非经典 Wnt 信号在前列腺癌小鼠模型中介导雄激素依赖性肿...

ZOY

非经典 Wnt 信号在前列腺癌小鼠模型中介导雄激素依赖性肿瘤生长摘要
前列腺癌的发展与过度活跃的雄激素信号传导有关。然而，雄激素受体 (AR) 功能与体液因子之间的分子联系仍然难以捉摸。通过 Cre-ER T2介导的靶向体细胞诱变，将前列腺上皮细胞中的 AR 苏氨酸 877 选择性突变为丙氨酸，从而生成了前列腺癌小鼠模型。这种AR点突变小鼠（AR pe-T877A/Y) 发展为肥大的前列腺，对雄激素拮抗剂和雌激素都有反应，尽管没有发现前列腺肿瘤。在前列腺癌模型转基因小鼠中，通过将 AR T877A 突变引入前列腺，前列腺肿瘤发生以及肿瘤生长的发生显着增强。小鼠的基因筛选确定 Wnt-5a 是一种激活剂。在患者的恶性前列腺肿瘤中检测到增强的Wnt-5a表达，而在良性前列腺增生中这种异常上调不明显。这些发现表明，非经典 Wnt 信号会刺激伴有 AR 功能亢进的前列腺肿瘤的发展。


雄激素受体 (AR) 在前列腺癌发展
中至关重要，因为雄激素耗竭 或雄激素拮抗作用在临床上成功地减弱了前列腺癌在其初始阶段的生长。然而，大多数接受抗雄激素治疗的患者最终会转变为“激素难治”状态，这种状态通常具有攻击性并且经常致命。AR 靶基因的上调也发生在过渡阶段。前列腺特异性抗原 (PSA) 的血清水平升高伴随激素难治状态的发展。因此，增强 AR 介导的雄激素信号传导似乎预示着肿瘤进展的开始，尽管其分子基础在很大程度上仍然难以捉摸。
AR 是核类固醇受体基因超家族的成员，并作为激素依赖性转录因子。通过配体结合激活 AR 在转录上控制靶基因的表达。与其他成员一样，AR 在功能和结构上分为五个域，A-E。受体蛋白中间最保守的 C 结构域编码 DNA 结合结构域，而 C 末端 E 结构域包含激素/配体结合结构域 (LBD)。N 端 A/B 结构域和 LBD 承担反式激活功能，对接转录辅助调节子或辅助调节子复合物进行配体依赖性转录调节。随着肿瘤的转变，它们产生 AR 突变，导致对类固醇激素和合成配体的反应改变，包括对雄激素拮抗剂的抗性。在激素难治性患者的前列腺肿瘤中发现的大多数点突变已在 AR LBD 中定位。由于 LBD 中的疏水口袋特异性识别和捕获雄激素和 AR 配体，因此推测 LBD 中突变的氨基酸残基，特别是构成口袋的基序中的氨基酸残基会损害激素/配体识别的特异性。事实上，在体外细胞培养中，这种人类 (h)AR 点突变体显示出对其他类固醇激素和雄激素拮抗剂的获得性反应。LBD 中苏氨酸 877 点突变为丙氨酸 (T877A) 是前列腺肿瘤中最常见的突变之一。值得注意的是，在激素难治性患者中发现的 hAR 点突变体在反式激活方面表现出过度活跃，因为这些突变体对内源性非雄激素类固醇激素以及临床使用的 AR 合成拮抗剂过敏。除了 AR 突变体的异常功能亢进，来自肿瘤细胞和周围非肿瘤细胞的细胞信号也有助于前列腺肿瘤进展。基质和前列腺上皮分泌的生长因子与激活的 AR 信号协同作用，在体外刺激前列腺癌细胞生长。然而，在动物模型中，这些体液因子的作用仍有待研究。已经建立了几种小鼠前列腺癌模型，并且在表达 T 抗原基因的转基因鼠前列腺癌模型 ( TRAMP ) 系之一中观察到自发性前列腺肿瘤发生。然而，在这种小鼠模型中无法重现前列腺肿瘤发展和发作中的雄激素依赖性。

