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人类 HELB 是一种进行性运动蛋白，可催化 RPA 从单链 DNA 中清除
意义
单链 DNA (ssDNA) 是许多细胞 DNA 交易的关键中间体，包括 DNA 复制、修复和重组。新生的 ssDNA 迅速与复制蛋白 A (RPA) 复合物结合，形成既稳定 ssDNA 又介导下游加工事件的核蛋白丝。然而，自相矛盾的是，RPA 对 ssDNA 的非常高的亲和力可能会阻止更多因子的募集。在这项工作中，我们表明 RPA-ssDNA 核蛋白丝被人类 HELB 解旋酶特异性靶向。RPA-ssDNA 招募 HELB 激活 HELB 易位活性，导致上游 RPA 复合物的持续去除。这种 RPA 清除活动可能支持 HELB 在复制和重组中的不同作用。
摘要
人类 DNA 解旋酶 B (HELB) 是一种表征不佳的解旋酶，建议在 DNA 复制和重组中发挥正向和负向调节作用。在这项工作中，我们使用体积和单分子方法来表征 HELB 蛋白的生化活性，特别关注其与复制蛋白 A (RPA) 和 RPA-单链 DNA (ssDNA) 细丝的相互作用。HELB 是一种单体蛋白，与 ssDNA 紧密结合，位点大小约为 20 个核苷酸。它将 ATP 水解与 ssDNA 沿 5' 到 3' 方向的易位结合起来，伴随着 DNA 环的形成。HELB 也显示出经典的解旋酶活性，但在没有辅助力的情况下非常弱。HELB 与人类 RPA 特异性结合，增强其 ATP 酶和 ssDNA 转位酶活性，但抑制 DNA 解旋。直接观察 RPA 核蛋白丝上的 HELB 表明，易位 HELB 伴随着从 ssDNA 中清除 RPA。尽管受到 RPA 的屏蔽，但这种活性可以允许其他蛋白质访问 ssDNA 中间体，这可能支持 HELB 在细胞 DNA 交易中的不同作用。
人类HELB蛋白首先被鉴定为假定的鼠类复制解旋酶的同源物。从那时起，该蛋白质被赋予了各种功能，包括在染色体 DNA 复制开始、细胞从复制应激中恢复、促进 Cdc45 染色质结合、DNA 二级 CGG 核苷酸的解析重复结构，并刺激 RAD51 介导的 5'-3' 异源双链延伸以促进同源重组 (HR)。最近，与刺激 HR 的作用明显矛盾，HELB 被提议通过在 G0/G1 阶段拮抗进行性切除核酸酶 EXO1 和 DNA2/BLM 来抑制同源依赖性双链 DNA 断裂 (DSB) 修复。细胞周期。与这个想法一致，HELB 形成核病灶以响应 DNA 损伤，并被细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK) 磷酸化，导致 G1 时定位到细胞核，S/G2 期间定位到细胞质。HELB 损伤灶的形成依赖于主要的真核单链 DNA (ssDNA) 结合蛋白复制蛋白 A (RPA)，它已被证明与 HELB 发生物理相互作用。尽管与 RPA 的相互作用对于 HELB 的所有假定功能都可能至关重要，但这种运动蛋白调节 RPA 核蛋白丝的形成、重塑或去除的能力从未被研究过，并且是这里介绍的工作的重点。
RPA 和 ssDNA 之间形成的细丝是 DNA 复制、重组和修复的关键中间体。RPA 不仅保护 ssDNA 免受核酸降解，而且还参与了 ssDNA 中其他因子的募集或排除、DNA 复制和修复的调节以及将这些途径与细胞周期及其相关途径联系起来的细胞信号线索的启动。通过检查点的进展。有趣的是，许多解旋酶和解旋酶样蛋白与 ssDNA 结合蛋白具有密切的物理和功能相互作用。然而，我们目前不了解 HELB 的活动如何影响 RPA 细丝，反之亦然。
HELB 是一种 120 kDa 的蛋白质，包含三个不同的结构域：一个功能未知的 N 末端区域、一个与超家族 1 (SF1) 解旋酶 RecD 具有同源性的中心解旋酶结构域，以及一个包含 CDK 磷酸化位点的 C 末端区域 (图1A )。定点诱变表明中心解旋酶结构域与 HELB 的 DNA 和 RPA 结合活性有关（图1A，蓝色箭头）。有趣的是，HELB 的突变与女性不孕症和早发性更年期有关，并且发现广泛分布于人类肿瘤样本的蛋白质序列中（图 1 A ，红色箭头）。体外研究表明，HELB 具有 ssDNA 依赖性 ATP 酶活性和 5' 至 3' 解旋酶活性，这与基于与 RecD 的相似性的预期一致。然而，这些生化特性究竟如何支撑 HELB 的细胞功能以及与 RPA 相互作用的重要性尚未得到解决。
图。1。
HELB 是一种与 ssDNA 紧密结合并表现出 ssDNA 依赖性 ATPase 活性的单体。( A ) HELB 的卡通图显示了整体域布局和重要突变。红色标记表示高频肿瘤突变的位置。蓝色标记表示影响 ATPase、DNA 结合和 RPA 结合活性的突变位置。( B ) 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分析显示由昆虫细胞产生的高度纯化的重组人 HELB。( C ) SEC-MALS 分析表明，HELB 在这些条件下是溶液中的单体，计算出的分子量（红色数据线）为 123,252 Da。( D , 左轴) HELB 绑定常数 ( K d) 用于在SI 附录图 S1 A中描述的 PIFE 测定中获得的不同长度的聚 (dT) 底物。指数拟合确定 5 nM 的饱和K d。（D，右轴）在紧密结合条件下获得的化学计量值，如SI 附录，图 S1 B - E所示。( E ) ATP 水解的 Michaelis-Menten 图给出了 WT HELB 的K m和k cat参数，并且还表明 K481A 突变体不能水解 ATP。( F) 对 HELB ATPase 活性的 DNA 刺激分析表明，HELB 是一种 ssDNA 依赖性解旋酶。多胸苷底物比混合碱基序列更能刺激 ATP 周转，这可能是由于它们无法形成抑制性二级结构。AU，任意单位；mw，分子量。
在这项研究中，我们使用散装和单分子分析来进一步表征 HELB，包括其与 RPA 和 RPA 核蛋白丝的物理和功能相互作用。矛盾的是，我们发现人类 RPA（其本身是一种有效的 ssDNA 结合蛋白）可刺激 HELB 在 ssDNA 上的所有活性，尽管人们预计这两种蛋白质之间会竞争其核酸底物。相反，非同源 RPA 蛋白抑制人类 HELB 的所有活性。这些与 RPA 细丝的高度特异性相互作用有助于将 HELB 募集到没有二级结构的 ssDNA 上，并促进有效的 ssDNA 易位与 RPA 的持续清除相结合。讨论了这一发现对 HELB 在 DNA 复制和重组中的作用的影响。
