶ä¸æ¯å¼ 图åƒç”± 40 个å•ç‹¬çš„帧组æˆï¼Œæ›å…‰æ—¶é—´ä¸º 1.1 秒,剂é‡çŽ‡ä¸º 15.3 电å/秒/Ã… 2。IsdB:metHb å’Œ IsdB:HbCO å¤æ‚æ•°æ®é›†æ€»å…±äº§ç”Ÿ 3,050 å’Œ 2,852 ä¸ªç”µå½±å †æ ˆï¼Œæ•£ç„¦èŒƒå›´åˆ†åˆ«ä¸º -1.0/-3.1 å’Œ -0.8/-2.8 μm。
图åƒå¤„ç†ã€‚
使用 WARPåˆ†æž IsdB:HbCO å¤åˆç‰©ä»¥è¯†åˆ« 460,000 个粒å,这些粒å使用 cryoSPARC 处ç†ä»¥åˆ†ç±»äºŒç»´ (2D) å’Œ 3D ç±»åˆ«å¹¶é€šè¿‡æ–½åŠ C2 对称性æ¥ç»†åŒ–ç²’åå–å‘å‚数。2D 分类使我们能够区分 IsdB:HbCO å¤åˆç‰©çš„两ç§ä¸åŒçŠ¶æ€ï¼Œå‘ˆçŽ°å‡ºæˆåˆ†å¼‚质性。在由 225,000 个粒å定义的第一ç§çŠ¶æ€ä¸ï¼ŒHbCO å››èšä½“由两个血细胞分å (IsdB:HbCO) 结åˆï¼Œè€Œåœ¨ç¬¬äºŒç§çŠ¶æ€ï¼ˆ90,000 个粒å)ä¸ï¼Œåªæœ‰ä¸€ä¸ªè¡€ç»†èƒžä¸Ž HbCO å››èšä½“ (IsdB:HbCO*) 结åˆã€‚使用 Phenix 包的 auto_sharpen 工具对地图进行了修改以进行解释。
IsdB:metHb å¤åˆç‰©çš„å•ç²’å分æžä½¿ç”¨ RELION进行。使用在 RELION ä¸å®žçŽ°çš„ MOTIONCOR2 对所有显微照片进行è¿åŠ¨æ ¡æ£ï¼Œå¹¶ä½¿ç”¨ Kai Zhang çš„ GCTF ä¼°è®¡å¯¹æ¯”åº¦ä¼ é€’å‡½æ•°ã€‚ç²’å是使用 RELION ä¸çš„自动拾å–选项找到的,æå–了大约 300,000 个粒å,这些粒å通过多轮 2D å’Œ 3D 分类进行ç›é€‰ï¼Œä»¥æ‰¾åˆ°æœ€ä½³é›†åˆã€‚最åŽçš„细化是在 RELION ä¸çš„ CFTRefine å’Œè´å¶æ–¯æŠ›å…‰ä½œä¸šä¹‹åŽè¿è¡Œçš„,最终选择了大约 100,000 个粒å。
冷冻电镜数æ®å¤„ç†åˆ†åˆ«ä¸º IsdB:HbCOã€IsdB:HbCO* å’Œ IsdB:metHb å¤åˆç‰©äº§ç”Ÿ 2.9ã€3.6 å’Œ 5.8 Ã… 图。最终地图的这些分辨率是通过 FSC 曲线的 0.143 æ ‡å‡†ä¼°è®¡çš„ã€‚
建ç‘模型。
IsdB:HbCO å¤åˆç‰©çš„原å模型是通过在 Cootä¸æ‰‹åŠ¨è°ƒæ•´å’Œç»†åŒ–æ¥åˆ¶å¤‡çš„,这是一个使用两ç§ä¸åŒæ™¶ä½“结构制æˆçš„起始模型,æè¿° IsdB:Hb å¤åˆç‰© (PDB ID 5VMM)和天然 meHb (PDB ID 3P5Q)。该蛋白质å¤åˆç‰©çš„晶体结构是迄今为æ¢å‘表的唯一一ç§è›‹ç™½è´¨å¤åˆç‰©ï¼Œå…¶å‘ˆçŽ°ä¸Ž β-Hb 链结åˆçš„蛋白水解血团和与 α-Hb 链结åˆçš„天然 IsdB 分å。血细胞的蛋白水解部分用于创建模型,其ä¸å¤©ç„¶è¡€ç»†èƒžä¸Ž β-Hb 链结åˆã€‚IsdB:Hb å¤åˆç‰©çš„晶体结构还包括缺少原å和未折å 部分的 Hbï¼›å› æ¤ï¼Œå®ƒå·²è¢«æ›¿æ¢ä¸ºåŽŸç”ŸmetHb(PDB ID 3P5Q)的PDBåæ ‡ã€‚æœ€ç»ˆï¼Œæ¨¡åž‹ä¸è¡€ç»†èƒžçš„åºåˆ—è¢«ä¿®æ”¹ä»¥æ·»åŠ Strep-tag ® II,这在已å‘布的结构ä¸ä¸å˜åœ¨ã€‚使用 Coot ( 53 )放置水分å,åªæœ‰ä¸Ž 2DN3 模型一致的水分åæ‰ä¿ç•™åœ¨æœ€ç»ˆç»“æž„ä¸ã€‚
IsdB:metHb å¤åˆç‰©çš„冷冻电镜图密度ä¸å¤Ÿè¯¦ç»†ï¼Œæ— 法准确推导å¤åˆç‰©ä¸è›‹ç™½è´¨æ®‹åŸºçš„ä½ç½®ã€‚å› æ¤ï¼Œé€šè¿‡ä½¿ç”¨ Flex-EM ( 55 )对 Hb 二èšä½“与两个 IsdB 分å(æ¯ä¸ª Hb 链一个分å)结åˆçš„特殊模型进行çµæ´»æ‹Ÿåˆï¼Œç„¶åŽåœ¨ Coot ä¸æ‰‹åŠ¨æ”¹è¿›ã€‚IsdB:metHb å¤æ‚模型是从 PDB ID 5VMM 结构开始构建的。IsdB åºåˆ—,包括 C 末端 Strep-tag ® II,是使用 Swiss Model 网络æœåŠ¡å™¨åœ¨ 5VMM ä¸çš„ IsdB 模æ¿ç»“构上建模的。由于在 5VMM ä¸ Hb 二级结构被严é‡æ”¹å˜ï¼Œåœ¨æˆ‘们的模型ä¸ï¼Œæˆ‘们使用天然人类血红蛋白结构 (PDB ID 3P5Q)。如果供体和å—体之间的è·ç¦»åœ¨ 3.5 埃(氢键)或 4.0 埃(离å相互作用)内,则表明æžæ€§æŽ¥è§¦ã€‚在 4.0 Ã… 内的链之间显示éžæžæ€§æŽ¥è§¦ã€‚
使用 UCSF Chimera ( 56 ) 和欧洲分å生物å¦å®žéªŒå®¤-欧洲生物信æ¯å¦ç ”究所 (EMBL-EBI) PDBePISA将原å模型与已å‘表的高分辨率结构进行比较。使用 PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4.1 Schrödinger, LLC 制备图åƒã€‚
|