使用明场显微镜对未标记样品进行光学切片

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摘要
明场 (BF) 光学显微镜是一种传统的生物成像工具，最近在评估标本形态期间进行了深度辨别测试；然而，现有方法需要专用仪器或广泛的计算机建模。我们报告了一种在 BF 显微镜中进行三维 (3D) 成像的直接方法，适用于无标记样品，我们在相干状态下使用科勒照明和传统的数字图像处理滤波器来实现光学切片。通过可视化真菌、动物组织和植物样本并与光片荧光显微镜成像进行比较，我们证明了该方法的准确性和适用性，展示了标准显微镜如何成为一种有效的 3D 成像设备。

经典的明场 (BF) 显微镜是任何生物实验室不可或缺的工具，通常用于评估染色二维 (2D) 样品中的细胞或组织形态。然而，在没有染色的情况下，相位对象的 BF 图像显示的对比度很小。几种成像方式解决了这一限制，从现在广泛使用的早期替代方案（例如，Zernike 相位对比和微分干涉对比）到允许对复杂样品场进行定量测量的最新进展（例如，定量相位对比）。

尽管存在缺点，但 BF 仍然具有吸引力，因为它是一种简单、快速且廉价的显微镜方法，与荧光显微镜相比，光损伤和光毒性大大降低。BF 中的三维 (3D) 成像是通过将从不同角度获取的多个图像处理成单个重建或使用深度学习来预测 3D 荧光信号获得的，尽管有专门的仪器或广泛的计算机需要建模。

从广义上讲，从相应的输出图像重建输入对象构成了显微镜中众所周知的逆问题。反卷积是解决此问题的一种标准方法，通常分析傅里叶域中的图像，并已成功应用于 2D 中的 BF。在这里，我们介绍了明场显微镜 (OSBM) 中的光学切片，这是一种基于在真实空间中分析相位物体的高对比度 BF 图像的 3D 图像重建方法。

结果在具有科勒照明的 BF 中（图 1 A），降低聚光镜的数值孔径 (NA)，建立相干状态（NA聚光镜= 0)。然而，通过引入接近景深的散焦量，我们发现 BF 成像与地面实况很好地对应（图 1 C和SI 附录），这表明可以从 BF 中提取准确的样本信息。

图。1。


OSBM的原理。（一）我们的高炉显微镜设置示意图，显示照明和散射光线（灰色和绿色，分别）。镜头被描绘为双箭头。( B ) BF pPSF 的图像，使用参考文献9中的公式 1 计算：λ = 450 nm，n = 1.0，NA物镜= 0.1；视野（) OSBM（圆盒）的数字管道和活的T. atroviride样本的结果图像。( E ) D （红色）中显示的 OSBM 的“最终图像”与相应的 LSFM 图像（绿色）的叠加。

因此，确定了一个逆成像问题，其中具有轴向强度梯度的 BF 图像堆栈构成了输出信号。我们通过使用标准数字处理滤波器 ( 11 )找到这些梯度源的轴向位置来重建输入 3D 对象。因此找到的点集对应于组成样本的散射结构。

OSBM 程序包括在 Köhler 照明 (ς = 0.1 至 0.2) 下操作 BF 显微镜，捕获未染色样品的z堆栈图像，并将以下数字管道应用于图像（图1D）。首先，从原始 BF 图像中过滤掉大的空间结构。其次，通过执行成对图像减法计算z梯度，然后进行高斯平滑。最后，应用一个过滤器来突出小而明亮的特征（例如白色礼帽）。) 对应物，使用光片荧光显微镜 (LSFM)。OSBM 产生的无背景、轴向定位的斑点与 LSFM 产生的斑点有很好的重叠（图 1 E）。

为了演示使用 OSBM 的 3D 成像，我们首先考虑一个活的丝状网络 ( T. atroviride )，其中散射结构定位良好并且大部分彼此远离（与灯丝直径相比）。OSBM 的应用导致从模糊（原始 BF）到清晰（最终）图像的戏剧性转变（图2A）。在 OSBM 和 LSFM 之间发现了极好的一致性（图 2 A和B），能够对菌丝结构进行适当的 3D 渲染（图 2 C和电影 S1）。由于 OSBM 不使用窄聚焦激光束，因此可以在整个视野范围内产生清晰的图像，从而补充 LSFM。