结果HELB 是一种与 ssDNA 紧密结合并显示 ssDNA 依赖性 ATP 酶活性的单体蛋白。
人 HELB 包含一个 C 端 SF1 解旋酶结构域和一个功能未知的大 N 端区域，与已知蛋白质或折叠没有明显的同源性（图1A）。为了更好地表征这种蛋白质，我们首先从昆虫细胞中制备了纯重组 HELB（图 1B ）。尺寸排阻色谱结合多角度光散射 (SEC-MALS) 分析表明，天然 HELB 的分子量为 123 ± 3 kDa，这是单体的预期值（图1C）。为了定量研究 ssDNA 结合活性，我们使用蛋白质诱导荧光增强 (PIFE) 测定来测量与一系列长度增加的聚 (dT) 寡核苷酸的结合（SI 附录，图S1 A）。该测定法检测到 DNA 一端染料标记约 3 nm 范围内的蛋白质结合，作为荧光强度的增加。对于沿 DNA 晶格的非特异性相互作用，当 DNA 饱和时信号最大。在弱结合条件下（即 [DNA] 低于K d），我们观察到荧光强度和 [HELB] 之间的关系近似为双曲线，并且数据拟合得出每个测试 DNA 长度的K d（SI 附录，图S1 A）。HELB 对 ssDNA 的亲和力随着长度的增加而增加，直到对于 30 个碱基或更长的寡核苷酸在K d ∼ 5 nM 时达到饱和（图1D )，表明结合位点大小在 20 到 30 个核苷酸之间。然后，我们在紧密结合条件下（即 [DNA] 远高于K d）进行 PIFE 测定，以确定结合化学计量（SI 附录，图 S1 B - E）。我们发现一个 HELB 单体与长度可达 30 个碱基的 ssDNA 分子结合，而一个 40 聚体寡核苷酸可以容纳两个 HELB。总之，这些数据表明结合位点大小约为 20 个核苷酸，这一结论得到了电子迁移率变动分析 (EMSA) 的进一步支持（SI 附录，图 S1 F）。这比 SF1 DNA 解旋酶的典型值要大；对这些酶的许多代表性例子的结构研究表明，它们的核心解旋酶结构域结合了大约 8 个核苷酸，并且与 Rep 解旋酶一起工作表明两个单体可以并排结合到 16 聚体寡核苷酸。这意味着，除了核心解旋酶结构域中预期的 ssDNA 结合位点外，HELB 还包含一个未定义的 DNA 结合位点，可能在蛋白质的 N 端区域，这一想法与下面提出的进一步实验一致。
HELB 显示 ssDNA 依赖性 ATP 酶活性，在存在饱和聚 (dT) 浓度的情况下测量的Michaelis-Menten 参数k cat = 44 ± 3 s -1和K m (ATP) = 800 ± 140 µM（图 1 E） . 该营业额数显着高于先前报道的 (280 ATP min -1 ) ( 2 )。正如预期的那样，将 Walker A 基序（解旋酶基序 I）中的保守赖氨酸替换为丙氨酸（K481A）显着降低了 ATP 酶活性，表明该活性是纯化的 HELB 多肽所固有的（图 1 E）。我们比较了六种模型核酸底物刺激 HELB 的 ATP 酶活性的能力（图1F）。双链 DNA 和 poly(U) 单链 RNA 不刺激 ATPase 速率。相反，ssDNA 强烈激活了 ATPase 活性。我们发现 poly(dT)（平均长度为 1,000 个核苷酸的多聚胸苷链的混合物，不能形成二级结构）是 HELB 比 φX174 病毒粒子 ssDNA（一个 5,386 个核苷酸的环状分子，这是预期的）更好的底物。形成广泛的二级结构），反映在较高k cat和较低k DNA. 这表明二级结构和/或 DNA 序列可能影响 HELB 与 DNA 的结合以及与易位偶联的 DNA 刺激的 ATP 酶。
HELB 在 ssDNA 上以 5' 到 3' 方向有效易位。
为了评估推定的 HELB 的 ssDNA 转位酶活性，我们首先使用基于链霉亲和素从生物素化寡核苷酸中置换的间接凝胶测定法。通过比较用生物素标记在 3' 或 5' 末端的寡核苷酸的链霉亲和素置换，可以推断 DNA 易位活性及其极性。我们观察到 HELB 从 3' 生物素（但不是 5' 生物素）标记的底物中有效去除链霉亲和素，这表明 HELB 在 5' 到 3' 方向上移动（图 2 A和B）。鉴于与 RecD 解旋酶家族的序列相似性，这是预期的极性。
图 2。
HELB 在 ssDNA 上以 5' 到 3' 的方向有效易位。（一）散装链霉亲和素置换分析表明，HELB 沿 ssDNA 特异地在 5' 到 3' 方向移动。（乙）基于凝胶的测定的量化。( C ) 实验性 C-Trap ®设置示意图。单个 λ 大小的 ssDNA 系绳连接在两个光阱捕获的两个链霉亲和素包被的珠子之间。共聚焦激光扫描 DNA 系链以检测与一个 QD 结合的 HELB。（D ）在2 mM ATP（ 9≤n）存在下，ssDNA上HELB易位率随力的变化曲线≤ 59)。统计分析显示，在 13 至 30 pN 的力范围内，平均比率没有统计学意义（P > 0.05）。将 8 pN 的数据与其他力进行比较得出 1.6·10 -6 ≤ P ≤ 0.016，表明该群体存在显着差异。**** P < 0.0001。（E）在 18 pN 张力下（右），在 2 mM ATP 存在下装载多个 HELB-QD（左）和 HELB 运动的代表性 kymograph（蓝色）的系留 ssDNA 的卡通片（右）。