为了确定异常增强的 AR 信号传导是否在体内刺激前列腺癌生长，我们通过 Cre-ER T2介导的时空控制靶向体细胞选择性地将成年小鼠前列腺上皮细胞中的 AR T877 突变为 A，从而在小鼠中建立了一个实验性前列腺癌模型。诱变。这种 AR 点突变小鼠 ( AR pe-T877A/Y ) 表现出肥大的前列腺，但未能发展出前列腺肿瘤。在切除睾丸的 AR 突变体中，羟基氟他胺 (HF)，一种临床使用的雄激素拮抗剂，可刺激前列腺生长。通过将 T877A 突变引入成人TRAMP的前列腺上皮细胞转基因小鼠，肿瘤形成时间缩短，肿瘤生长受到刺激。在这些小鼠中对肿瘤生长因子进行基因筛查后，我们发现了一种加速肿瘤生长的非经典 Wnt 配体 (Wnt-5a)。重要的是，增强的 Wnt-5a 表达也存在于前列腺癌患者的肿瘤细胞中，但不存在于良性前列腺增生患者的前列腺细胞中。这些发现表明，AR 中的基因突变 T877A 通过刺激非经典 Wnt 信号通路促进前列腺肿瘤的生长。

结果将人类 T877A AR 突变引入小鼠 AR 基因位点。
为了创建位于 AR LBD 中的条件突变体 (T877A)，我们将包含AR外显子 6-8 的小鼠基因组 DNA 片段替换为包含相应人类编码序列的 DNA 片段，其两侧是三个 loxP 位点，然后是编码T877A 突变（图1A）。敲入和floxed（L2）小鼠系（AR flox / Y） ，其中Neo盒通过Cre介导的胚胎干细胞切除术被删除，没有明显异常并且正常生长（图1）。 S1 A）。前列腺表型正常，显示出大量出芽和分化为柱状腺上皮。然而，前列腺的大小在 10 周龄时小于野生型小鼠（图 S1 C和D）。在 20 周评估时，与前 (AP) 和背 (DP) 前列腺和精囊 (SV) 相比，腹侧前列腺 (VP) 的生长延迟。AR flox/Y雄性具有生育能力，但其生殖活动减少。然而，较小的前列腺在结构上是完整的。由于前列腺的生长依赖于 AR 介导的雄激素信号传导，因此前列腺的表型很可能是AR flox/Y是由 AR 蛋白功能减退引起的。AR flox/Y显示AR mRNA 水平正常，但 AR 蛋白水平降低（图 S2 C和D）。因此，基因操作可能影响了 AR 蛋白的稳定性。由于雄激素生物合成的负反馈减少，血清睾酮水平上调（图S1 B）。因此，尽管AR flox/Y小鼠中的雄激素信号传导似乎减少但未显着受损，但我们得出结论，这种 floxed 小鼠系适合进一步研究。

图。1。



将 AR T877A 突变选择性引入成年小鼠的前列腺上皮细胞。（一）说明了插入AR T877A突变的靶向策略。该图显示了野生型AR基因组基因座、靶向载体、floxed AR T877A L3 和 L2 等位基因，以及在 Cre 介导的人类外显子 6-8 切除后获得的AR T877A等位基因 (L-)。B (BamHI)、Ev (EcoRV) 和 loxP 位点用箭头表示。T877A 突变位点用星号表示。( B ) AR pe-T877A/Y小鼠 ( n = 10) 和AR的腹侧前列腺 (VP) 和总前列腺 (TP)flox/Y小鼠 ( n = 10) 在 16、24 和 52 周龄时称重。AR pe-T877A/Y小鼠的腹侧前列腺叶比对照小鼠重约 1.5 倍（* P < 0.05，** P < 0.01，单向方差分析）。前部和背侧前列腺显示出相似的结果。误差线代表 SD。( C ) 16 周和 52周龄AR pe-T877A/Y小鼠和AR flox/Y小鼠在暗场解剖显微镜下的前列腺叶。AR T877A突变促进了前列腺叶的生长。( D ) 24 周龄AR的苏木精和伊红染色的腹侧前列腺pe-T877A/Y小鼠和AR flox/Y小鼠。
将 T877A AR 突变选择性引入成年小鼠的前列腺上皮细胞。然后，我们使用KLKB1-Cre-ER T2小鼠系和 T877A 小鼠系来生成前列腺上皮特异性 T877A 敲入。首先，使用通过Cre介导的切除诱导β-半乳糖苷酶基因的测试小鼠系证实了Cre的前列腺特异性切除。Cre 酶活性（Cre-ER T2系统）需要激活雌激素受体点突变体，该突变体仅对 ERα 部分激动剂他莫昔芬 (TAM) 敏感，但对内源性雌激素不敏感。在用 TAM 处理 5 天后，在前列腺中观察到 β-半乳糖苷酶的清晰染色（图 S2 A），但在其他测试组织中没有。然后我们越过了AR flox/Y小鼠与KLKB1-Cre-ER T2小鼠通过 Cre 介导的 loxP 位点切除将野生型 hAR LBD 的蛋白质表达替换为点突变 (T877A) hAR LBD (图1A ) , 生成KLKB1-Cre-ER T2 ; AR flox/Y鼠标线。然后，这些 16 周龄的小鼠用 TAM 处理 5 天以产生AR pe-T877A/Y，其中 AR T877A 在前列腺上皮细胞中选择性表达。这些小鼠没有表现出明显的异常并且正常生长。类似于AR flox/Y小鼠，AR pe-T877A/Y小鼠有生育能力，但生殖活动受损。在 20 只小鼠中的 15 只的前列腺基因组序列中可检测到 T877A 突变（图 S2 B）。AR pe-T877A/Y前列腺中的AR转录物和蛋白质的表达水平与 AR flox/Y 的表达水平无法区分（图 S2 C和D）。根据这些观察，我们得出结论，Cre-ER T2系统成功地在小鼠前列腺中选择性和诱导性地表达 AR T877A 突变体。