图 2。



测试样品的 OSBM 成像并与 LSFM 进行比较。( A - C ) 真菌样本。( D - F ) 澄清的血管样本。( A和D ) BF、OSBM 和 LSFM 的最大强度投影 (MIP) 图像。（B和E ）分别显示在A和D中的 OSBM（红色）和 LSFM（绿色）的合并图像。（C和F）从相应的OBSM光学截面获得的三维图像。C和F的视场，1,495 × 1,495 × 1,016 μm 3和 1,495 × 1,495 × 1,128 μm3，分别。

电影 S1。


假色，T. atroviride 样品的 OSBM 图像显示在正文的图 2C 中。视野，1495×1495×1016 μm 3。

接下来，我们测试了具有连续散射结构的样本，即光学透明的血管（图2D）。该组织的 OSBM 图像是点画式的，其中点的集合提供了组织边界和褶皱等结构的清晰定位。OSBM 和 LSFM 图像之间的比较显示了整体样品形态的良好对应（图 2 D和E）。3D 重建如图2F和电影 S2所示。
电影 S2。


正文图 2F 所示血管样本的假彩色 OSBM 图像。视野，1495×1495×1128 μm 3。

我们应用 OSBM 来可视化具有不同光学透射率的未经处理的样品。一层浸在水中的洋葱表皮细胞大部分是透明的，可以在 BF 中实现最佳可视化。因此，我们在纵向 ( x - z ) 和横向 ( y - z ) 视图（图 3 A）中观察到特征洋葱细胞形状，其中周壁曲率很容易识别。洋葱细胞的 OSBM-LSFM 比较（电影 S3）显示了 OSBM 在没有荧光的地方的良好匹配和一致的细胞壁成像，强调了 OBSM 和 LSFM 之间的互补性。由于洋葱细胞壁厚约为 6 μm ( 13)，OSBM 可以检测仅几微米厚的孤立半平面散射结构（使用 10 倍物镜）。最后，我们考虑了具有显着光学不透明度的拟南芥幼苗。通过与 LSFM 比较，OSBM 显示了细根毛和面向物镜的粗根表面的适当 3D 成像（图 3 B和电影 S4）。对于光学厚的生物样品，使用红外光应该有助于改善 OSBM 成像（SI 附录图 3。



洋葱皮和植物根部的 OSBM 成像。( A ) OSBM 应用于一层洋葱表皮，沿x–y（左）、y–z和x–z（中）显示 MIP 图像。y–z和x–z图像对应于x–y投影中显示的白框。BF 最大强度投影图像显示（右）用于比较。( B ) 未标记、未经处理的拟南芥根样品的成像。3D 渲染的视野，1,495 × 1,495 × 1,008 μm 3。
电影 S3。

用于皮肤洋葱样本的 OSBM（绿色）和 LSFM（红色）的 yz MIP 图像叠加集。OSBM 切片始终显示细胞形状，即使在荧光信号较弱或不存在的地方也是如此。每个 MIP 图像对应于体积为 36.5 μm × 2111 μm × 1008 μm 的 ROI，针对不同的 x 位置获得。视野，2111×1008 μm2；图像之间的分离，Δ× = 73 μm。

电影 S4。


正文图 3B 所示植物根部样本的 OSBM 结果的 3D 视图。视野，1495×1495×1008 μm 3。

OSBM 的一个限制来自 pPSF 的对比度反转。当两个散射结构轴向连续时，​​它们会在 BF 图像中产生重叠的过渡区域，从而阻碍正确的对象定位。与点状结构 ( I ∝ r 6 ) 相比，这种效应预计会在强散射物体（如灯丝）（散射强度I ∝ r 3，其中r是灯丝的半径）上显着。在我们的实验中，我们估计散射结构之间的轴向距离低于 70 μm（40 μm）会导致菌丝（脑膜组织）样本的成像不正确。

总之，OSBM 擅长对光学薄物体和具有低轴向空间密度的结构的样本边界进行成像。作为传统 BF 显微镜的数字扩展和荧光显微镜技术的补充，OSBM 为 3D 生物成像提供了一种简单、直接且无模型的替代方案。

材料和方法SI 附录中提供了详细说明

使用 CLARITY ( 14 )处理脑膜组织；使用自制装置 ( 15 ) 和斐济 ( 16 ) 进行光学显微镜和数字图像处理