接下来，为了更好地表征 ssDNA 易位的速率和持续合成能力，我们使用组合光学镊子和共聚焦荧光显微镜(C-Trap; Lumics) 直接对荧光 HELB 在 ssDNA 上的运动进行成像。对于这些实验，我们首先将生物素化的 HELB 与链霉亲和素涂层的量子点 (QD) 结合，这一过程不影响其 ATP 酶活性（SI 附录，图 S2 A）。通过在低盐缓冲液中施加高于过度拉伸力的张力，从 λ-噬菌体双链（dsDNA）（48.5 千碱基对，kbp）产生长的 ssDNA 底物（图 1）。 2 C和SI 附录，图 S2 B和C）。ssDNA 分子的成功生成是通过其机械指纹来评估的，这与 dsDNA 非常不同（SI 附录，图 S2 D）。在单个 ssDNA 分子稳定地被困在珠子之间后，我们将分子移动到含有 5 nM HELB-QD 和 2 mM（饱和）ATP 的通道中，并在 50 到 100 ms 线-1处记录珠子之间的共焦图像，允许我们构建描绘 HELB 结合和 DNA 运动的 kymographs（图 2 E）。DNA 保持在高于 8 pN 的张力下，以避免在 ssDNA 上形成二级结构。这些实验表明 HELB 与 ssDNA 结合，然后在任何给定的 DNA 分子上以相同的方向易位（图 2 E和SI 附录，图 S2 E）。因为 ssDNA 系绳方向是任意的，我们无法确定易位极性。然而，根据我们的大量实验，运动大概是在 5' 到 3' 方向。在没有 ATP 的情况下，HELB 能够与 ssDNA 结合但保持静止（SI 附录，图 S2 F）。发现室温下裸 ssDNA 上的易位速率与 13 至 30 pN 范围内的张力无关（P值 > 0.05），平均值为 72 ± 40 nt s -1（峰 ± 宽度/2，n = 204）（图 2 D）。发现在 8 pN 处的易位率分布在统计学上不同于其他 (1.6·10 -6 ≤ P值 ≤ 0.016)，并且包含更大的值。总之，这些实验表明 HELB 是一种进行性运动蛋白，它将 ATP 水解与 ssDNA 的 5' 到 3' 单向易位结合起来，而不需要从游离 DNA 末端开始。
HELB 是一种有效的解旋酶，只有在武力的辅助下才能发挥作用。
为了评估 HELB 将其 ssDNA 易位活性与解旋酶活性（即链解旋和分离）偶联的程度，我们首先使用含有 5' 突出端的短双链 DNA 作为加载位点进行批量解旋酶测定（图3A） . 在升高的蛋白质浓度 (500 nM) 下，野生型而非 ATP 酶死亡突变体 HELB 部分解开双链体，揭示了先前报道的内在解旋酶活性。然而，在该底物上检测到的明显较弱的解旋酶活性与上面报道的有效转位酶活性形成对比。我们接下来进行了磁镊子 (MTs) 实验，以进一步研究 HELB 的双链展开动力学以及力在该活动中的潜在作用。我们制造了一个约 6.3-kbp 的 DNA 底物，其中含有一个 5' 末端的 poly(dT) ssDNA（37 nt），位于距离一端 1.7 kbp 的位置，作为 HELB 的加载位点，命名为 Flap-DNA（图 3 B） . 一个 DNA 末端连接到流体细胞的玻璃表面，另一个连接到超顺磁性珠子上。然后使用位于细胞上方的外部磁铁施加受控力以延伸 DNA，同时监测珠子的高度（图 3 C）。在此设置中，可以监控 DNA 展开，因为 ssDNA 和双链 DNA 对于给定力显示不同的延伸。在高施加力的情况下（F ≥ 6 pN），ssDNA 比双链 DNA 长，因此，解旋酶活性导致珠子 Z 位置的增加。在低力 ( F < 6 pN) 下，ssDNA 比双链体短，展开导致珠子高度降低 。
图 3。
HELB 可以解开双链 DNA 并转换易位链。（一）散装展开（U）分析显示HELB双链U活性有限。NP，没有蛋白质。（乙）用于 MT 单分子展开分析的 Flap-DNA 底物的示意图。Bio 和 Dig 表示用生物素和地高辛标记的 DNA 末端。（C）用于监测 HELB 解旋 DNA 的 MT 分析动画。SA 珠子，链霉亲和素包被的珠子。（D）在 1 pN 下使用 100 nM HELB 和 1 mM ATP 进行的 MT 实验的代表性时间过程。显示了 DNA 延伸减少 (U) 然后再次增加 (R) 以达到初始珠子高度的几个事件。( E) U 事件可以通过低力下的直接 HELB U（暴露一段 ssDNA）或循环形成来解释。在链切换时，沿相反链的 HELB 易位导致螺旋的再杂交 (R) 和珠的初始高度的恢复 (R 事件)。（F）在 MT 时间课程中测量的 U 长度（黑色）和 R 长度（红色）的分布。对两个指数衰减的拟合给出 = 194 ± 22 nm（拟合误差， n = 99）和 = 194 ± 14 nm（拟合误差，n = 94）的平均值。( G ) 从 MT 时间过程中提取的事件的 U 率 (黑色) 和 R 率 (红色) 的分布与D中所示的相似. 拟合高斯函数给出了 = 9 ± 2 nm s -1 ( n = 99) 和 = 9 ± 5 nm s -1 ( n = 89)的平均 U 率。
MT 展开实验首先在低施加力状态 (1 pN) 下进行。在添加 100 nM HELB 和饱和 ATP 后，我们观察到展开循环，这反映在珠子高度的降低和再杂交事件中，其中恢复了初始延伸（图3D）。还制备了包含 63-nt 间隙且没有瓣的对照间隙底物，称为 Gap-DNA（SI 附录，图 S2 G）。在使用 Gap-DNA 底物的对照实验中未观察到活性，表明解旋从游离的 5'-ssDNA 尾部开始（SI 附录，图 S2 H）。为了估计展开的碱基对的数量和速度，我们测量了延伸时间的变化并考虑了两个模型（图 3 E）。第一个是基于扩展 ssDNA 区域的形成（即简单展开）。第二个，它需要一个额外的 DNA 结合位点，并且包括在下面将变得更加明显的原因，是基于 ssDNA 环的形成。在简单的展开场景中，HELB 将以56 ± 11 bp s -1（峰值 ± 半宽，n = 99）的展开速率展开 1,240 ± 140 bp（指数拟合误差， n = 99）。在 ssDNA 循环模型中，HELB 在 45 ± 10 bp s -1处解绕 865 ± 146 bp, 与上述 ATPase 和 ssDNA 转位酶分析中观察到的速率非常相似。请注意，如果 HELB 展开双工的一部分然后形成循环，则两种模型的组合也是可能的。无论模型如何，再杂交参数都类似于在展开时间过程中获得的参数（图 3 F和G）。此外，类似的展开和再杂交率，以及这些事件的明显对称性，支持了它们反映了单一 HELB 酶的链转换的观点。我们得出结论，HELB 可以在低力下逐步解开 DNA。然而，重要的是要注意，这些事件极为罕见，因为它们通常在注射 HELB 后几分钟内观察到（SI 附录，图 S3 A )。在低力下在单分子水平上观察到的这些罕见事件与大量 DNA 解旋酶测定（在零力下）一致，后者仅检测到非常有限的 5' 至 3' 解旋酶活性（图3A）。在没有 ATP（ SI 附录，图 S3 B）、ATPase 死亡突变体 K481A（ SI 附录，图 S3 C）和有缺口的 DNA（ SI 附录，图 S3 D）的情况下进行了进一步的对照实验不显示任何解旋酶活性。