AR pe-T877A/Y小鼠表现出雄激素诱导的前列腺发育，没有可检测到的肿瘤发生。

AR pe-T877A/Y小鼠的前列腺表型与AR flox /Y 没有区别（图1C）；然而，与AR flox/Y对照小鼠（KLKB1-Cre-ER T2；未用 TAM 处理的AR flox/Y系）相比，直到 16 周，前列腺生长都得到了增强（图 1B ）。在AR pe-T877A/Y小鼠中观察到前列腺细胞的过度增殖，正如结合 BrdU 的细胞数量增加所证明的那样，而活化的 caspase-3（一种凋亡因子）的表达没有改变（图 S2 E）。AR pe-T877A/Y小鼠在 52 周（图 1C和D）或更晚时的组织学分析未检测到前列腺肿瘤。因为内源性睾酮水平显着上调（图S1 B），小鼠被阉割。去势的AR pe-T877A/Y小鼠的前列腺发育在 24 周龄时严重迟缓。VP（图 2 A和B）和总前列腺（TP）（图2A）通过 5α-二氢睾酮（DHT）治疗 3 周恢复。这种 DHT 反应在两个阉割者中都可见AR flox/Y和AR pe-T877A/Y小鼠。这些观察结果表明，这些细胞系的前列腺发育依赖于内源性雄激素。然而，T877A 点突变不足以引发肿瘤发生。

图 2。


AR pe-T877A/Y小鼠对激素和拮抗剂信号的异常前列腺生长反应。( A )将 24 周龄的AR pe-T877A/Y小鼠和AR flox/Y小鼠分为 8 组（每组n = 5 只）并用激素（DHT、HF、E2 或 BIC）治疗 3 周阉割或假手术后。然后切除前列腺并称重。去势的AR flox/Y小鼠的前列腺变性只能通过 DHT 来预防；然而，所有激素治疗对AR pe-T877A/Y小鼠的前列腺退化都有保护作用（* P< 0.05，单因素方差分析）。误差线代表 SD。BIC，比卡鲁胺；DHT，5α-二氢睾酮；E2, 17β-雌二醇；HF，​​羟基氟他胺。( B )激素治疗后去势AR pe-T877A/Y小鼠的典型腹侧前列腺。（C ）用指定激素处理的AR pe-T877A/Y小鼠腹侧前列腺的苏木精和伊红染色。AR pe-T877A/Y小鼠的前列腺小管结构通过用 HF 或 E2 治疗来维持。
AR pe-T877A/Y小鼠的前列腺生长受到雄激素拮抗剂和雌激素的刺激。

在前列腺癌的初始阶段，虽然细胞保留激素反应性，但患者会接受合成雄激素拮抗剂治疗，以减轻雄激素诱导的肿瘤发展。然而，经过几年的治疗，激素依赖性状态经常消失，编码 LBD的AR外显子中出现新的基因突变 。因此，我们询问AR pe-T877A/Y小鼠是否会产生与激素难治性患者相似的反应。用临床上使用的 AR 拮抗剂 HF 进行 3 周治疗，刺激了AR pe-T877A/Y小鼠的前列腺生长，但在AR flox/Y小鼠中没有。图 2 A和B )。同样，外源性 17β-雌二醇 (E2) 的高剂量（160 μg/d，3 周）明显刺激前列腺生长，而另一种 AR 拮抗剂比卡鲁胺 (BIC；Casodex) 没有引起刺激作用（图2C）。因此，似乎AR pe-T877A/Y小鼠可能重现了激素难治性前列腺癌患者的异常反应。
前列腺癌实验小鼠模型中 T877A AR 突变诱导的加速肿瘤发生。

因为AR pe-T877A/Y小鼠即使在 1 年后也未能发展出可检测的前列腺肿瘤，我们在已知的实验性前列腺癌模型 ( TRAMP ) 中测试了 T877A AR 突变对前列腺肿瘤生长的影响。该小鼠系自发发展为前列腺癌，其中的肿瘤类似于在人类中看到的肿瘤。TRAMP小鼠与KLKB1-Cre-ER T2杂交；AR flox/Y小鼠产生TRAMP；KLKB1-Cre-ER T2；AR flox/Y鼠标线。在 16 周龄时，这些小鼠用 TAM 治疗 5 天，以将 T877A 突变引入前列腺。该小鼠品系（TRAMP-AR pe-T877A/Y）比TRAMP-AR flox /Y小鼠表现出更早的前列腺肿瘤生长（图 3A和C）。前列腺肿瘤的快速生长导致所有TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠在 36 周龄左右死亡。相反，TRAMP-AR flox/Y小鼠存活超过 48 周（图 3A ）。一致地，几个已知的 AR 靶基因（Probasin、PSP94、Fkbp51、Stk37）的表达水平 –来自TRAMP-AR pe-T877A/Y的前列腺肿瘤（图31 ）比TRAMP-AR flox/Y的前列腺肿瘤更高（图3D）。然而，未检测到肿瘤相关基因表达水平的显着变化（图S3）。组织学上，TRAMP-AR pe-T877A/Y 小鼠在 19 周时的前列腺肿瘤表型与TRAMP -AR flox/Y小鼠的前列腺肿瘤表型无法区分（图3B）。
图 3。


在前列腺癌的实验模型中， AR T877A小鼠突变诱导了肿瘤生长的早期发生。( A ) AR T877A突变对前列腺肿瘤生长的影响。TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠和TRAMP-AR flox/Y小鼠分为 11 组（每组n = 5）。从 18 到 50 周龄，每组小鼠每 3 周处死一次并称重前列腺。TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠早期发展为前列腺肿瘤，肿瘤迅速生长，直到动物在 36 周时死亡（** P < 0.01，单向方差分析）。TRAMP-AR flox/Y小鼠在 24 周后出现前列腺肿瘤，大多数小鼠存活超过 50 周。黑柱表示TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠，白柱表示TRAMP-AR flox/Y小鼠。NS，没有生存。( B ) TRAMP-AR pe-T877A/Y和TRAMP-AR flox/Y小鼠 19 周龄时苏木精和伊红染色的前列腺叶。TRAMP-AR flox/Y和TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠的腹侧前列腺由缺乏正常腺体前列腺结构的未分化恶性细胞片组成。( C ) 27周龄 TRAMP-AR的外观pe-T877A/Y小鼠和TRAMP-AR flox/Y小鼠。( D ) TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠和TRAMP-AR flox/Y小鼠中 AR 靶基因的定量 RT-PCR 分析。与TRAMP-AR flox/Y 相比，TRAMP - AR pe-T877A/Y 前列腺肿瘤中基因表达水平的比率代表了五个独立实验（** P < 0.01，学生t检验）。

为了测试TRAMP-AR pe-T877A/Y中前列腺肿瘤的早期发病和快速生长是否是肿瘤自主和/或雄激素依赖性的，我们将肿瘤移植到裸鼠的前列腺腹叶中（图 1）。 S4 A )。前列腺肿瘤继续生长。在移植后 8 周，来自TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠的肿瘤比来自TRAMP-AR flox/Y小鼠的肿瘤大三倍（图 S4 B - D）。当这些小鼠被阉割时， TRAMP-AR flox/Y小鼠比TRAMP-AR pe-T877A/ Y 小鼠的这种肿瘤生长更减弱小鼠（图 S5 A和B），表明肿瘤生长依赖于激活的 AR 功能。根据这些发现，我们推测TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠的肿瘤进展可归因于内源性激素诱导的 AR 功能亢进。此外，我们假设在前列腺中表达的某些因子增强了携带 T877A 突变的前列腺肿瘤的生长。