我们接下来进行了等效的 MTs 实验，但在 8.4 pN 的更高施加力下，ssDNA 比双链 DNA 长（图 4A）。我们通常观察到系链的快速伸长，这与 HELB 有效地解开 DNA 一致（代表性的时间进程如图4B 所示）。观察这些事件的任何活动（激活时间）所需的时间呈指数分布，时间常数为 147 ± 10 秒（拟合误差，n = 44），远短于在低力状态下观察到的时间（SI 附录, 图 S3 E）。此外，该值对应于（因此受限制）蛋白质和 ATP 到达流体细胞中间的跟踪系绳位置，这由我们用来避免的低流速控制珠跟踪中的扰动。在 74 条轨迹中的 48 条 (65%) 中观察到解旋酶活性，而 35% 的系绳延伸没有变化，我们将其归因于 DNA 底物中可能不存在 5' 瓣。在不存在 ATP、ATPase 突变体或带有切口 DNA 的情况下，在高强度下进行的其他对照实验未显示任何解旋酶活性（SI 附录，图 S3 F - H）。在 8.4 pN 处观察到的展开长度为 3,600 ± 900 bp（分布峰 ± 宽度/2，n= 48）（SI附录，图S4 A），这意味着HELB可以转移和展开整个基板。展开率分布提供了一个平均值 38 ± 4 bp s -1（峰 ± 半宽，n = 47）（SI 附录，图 S4 B），略低于在 C-Trap 中获得的 ssDNA 易位率实验（图 2 D）但与批量测量的 ATPase 速率相似（图 1 E）。总体而言，我们将这些痕迹解释为表明 HELB 有效地将 ATP 水解与解旋酶活性相结合，当施加高辅助力时，解旋酶活性从 5' 到 3' 方向的皮瓣开始。随着力的增加，DNA 解旋的改善已被预测为其他解旋酶的一般特征 。
图 4。
HELB 在力的帮助下有效地解开双链 DNA 并在 ssDNA 上形成环。（一）HELB DNA解旋和环形成模型的示意图。由于 HELB 通过从 5'-ssDNA 突出端易位使双链 DNA 解旋，珠子的高度在高力（即F ≥ 6 pN）下增加。长 ssDNA 部分的暴露将促进其他 HELB 蛋白的结合，这些蛋白将以 5' 到 3' 的极性移动。HELB 中潜在的第二个结合位点可能通过将蛋白质保持在 DNA 上来促进环的形成。环的形成导致珠的高度降低。HELB 的运动由粉红色箭头表示。（乙) 在 8.4 pN 下使用 100 nM HELB 和 1 mM ATP 进行的 MT 实验的代表性时间过程，显示出特征性的展开和循环事件。（C）在力钳实验（3'-固定珠配置）中，HELB-QD（蓝色）向固定珠移动的代表性 kymograph。环的形成被检测为系绳延伸的缩短（下）。( D ) 模型以概括 3'-固定珠配置中的环形成和释放过程。正如预测的那样，环下游的 HELB 粒子增加了它们的表观速度（C中的白色箭头）。( E）在力钳实验（5'-固定珠配置）中，HELB-QD（蓝色）从固定珠易位的代表性kymograph。( F ) 模型以概括 5' 固定珠配置中的环形成和释放过程。正如预测的那样，环处的 HELB 粒子在 kymograph 中显得不动，并且环的释放导致 HELB 位置的突然跳跃（E中的白色箭头和圆圈）。
HELB 易位可导致 DNA 环的形成。
随着快速和持续的 DNA 展开，我们的高强度时间过程呈现出更复杂的行为，延伸的连续变化没有明显的方向性（图 4 B）。偶尔，我们注意到，尽管有很高的约束力，但珠子的高度迅速下降，随后伸展恢复（图 4 B，箭头）。这种类型的事件发生在我们长期课程的大约一半中。因为在这些条件下 ssDNA 比双链体更长，这些事件可能是由 ssDNA 转化为 dsDNA（即退火活性）或由 DNA 环的产生引起的。第一种选择意味着解链 HELB 酶的链转换，然后是先前分离的链的重新退火。然而，这种情况可以打折扣，因为我们清楚地观察到珠子前进到低于系绳的原始高度（SI 附录，图 S4 C）。因此，我们赞成第二种解释，即 HELB 的活性导致大 DNA 环的形成。这种行为要求酶寡聚化和/或单体具有多个 DNA 结合位点（图4A）。我们观察到循环后两种不同类型的高度恢复：珠子高度的突然跳跃（在 40 次事件中的 18 次）或逐渐恢复其初始位置（在 40 次事件中的 22 次），包括一些离散步骤中的暂停（SI 附录，图S4 D）。这两种行为都与循环模型一致，具体取决于导致循环产生的易位阻塞的性质以及如何解决。在 8.4 pN 处测量的导致形成环的展开事件的长度（环长度）为 438 ± 60 bp（指数拟合误差，n = 40）（SI 附录，图 S4 E），并且循环速率为 33 ± 14 bp s -1（峰值 ± 半宽，n = 37）（SI 附录，图 S4 F），类似于在相同实验条件下测量的放卷速率（SI 附录，图 S4 B）。
为了验证 DNA 环的形成，我们接下来在力钳模式下进行了光镊实验，并观察到表观系绳长度的缩短。在该测定中，其中一个光阱移动以保持施加的张力恒定，从而影响 HELB 分子的表观运动，具体取决于它们的方向。位于蛋白质下游的 HELB 颗粒会产生一个环并向固定珠移动，这将显示出明显更快的速度（图 4 C和D）。在相反的情况下，远离固定珠的 HELB 粒子将在环路处暂停或以明显降低的速度移动（图 4 E和F）。
HELB 与 RPA 包被的 DNA 的相互作用增加了 ATP 酶的活性并有利于 ssDNA 环的形成。
HELB 和 RPA 之间的直接交互作用之前已经报道过。然而，使用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（图 5A ），我们只能在 ssDNA 存在的情况下检测 RPA 和 HELB 之间的复合物。EMSA 实验使用 5' Cy5 标记的 25 聚体寡核苷酸证明 HELB 能够超移 RPA-DNA 复合物（图 5 B）。虽然这种寡核苷酸太短，无法完全并排容纳两种蛋白质（RPA 结合 20 到 30 nt，HELB 结合 ∼20 nt），但我们不能排除我们在这里看到的明显蛋白质-蛋白质相互作用是由 DNA 介导的想法。然而，重要的是，形成的三元复合物是物种特异性的，因为当用人类 RPA 代替酿酒酵母RPA (yRPA) 时没有明显的超移（图5B ） 。
图 5。