非经典 Wnt 配体在实验性前列腺癌中充当激活剂。

我们推断 AR 突变体在肿瘤生长中的功能通过与前列腺生长因子和/或细胞因子信号通路的串扰而增强。几个主要的候选因子（Fgf10、Stat3、Tab2、Wnt-5a）已被证明可在体内和体外调节前列腺生长，通过穿越TRAMP进行了检查；KLKB1-Cre-ER T2；AR flox/Y小鼠品系与缺乏候选因子的品系 ( 32 – 37 )。然后用 TAM 治疗 16 周龄的后代以引入 AR T877A突变。在测试的因素中，Wnt-5a 的单倍体不足（33) 显着中止了TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠中前列腺肿瘤的早期发病和早期致死率，并赋予了与TRAMP-AR flox/Y对照线中观察到的相似的前列腺生长（图 4A ）。因此，Wnt-5a 似乎是 AR 介导的前列腺癌生长的激活剂。Wnt-5a 是参与非经典 Wnt 信号通路的配体，它还共同调节 PPARγ 的反式激活功能 ( 33 )。在研究与 AR 功能亢进相关的 Wnt-5a 作用期间，发现 LNCaP 细胞内源性表达 Wnt-5a（图 4 B和图 S6）。当 Wnt-5a 被击倒时（图 4 B和图S6 )，配体AR的反式激活功能明显降低(图4C)。一致地，LNCaP 细胞的雄激素依赖性增殖通过这种 Wnt-5a 敲低而减弱（图 4 D和图 S7）。
图 4。



Wnt-5a 是一种非经典 Wnt 配体，是具有AR T877A突变的前列腺肿瘤的激活剂。( A ) Wnt-5a +/-的前列腺权重；TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠和Wnt-5a +/-；TRAMP-AR flox/Y小鼠。将小鼠分为九组（每组n = 5）。每2周切除每组小鼠的前列腺并称重。Wnt-5a +/+ ; TRAMP-AR pe-T877A/Y或Wnt-5a +/+；TRAMP-AR flox/Y小鼠也作为对照进行分析。请注意，即使在 26 周龄时，Wnt-5a +/-；TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠未发生明显的前列腺肿瘤（* P < 0.05，** P < 0.01，单向方差分析）。( B ) 所示 siRNA 在 LNCaP 细胞中对人 Wnt-5a 的效率。在转染 siRNA 48 小时后，用 α-Wnt-5a（R&D Systems）或 α-肌动蛋白（Santa Cruz Biotechnology）进行蛋白质印迹。（C和D）Wnt-5a 敲低对 LNCaP 细胞中 AR 介导的雄激素信号传导的衰减。转染 siRNA 的 LNCaP 细胞进行转染以进行报告荧光素酶测定（C) 或细胞增殖试验 ( D )。AR 配体与细胞一起孵育 12 小时（C）或 6 天（D）。每个点代表三个独立实验的平均值 ± SD（* P < 0.05，** P < 0.01，双向方差分析）。

人类前列腺肿瘤中的异常 Wnt-5a 表达。

为了解决 Wnt-5a 对人类前列腺癌的影响，我们检测了 Wnt-5a 在人类前列腺中的表达。在良性前列腺增生中，通过免疫组织化学分析，Wnt-5a的表达水平是正常的（图5B）。相反，与周围正常组织相比，恶性前列腺肿瘤（数据集 S1）表现出异常上调的 Wnt-5a 表达（图 5 A和B）。基质-上皮相互作用和由这些相互作用产生的生物活性因子已被证明在癌症进展中很重要。在这里，我们检查了癌细胞中的 Wnt-5a 是以自分泌方式还是以旁分泌方式起作用。通过免疫荧光分析，在癌细胞和基质细胞类型中均观察到Wnt-5a和AR蛋白的表达（图5C ）。然而，这两种因子的共定位表达主要在癌细胞中检测到（图5C ）。因此，癌细胞中的 Wnt-5a 效应可能主要以自分泌方式发生。这些发现表明 Wnt-5a 可以作为 AR 介导的雄激素信号传导的激活剂，在人类前列腺的某些病理条件下促进前列腺生长，如在小鼠中所见。
图 5。