HELB 与 RPA 包被的 DNA 的相互作用增加了 ATP 酶活性并有利于 ssDNA 环的形成。( A ) 天然蓝色凝胶分析证实了 HELB-人 RPA-ssDNA 复合物的形成，没有观察到 HELB 和没有 ssDNA 的 RPA 的明显相互作用。( B ) HELB 与 ssDNA、人 RPA 包被的 ssDNA 和酵母 RPA 包被的 ssDNA 相互作用的原生 PAGE EMSA 分析显示 HELB 和人 RPA-DNA 之间形成了特定的超位移复合物。( C ) RPA-ssDNA 的添加改变了模型底物 poly(dT) 和病毒粒子 φX174 上的 HELB ATP 酶活性（褪色数据与图 1 F中所示的相同）。在这两种情况下，k cat都会增加，但对于混合基础基材，KDNA也显着减少（SI 附录，表 S3）。( D ) ATPase 活性的刺激是人类 RPA 独有的，因为酵母 RPA 会抑制 ATPase 活性。( E ) 一个 MT 实验示例，其中在 5 nM HELB 和 2 mM ATP ( F = 3.8 pN)的作用下测量了两个覆盖有人类 RPA 的 ssDNA 系绳。阴影时间窗口表示 RPA 和 RPA + HELB + ATP 的流量。（F ） E中标记的正方形区域的放大视图，以突出HELB促进的ssDNA循环动力学。
接下来，我们使用两种模型 ssDNA 底物研究了 RPA 对 HELB 的 ATPase 参数的影响：poly(dT) 和 φX174 病毒粒子（图 5 C和SI 附录，表 S3）。如上所示（图 1 F），在没有 RPA 的情况下，病毒粒子 φX174 是 HELB 的较差底物 [较低的k cat和显着较高的K DNA与 poly(dT)] 相比。我们将此解释为反映了病毒粒子 DNA 中的高二级结构含量，导致物理阻断结合和易位。天真地，人们可能期望 RPA（一种紧密的 ssDNA 结合蛋白）由于简单的竞争而抑制 HELB 的 ssDNA 依赖性 ATP 酶活性。然而，我们观察到相反的情况；用裸 DNA 代替预结合的 DNA-RPA 复合物（最初是一个 RPA：200 个核苷酸，远低于饱和度）导致k cat增加对于两种基材。这意味着 DNA 上 RPA 的存在以某种方式刺激 HELB 的 ATP 酶（可能还有易位活性），其方式与二级结构内容无关，可能是由于直接的物理相互作用。对于病毒体 DNA 而言，引人注目且有选择性的是，RPA 的添加还导致K DNA显着降低（即，明显更紧密的结合）。poly(dT) 没有发生这种情况的事实意味着 RPA 通过解析原本不利于结合的 DNA 二级结构来促进 HELB 向 DNA 的募集。
为了研究 RPA 对 HELB ATP 酶活性的刺激是否具有剂量依赖性，我们在低浓度的 φX174 ssDNA（0.1 × K DNA）下进行了 RPA 滴定实验，其中观察到的 ATP 酶速率对刺激高度敏感（图 5 D）。随着 RPA 浓度从每 200 nt 一个 RPA 增加到每 20 nt 一个 RPA（此时我们预计 RPA 会使 ssDNA 饱和），观察到的 ATP 水解速率增加了近八倍。在浓度高于饱和度（每 10 nt 一个）时，从最大值略有下降，表明溶液中的游离 RPA 在某种程度上抑制了 HELB 中的 ATP 水解，或者 HELB 募集到 ssDNA 可能需要裸 ssDNA 的短区域，使得 RPA 刺激直到接近饱和，但随着核酸晶格完全充满而抑制。与人类 RPA 的情况完全相反，酵母 RPA 的等效滴定强烈抑制 HELB ATP 周转，可能是由于它们的底物的简单竞争。SI 附录，图 S5 A和B）。总之，这些实验表明同源 RPA 特异性募集和刺激 HELB 在 ssDNA 上的 ATP 酶活性，这意味着 RPA 核蛋白丝是 HELB 的生理底物。
接下来，我们使用单分子技术研究了 HELB 与 RPA 细丝的相互作用。我们首先按照参考文献中描述的方法为 MT 实验准备了 ssDNA 系绳。 简而言之，将两条 dsDNA 底物链加热变性，然后快速冷却以避免再杂交。我们采用了基于用于制造 Flap-DNA 底物的相同插入物的扭转约束构造。在进行测量之前，系绳的力-延伸曲线确保它们是完全单链的。ssDNA 在有和没有人类 RPA (hRPA) 的情况下的机械反应显示延伸增加，在 ∼3.8 pN 时最大（SI 附录，图 S5 C和D）。进一步的实验证实 20 nM RPA 正在饱和（SI 附录，图 S5 E和F）。在该作用力下，20 nM RPA 的结合使 ssDNA 系链的延伸异常增加约四倍（图 5 E）。接下来，在保持 RPA 浓度的同时，我们将 5 nM HELB 和 2 mM ATP 引入流体细胞并记录 HELB 活性的影响。在这些条件下的一半时间过程中（15 个时间过程中的 7 个），HELB 和 ATP 导致珠子丢失（图 5 E，黑色痕迹），可能是因为易位马达可以破坏将 DNA 固定在珠子上的生物素-链霉亲和素键。在另一半迹线中，我们观察到珠子高度的重复降低，然后是初始位置的突然恢复（图 5 E，红色迹线，以及F和SI 附录，图 S6 A - C）。延伸的减少可能是由于 HELB 去除了 RPA，因为裸 ssDNA 的延伸比 RPA 细丝短。然而，我们可以放弃这种可能性，因为在观察到的活动期间始终存在游离 RPA，并且会在比 HELB 易位更快的时间尺度上重新结合底物，正如在初始 RPA 与 ssDNA 结合时观察到的快速延伸率清楚地表明的那样（图 5 E）。相反，我们根据循环模型解释数据，其中 HELB 保持固定在一条链上，同时通过运动域（可能与 RPA 的清除耦合或不耦合）卷入下游 ssDNA。身高的突然恢复被简单地解释为 HELB 从 DNA 中解离并释放环。与人类 RPA 的这些实验完全相反，在 20、100 和 500 nM 酵母 RPA 存在下，在等效 ssDNA MT 实验中没有观察到活性（SI 附录，图 S6 D - F）。总之，这些 MT 数据表明 HELB 可能具有二级静态 DNA 结合位点，该位点有助于在 RPA 包被的 ssDNA 上产生环，并进一步证实了 HELB-RPA 相互作用的物种特异性。
有趣的是，散装展开分析显示 RPA 对 HELB 解旋酶活性有明显的抑制作用（SI 附录，图 S7 A）。使用基于 MT 的展开分析证实了这一点，我们发现 RPA 总是抑制 Flap-DNA 中的 DNA 解旋酶活性，无论施加的力如何以及 RPA 是人类还是酵母来源（SI 附录，图 S7 B和C） . 一个简单的解释可能是 RPA 阻止 HELB 加载到游离的 5' 尾部，但无论如何，这些结果再次将我们的注意力集中在 RPA 包被的 ssDNA 作为 HELB 的生理底物上，并质疑其任何 DNA 解旋活动的相关性。细胞功能。
对 ssDNA 上 HELB 易位的直接观察表明，人类 RPA 促进并导致其移位。
接下来，我们试图使用光学捕获与共聚焦扫描显微镜的组合来直接描述 HELB 如何与 RPA 细丝相互作用并对其产生影响。我们用 MB543 (RPA MB543 ) 荧光团（发射波长 570 nm）标记人类 RPA，并使用我们仪器的双色成像能力同时检测 HELB-QD（蓝色通道）和 RPA MB543（绿色通道）（图 6 A）。我们首先像以前一样从 λ-DNA 生产了一个 ssDNA 系链。然后，我们移动到一个具有 15 nM RPA MB543的通道并拍摄单张图像以确认 RPA 对 DNA 的均匀覆盖（图 6 B，第 1 行）。接下来，我们将核蛋白复合物移至含有 5 nM HELB-QD 和 2 mM ATP（无 RPA）的通道，并在两个珠子之间获取视频扫描和 kymographs。图 6 B显示了二维 (2D) 视频扫描 ( Movie S1 ) 的快照，其中观察到了 RPA MB543 -ssDNA 细丝（以绿色表示）上的 HELB-QD（表示为蓝点）的运动。图 6 C显示了蓝色和绿色光激发通道的代表性 kymograph。我们观察到蓝色通道中的 HELB 轨迹在任何给定的 ssDNA 分子上单向移动，如之前在裸 ssDNA 上观察到的（图 2 E）。在绿色通道中检测到 HELB 易位对沿 DNA 单链的 RPA 分布的影响。有趣的是，这表现为暗区的渐进式和单向扩展，显然已清除了 RPA。蓝色和绿色发射的重叠证实了 HELB 轨迹与暗锋的进展相匹配（图 6 D和SI 附录，图 S8 A）。然而，请注意，在 RPA 分布的一些黑暗区域，我们没有检测到任何相关的 QD 发射信号（例如，SI 附录的合并 kymograph 中的红色箭头，图 S8 A）。我们将此归因于存在无法检测到的未标记 HELB 蛋白。正如预期的那样，在没有 ATP 的情况下，我们观察到 RPA 和 HELB 的结合，但荧光信号保持不变（SI 附录，图 S8 B）。HELB 在 RPA 覆盖的 ssDNA 上的易位率不取决于施加的张力范围内的力（14 至 20 pN）（图 6 E）。从 HELB-QDs 轨迹（蓝色）推导出的平均速率为 82 ± 19 nt s -1（峰值 ± 半宽度，R 2 = 0.92，n = 39）（图 6 E），类似于裸 ssDNA（磷值 = 0.362 > 0.05）。作为时间函数的人类 RPA 分布强度分布的分析表明 HELB 易位将其从 DNA 中移除。我们比较了多个易位事件的初始和最终时间 ( t = 20 s)的 2-µm × 0.5-s 时间窗口的总强度。在存在 ATP 的情况下，观察到与去除 RPA 相适应的强度大幅下降。光漂白对这种效果没有显着贡献，因为没有 ATP 的对照实验显示强度没有降低（图 6 F）。额外的力钳实验证实了 HELB 去除了 RPA，并清楚地显示了多个 HELB 循环事件，这导致了 DNA 系链的凝聚（SI 附录，图 S9）。
图 6。
ssDNA 上的 HELB 易位由人类 RPA 促进并导致人类 RPA 的置换。( A ) 实验 C-Trap 设置示意图。连接到两个光学捕获珠子上的单个 ssDNA 系绳被荧光 hRPA MB543覆盖并暴露于 HELB-QD。通过双色激发共聚焦显微镜检测这两种蛋白质。( B ) 在没有 HELB 的情况下（第 1 行）和暴露于 5 nM HELB-QD 和 2 mM ATP 过滤后，由 hRPA MB534覆盖的拴系 ssDNA 的二维扫描（RPA 检测）、蓝色（QD 检测）和合并荧光发射图像。（C） hRPA MB534 覆盖的 ssDNA 上 HELB 运动（蓝色）的代表性kymograph（绿色）在 2 mM ATP 存在下。使用蓝色和绿色发射滤光片获得的信号分别显示。（D ） C中白色标记区域的放大区域，其中包含蓝色和绿色通道的合并荧光。（E）在 2 mM ATP 存在下，hRPA 覆盖的 ssDNA 上 HELB 易位率的箱形图。P值 > 0.05 表明显示的人群之间没有显着差异。包括 hRPA-ssDNA（14 至 20 pN）和裸 ssDNA（13 至 30 pN）的整个力范围内的数据分布以进行比较。( F) 在 2-µm × 0.5-s 时间窗口中测量的总荧光强度在 20-s 时间间隔内的变化。没有 ATP 并以相似时间间隔进行评估的对照实验未显示强度显着降低。**** P < 0.0001。
电影 S1。
ssDNA 上的 HELB 易位和 RPA 置换。由绿色荧光人 RPA MB543 (15 nM)覆盖的两个光学捕获珠子之间的 ssDNA 系绳视频，显示了用 QD 标记的生物素化 HELB 的活性（5 nM HELB 和 2 mM ATP，蓝色发射）。HELB 向左珠的易位与 RPA 的位移有关。F = 18 pN，像素大小 = 50 nm，5 fps。
使用荧光酵母 RPA (yRPA CY3 ) 的等效实验给出了截然不同的结果。我们观察到 HELB 与 yRPA 覆盖的 ssDNA 分子结合较差，并且结合的 HELB 蛋白数量减少表现出非常有限的运动（SI 附录，图 S8 C）。因此，易位率分布在零附近显示出一个主峰（SI 附录，图 S8 D）。因为我们显示 yRPA 和 HELB 之间没有相互作用（图 5 B），蛋白质的结合很可能发生在裸露的 ssDNA 区域，但 HELB 被 yRPA 阻断并保持静止。然而，在获取长 kymographs 期间，我们可以检测到 HELB 的运动，以及 yRPA 从 ssDNA 中的清除。在这种情况下，HELB 的移动速度与存在 hRPA 时观察到的速度相似（SI 附录，图 S6 E和 S8 D）（P值 0.47 > 0.05；不显着 [ns]）。总之，这些结果与我们之前的发现一致，即酵母 RPA 抑制 HELB 的转位酶活性。