人前列腺癌中的异常 Wnt-5a 表达。( A ) Wnt-5a 表达是通过对诊断为良性前列腺增生和前列腺癌患者的前列腺进行免疫染色来检测的。( B )增生的上皮和间质中Wnt-5a阳性细胞的数量，前列腺肿瘤正常区域的上皮和间质，前列腺肿瘤中的癌细胞和间质(数据集S1 )。统计了 9 名良性前列腺增生患者和 37 名前列腺癌患者（* P < 0.05，单因素方差分析）。( C) Wnt-5a（绿色）和 AR（红色）的免疫荧光双染色表明 Wnt-5a 和 AR 主要共定位于人前列腺癌的癌细胞中。这种共定位在前列腺肿瘤的基质细胞中不存在。从三个独立的实验中显示了来自被诊断患有良性前列腺增生和前列腺癌的患者的前列腺的代表性图像。

讨论

已经开发了前列腺癌小鼠模型以提高对前列腺癌发生的分子基础的理解，并探索前列腺癌患者的治疗方案。一些模型限制是固有的，因为前列腺结构和肿瘤的主要区域/细胞在人类患者和小鼠模型中并不相同。尽管如此，已通过小鼠遗传方法测试了致癌和抗癌基因对前列腺肿瘤的影响。在这些候选因素中，AR 是最受关注的，因为它涉及前列腺癌的所有阶段。雄激素作用对于前列腺的发育和功能是必不可少的，并且对肿瘤发生有刺激作用，显然是通过 AR 发挥作用的。此外，即使在转变为雄激素非依赖状态后，AR 也被认为是前列腺癌的关键因素。无论 AR 在雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌中的功能如何，由于 AR 在前列腺发育中的先天作用，评估 AR 功能的小鼠模型一直不可用。为了避免这个困难，我们引入了一种改良的 Cre-loxP 系统，以选择性地将点突变引入成年小鼠前列腺中的 AR LBD（AR pe-T877A/Y老鼠）。这种突变 (T877A) 常见于雄激素非依赖性患者的前列腺肿瘤。

即使在 1 年后， AR pe-T877/Y小鼠的前列腺中也无法检测到瘤形成，这表明导致 AR 过度活跃的单个突变不足以引发前列腺肿瘤发生。因此，正如文献中已经预测的那样，在小鼠中出现功能亢进的 AR 前列腺肿瘤似乎需要至少一个额外的因素。在我们最初的试点实验中，我们试图比较Pten +/-（由日本福冈九州大学的 A. Suzuki 慷慨提供）和TRAMP小鼠模型系之间的 T877A 突变对前列腺肿瘤发生的影响，发现没有显着差异在肿瘤的发生和进展中Pten +/- 30 周龄时的遗传背景。相比之下，将AR pe-T877/Y系与TRAMP系交叉始终增强TRAMP小鼠的肿瘤发展，更重要的是，雄激素依赖性变得明显。因此，TRAMP-AR pe-T877/Y系构成了一种独特的雄激素依赖性前列腺癌小鼠模型，将有助于探索从雄激素依赖性转变为难治状态的分子基础。

TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠证明，T877A 突变显着缩短了肿瘤发展的开始时间并加速了肿瘤的生长。TRAMP-AR flox/Y系的平均寿命大于 48 周，而TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠的平均寿命小于 36 周。TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠死于大小与其总体重相当的肿瘤。此外，来自TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠的移植前列腺肿瘤的生长速度是裸鼠对照线的三倍。这些发现表明，前列腺因子增强了驱动前列腺肿瘤进展的 AR 功能亢进的作用。

使用TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠的微阵列分析和定量 PCR 验证 ，我们观察到肿瘤基因如 TERT 和 Cdk2 和肿瘤抑制基因 NKX3.1、ATBF1的预期改变, 和 p21 (图 S3 )。然而，在该分析中，我们无法确定在此阶段导致肿瘤生长的新候选基因。因此，我们选择了一种遗传筛选策略，该策略可以跨越缺乏细胞增殖调节剂的小鼠。Wnt-5a 被鉴定为TRAMP-AR pe-T877A/Y中前列腺肿瘤早发和快速生长的激活剂老鼠。我们还发现人类前列腺肿瘤中 Wnt-5a 的表达异常上调。Wnt-5a 是一种参与细胞增殖和分化的非经典 Wnt 配体，特别是在胚胎发育过程中。