讨论
在这项工作中，我们纯化并表征了人类 HELB 解旋酶。该研究证实，单独纯化的蛋白质是一种有效的 ATP 酶和 5' 至 3' ssDNA 转位酶。基于 HELB 解旋酶结构域与 SF1B 解旋酶 RecD 样家族的相似性，这些特性与预期一致 。批量测量的 ATPase 速率与使用单分子方法测量的 ssDNA 易位率大致相似。鉴于所用分析的性质截然不同以及个体易位率的广泛变异性，HELB 很可能水解一个 ATP 以沿着 ssDNA 的每个碱基移动，正如在相关解旋酶研究中所观察到的 。我们还证明了 ssDNA 易位伴随着 DNA 环的形成。鉴于蛋白质是单体的，这意味着在易位 ssDNA 结合位点之外存在一个额外的静态 DNA 结合域，该结合位点预计与解旋酶核心相关。此处观察到的大结合位点大小（~20 个碱基）也与一个额外的未知结合位点一致，因为 SF1 解旋酶结构域仅结合约 8 个碱基的延伸。DNA 循环是进行性解旋酶的一个新兴特征，它可能有助于抑制再退火，从而改善双链解旋。然而，HELB 实际上是一种非常差的体外 DNA 解旋酶，只有通过施加辅助力才能揭示有效分离双链体的神秘能力。
HELB 已被证明与异源三聚体 RPA 蛋白相互作用，该蛋白在真核细胞的 DNA 复制和修复中发挥中心和普遍的作用 。由于其对 ssDNA 的高丰度和亲和力，RPA 最初被认为是 ssDNA 的保护因子。然而，现在人们认识到，RPA 核蛋白丝可以作为一个动态平台，用于募集或排除其他 DNA 结合蛋白 或用于启动细胞信号转导线索。此外，RPA 在 DNA 中“融化”二级或替代结构（如 G 四链体）的能力也有助于 ssDNA 中间体的下游加工：例如，形成均匀的 RAD51 细丝以促进 DNA 链交换。然而，RPA 在管理 ssDNA 中间体中的这些有用作用存在一个悖论。如何将一个非常紧密结合的 ssDNA 传递给完成复制或修复途径所需的其他酶？有趣的是，RPA 异源三聚体包含六个由柔性接头连接的 DNA 结合结构域，这种模块化组织可能允许其他蛋白质绕过或访问 RPA 细丝内的 ssDNA，尽管具有非常高的亲和力相互作用。此类交易也可能受到 RPA 的翻译后修饰、替代 RPA 亚基的使用或其他因素对 RPA 细丝的靶向重塑的调节。有趣的是，已知 RPA 细丝与几种解旋酶或转位酶在物理和功能上相互作用。这些相互作用，通常与 RPA70 亚基中的基本贴片相互作用，有助于将运动蛋白募集和激活到其生理作用部位，但也可能对 RPA 细丝的形成、重塑或去除产生影响。研究得最好的例子是 SF2 解旋酶，例如 WRN 和 HelQ，它们的 DNA 解旋活性受到同源 RPA 蛋白的刺激。类似地，RPA2 促进了古细菌核苷酸切除修复和转录因子 XPD 的解旋酶活性。值得注意的是，XPD 可以绕过 RPA 而不会取代它，从而克服其作为易位障碍的潜在抑制作用。相比之下，细菌 SSB 蛋白已被证明通过各种解旋酶沿着 DNA 推动，而无需任何物理相互作用，这种现象可能涉及向前滚动四聚体 SSB 蛋白以避免完全破坏其与 ssDNA 的相互作用。
我们的工作表明，HELB-RPA 相互作用的功能后果对这两种蛋白质都是深远的，但与这些其他解旋酶系统相比也非常独特。HELB 的所有 ssDNA 依赖性活动都受到 RPA 的刺激。这种现象绝对需要同源人类 RPA，因此，我们假设持续的物理相互作用，因为酵母直系同源物在相同条件下抑制 HELB 的所有活动。后一种观察很有意义，因为 ssDNA 结合蛋白与核酸紧密相互作用，因此必须与 HELB 竞争以获得 ssDNA。在存在和不存在 RPA 的情况下，对 HELB 的 ssDNA 依赖性 ATP 酶活性的定量分析为 RPA 刺激 HELB 既是募集/加载现象的结果，也是由于正向易位的激活提供了支持，可能是因为 RPA 次要预熔否则会减慢运动蛋白运动的结构。尽管它被其同源 RPA 蛋白招募和激活，但 HELB 易位活动随后会去除 RPA，留下裸露的 ssDNA，而双链解旋实际上被 RPA 抑制。我们提出 HELB 的生理目标是 RPA-ssDNA 复合物，而 HELB 是 RPA 位移马达。这种核心生化活动不排除 HELB 的其他功能，可能会促进许多 DNA 交易，其中 RPA 细丝是可能阻止下游处理事件的中间体。在这方面，HELB 可能与酵母 Srs2 解旋酶共享其功能的某些方面 。这些发现对于更好地理解 HELB 在 DNA 修复和复制中可能发挥的作用的生化基础具有重要意义。
尽管 HELB 的体内功能仍然很不明确，但可以推测 RPA 清除活动如何与其提出的细胞作用相关。HELB 定位于复制起点，似乎通过与 CDC45（复制解旋酶的一种成分）和 DNA 聚合酶 α-引物（合成 RNA 引物）相互作用，在染色体复制开始中发挥作用。复制叉的成功触发涉及 RPA 与来自 CMG (Cdc45-MCM-GINS) 解旋酶的 ssDNA 的结合，因为它们在 S 期经历激活，但 RPA 也抑制 DNA 聚合酶 α-primase。因此，此处观察到的 HELB 的 RPA 清除活性可能有助于在 ssDNA 结合蛋白存在的情况下启动 DNA 复制。HELB 在复制压力期间也以 RPA 依赖的方式定位于染色质，因此也可能在复制伸长期间发挥作用，以恢复停滞的叉。在这种情况下，RPA 清除可能有助于复制体的独立组装或前导链复制的重新启动。最后，HELB 已被提议用于增强和抑制HR 通过促进链交换和抑制 DSB 切除，分别。很容易想象 RPA 在 5' 到 3' 方向上的清除如何通过促进 RPA 与 RAD51 的交换来促进链交换。事实上，RAD51 对 DNA 的固有亲和力不足以在没有诸如 BRCA2 的介质蛋白的情况下与 RPA 有效竞争。相比之下，HELB 的 5' 到 3' 易位极性如何直接抑制 DSB 切除核酸酶不太明显，DSB 切除核酸酶会产生 3'-ssDNA 突出端以启动重组。去除 RPA 可能会间接抑制切除，因为 RPA 已被证明可以增强 DSB 修复中的这一早期处理步骤。或者，HELB 可能有助于获得 ssDNA，以获取抑制 DNA 断裂切除和 HR 的其他因素。挖掘这些可能性将是未来工作的目标。
材料和方法蛋白质表达和纯化。
人类 HELB、人类 RPA 和酵母 RPA 蛋白表达和纯化的详细描述 包含在SI 附录，SI 方法中。