可以想象，异位 Wnt-5a 表达增强癌细胞增殖，因为与前列腺癌患者的正常组织相比，Wnt-5a 蛋白在肿瘤中异常上调。根据这一观察结果，Wnt-5a 能够在瞬时表达测定中共同调节 T877A 突变的 AR 的反式激活功能并促进 LNCaP 细胞的增殖。连同在癌细胞中 Wnt-5a 与 AR 的有限共定位的发现，Wnt-5a 可能通过癌细胞中的自分泌方式增强 AR 介导的雄激素信号传导，从而促进肿瘤发生。也可以假设 Wnt-5a 表达实际上是由上游因素诱导的，特别是在初始阶段和向激素难治状态的转变。这些上游因素在前列腺肿瘤进展中可能特别重要。在这方面，

材料和方法鼠标模型的生成。

从 TT2 胚胎干 (ES) 细胞基因组文库中分离出基因组AR DNA 片段。通过插入具有两个 loxP 位点的野生型AR外显子 6-8 的人 cDNA 和AR T877A外显子 6-8 的人 cDNA 以及阳性 Neo 选择性标记 (Neo r ) 来创建靶向载体（图1A）。将胸苷激酶基因 (HSV-tk) 盒连接到靶向载体的 5' 端用于阴性选择。靶向 TT2 ES 克隆在使用 Southern 分析进行阳性-阴性选择后被选择，然后与来自 CD-1 小鼠的单个八细胞胚胎聚集。floxed AR 小鼠（ARflox/Y )，最初在 C57BL/6 和 CBA 遗传背景的杂交种上，经过四代回交到 C57BL/6J 背景中。这些小鼠与在人PSA启动子控制下表达他莫昔芬依赖性 Cre-ER T2重组酶的 KLKB1-Cre-ER T2转基因小鼠交配，使我们能够选择性地将 AR T877A 突变引入完全分化的前列腺上皮细胞中。成年小鼠（ 23只）。如所述对6周龄小鼠进行他莫昔芬给药[每日注射(1mg/d)，持续5天]。为了生成Wnt-5a +/- / TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠，我们首先交配KLKB1-Cre-ER T2；带有TRAMP转基因的AR flox/Y小鼠[C57BL/6-Tg (TRAMP) 8247Ng/J；杰克逊实验室]老鼠。然后我们将TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠与 Wnt-5a 缺陷杂合子小鼠杂交。所有小鼠均按照东京大学动物护理和使用委员会批准的方案进行饲养。

前列腺形态分析。

将小鼠完全麻醉，取出腹侧、前侧和背侧前列腺叶，称重，并在暗视野解剖显微镜下检查。然后，用4%多聚甲醛固定前列腺组织并包埋在石蜡中。切片 (8 μm) 用苏木精和伊红染色用于组织学检查。有关免疫组织化学、RNA 制备和实时 RT-PCR 的方法，请参阅SI 材料和方法。

阉割和激素替代。

对 24 周大的小鼠进行去势或假手术，以及 DHT (160 μg/d)、HF (160 μg/d)、E2 (160 μg/d) 或 Casodex (BIC) 的缓释颗粒(4.1 μg/d) (Innovative Research) 在颈后肩胛骨区域皮下植入。3 周后，切除腹侧前列腺，称重并检查。

前列腺癌的移植。

当TRAMP-AR pe-T877A/Y小鼠和TRAMP-AR flox/Y小鼠的前列腺肿瘤达到约 5,000 mg 时，切除肿瘤并在 10% 体积的生理盐水中切碎。将一定体积（0.05 mL）的切碎组织注射到裸鼠（BALB/c，Scl-nu/nu）的腹侧前列腺叶中。移植后8周切除前列腺并称重。

统计分析。

对于所有图表，数据表示为平均值 ± SD。使用单向方差分析或双向方差分析确定统计差异，然后使用 Fisher 保护最小显着性差异检验或学生t检验进行事后比较。统计显着性显示为 * P < 0.05 或 ** P < 0.01。