HELB 解旋酶的生化检测。
使用电泳迁移率变动和 PIFE 测定研究 HELB 的 DNA 结合活性。使用耦合的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶 (PK/LDH) 测定法监测 ATP 水解。使用链霉亲和素置换从生物素化的寡核苷酸测量 ssDNA 易位，并使用链置换测定研究解旋酶活性。这些生化方法的全部细节可以在SI 附录，SI 方法中找到。
蓝色本机页面。
蛋白质和 DNA 在 20 mM Tris、pH 8.0、200 mM NaCl 和 1 mM DTT 中以等摩尔量（最终浓度均为 3 μM）混合。在室温下孵育 5 分钟后，将样品与样品缓冲液混合，加载到预制的蓝色天然凝胶上，并根据制造商的说明 (Life Technologies) 运行。
分析 SEC 和 SEC-MALS。
将蛋白质和 DNA 以等摩尔量混合并加载到在 20 mM Tris、pH 8.0、200 mM NaCl 和 1 mM TCEP 中平衡的 Superose6 10/300 柱上。使用 Unicorn 记录 280 nm 和 260 nm 吸光度对体积（毫升）的色谱图。SEC-MALS 用于确定全长 HELB 的绝对分子量。使用 20 mM Tris、pH 8.0、200 mM NaCl 和 1 mM TCEP 以 0.5 mL/min 将 50 µg HELB 样品加载到 Superose 6 10/300 尺寸排阻色谱 (SEC) 柱 (GE Healthcare) 上安捷伦高效液相色谱 (HPLC)。来自柱的洗脱液与 DAWN HELEOS II MALS 检测器（Wyatt Technology）和 Optilab T-rEX 差示折光仪（Wyatt Technology）耦合。根据制造商的说明，使用 ASTRA 6 软件（Wyatt Technology）收集和分析光散射和微分折射率数据。计算各个洗脱峰的分子量和估计误差。
光学镊子和共聚焦显微镜检测。
相关镊子-荧光实验在室温下在结合了三色共聚焦荧光显微镜和双阱光学镊子（C-Trap；Lumicks）的仪器上进行。计算机控制的阶段使五通道流体单元内的光阱能够快速位移（SI 附录，图 S2 B）。这种微流控细胞允许哑铃 DNA 构建体的原位组装和表征，并促进不同流动通道之间拴系的 DNA 的直接转移。层流分离通道 1 至 3 用于形成单链生物素-λ DNA 系链，如下所示；单个 4.38-µm 链霉抗生物素涂层的聚苯乙烯珠 (Spherotech) 被捕获在通道 1 的每个陷阱中（陷阱刚度约为 0.4 pN/nm）。然后将陷阱移至通道 2，该通道包含用于强制制造 ssDNA 的生物素化 DNA。该 DNA 是 λ-噬菌体 dsDNA (Lumics)，在同一链的 3' 和 5' 位置进行生物素化，因此可以通过张力去除非生物素化的链。然后将陷阱移至含有低离子强度缓冲液（10 mM Tris，pH 8.0，1 mM EDTA）的通道 3，以促进剥离。在这里，双链 DNA 被保持在高于过度拉伸过渡的力下，并且去除了非生物素化的链（SI 附录，图 S2 C）。通过力-延伸曲线验证了 ssDNA 的存在（SI 附录，图 S2 D）。正交通道 4 和 5 用于蛋白质加载和成像。
为了研究 HELB 在 ssDNA 上结合和易位的能力，将系链移动到通道 5 中，该通道含有 20 mM Tris、pH 7.5、30 mM NaCl、4 mM MgCl 2、5 mM DTT（反应缓冲液）中的 5 nM 生物素化 HELB - QD ) 和 2 毫米 ATP。为了测试 HELB 在 RPA 覆盖的 ssDNA 上的行为，首先将单链系链移动到含有 15 nM 人 RPA MB543或 yRPA CY3的通道 4在反应缓冲液中。然后将装载 RPA 的系绳拖到通道 5，该通道在补充有 2 mM ATP 的反应缓冲液中含有 5 nM HELB-QD。在数据采集期间关闭流量。在力钳实验期间，使用反馈回路将力保持在目标值不变。该仪器配备了用于三色共焦成像的多波长激光引擎。对于我们的实验，使用了两种激发激光器：488 nm 用于 QD，525 和 532 nm 用于 MB543 和 Cy3 荧光团。使用蓝色滤光片 512/25 nm 和绿色滤光片 585/75 nm 检测发射。Kymographs 是通过通过两个珠子中心的共焦线扫描生成的。
使用 FIJI和 Lumics 提供的定制软件分析力和荧光数据。裸 ssDNA 和 RPA 存在下的 HELB 速度是通过将行进距离除以每个轨迹的持续时间ΔL / Δt来测量的（SI 附录，图 S8 A）。从蓝色发射滤光片 512/25 nm 中检测到的信号分析 HELB-QD 轨迹。
MT 分析。
我们使用了类似于之前报道的 MT 仪器设置。原始数据以 120 Hz 记录并过滤至 6 Hz 以进行表示。使用适用于 DNA 系链珠子的布朗运动方法计算力值。Flap-DNA 底物（图 3 B）基本上由一个约 6.3 kbp 的 DNA 分子组成，在特定位点包含一个 37 nt 的 Flap poly（dT）尾，两侧是两个较小的片段（~1 kbp），它们充当固定手柄，因为它们标有生物素或地高辛。标记的部分用于将每个 DNA 末端特异性结合到被抗地高辛和链霉亲和素包被的磁珠上的玻璃表面。对照 Gap-DNA 底物（有间隙但没有瓣序列）（还准备了SI 附录，图 S2 G）和受扭转约束的 dsDNA 底物（没有间隙，用于获得 ssDNA 系链）。通过在珠子上应用磁铁旋转来识别双重束缚珠子，并且不考虑进行分析。用于制造 MTs 底物的 DNA 寡核苷酸可在SI 附录表 S1中找到。本工作中使用的 DNA 片段序列可在SI 附录表 S4中找到。有关 MTs 基板和测定的制造的更多详细信息，请参见SI 附录，SI 方法( 26 , 28 , 54 – 56)。
统计分析。
P值由双尾双样本t检验确定（ns，P > 0.05；**** P < 0.0001）。箱线图表示分布的平均值、中位数以及第 25 和第 75 个百分位数，而晶须表示 SD。
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发表于 2022-4-9 08:18:54
