CTLA-4和IL-4多态性在病毒性肝癌中的关联

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背景

采用不同的生物信息学工具来确定这些多态性的致病性。从 HCV 诱导的 HCC 患者中收集样本，然后进行 DNA 提取和 ARMS-PCR 分析。

结果

本研究描述了巴基斯坦患者中与 HCV 介导的 HCC 相关的CTLA-4（细胞毒性T淋巴细胞抗原4）和IL-4（白介素4）基因中的危险因素等位基因，这些基因可能可用作 HCV （丙肝病毒）患者 HCC 的前期和早期诊断和预后的遗传标志物。

背景
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种由过量饮酒、肥胖和病毒感染引起的多因素原发性肝脏恶性肿瘤。在全球范围内，乙型和丙型肝炎病毒感染是 HCC 的主要原因。慢性 HBV 和 HCV 感染分别导致 44% 和 22% 的 HCC 病例。HCC 导致全球近 830,180 人死亡。在巴基斯坦，大约 70% 的 HCC 归咎于 HCV，而 HBV 是亚洲和太平洋国家 HCC 疾病的主要病因。
HCV促进促进HCC进展的细胞因子的产生。已在细胞因子中鉴定出与癌症相关的遗传多态性，这可能有助于它们靶向抗癌治疗。细胞因子IL-4参与调节各种重要的生物学功能，包括 B 细胞有丝分裂、向 IgE 的类别转换、细胞稳态和组织修复。在 T 细胞信号传导期间，IL-4促进 T 细胞分化。在癌症中，IL-4在肿瘤微环境中发挥作用，通过激活肿瘤相关或髓源性抑制细胞 (MDSC) 相关巨噬细胞来介导促肿瘤活性。与IL-4相比，CTLA-4CTLA-4作为 T 细胞信号传导的负调节剂。它存在于 T 细胞上并结合 B7-1 (CD-80) 和 B7-2 配体 (CD-86)。它诱导的变化直接停止 TCR 免疫突触并阻断 CD28 信号传导，从而下调 T 细胞与抗原呈递细胞的相互作用。靶向CTLA-4CTLA-4的抗体在临床上用作抗癌免疫治疗剂。
据报道， IL-4和CTLA-4的遗传变异与几种癌症有关，包括 HCC、结肠直肠癌和头颈癌 。最近的一份出版物指出，在埃及人群中， IL-4IL-4变体 (rs2243250) 与 HCV 诱导的 HCC 相关。以前，它的关联是在中国人群中描述的 。同样，在中国汉族人群和埃及人群中发现CTLA-4 rs231775 与 HCV 诱发的 HCC 之间的关联]。先前的研究已经描述了致病性单核苷酸多态性 (SNP) 对癌症患者临床结果的贡献。某些 SNP 的存在提高了某些治疗药物的疗效，从而提高了患者的存活率。例如，在 VEGFR1 受体中发现了遗传变异 rs9582036，它​​增加了贝伐单抗治疗后的患者存活率。同样，据报道，具有 KDR 基因 rs1870377 AA 基因型的 HCC 患者对一线治疗索拉非尼的反应更好。
在癌症中，CTLA-4介导的IL-4IL-4调节是免疫失调的原因。在 HBV 感染期间， CTLA-4的上调表达导致IL-4的活性增加，从而产生抗感染反应。在 HIV 感染期间，CTLA-4和IL-4多态性影响患者的治疗反应。同样，据报道CTLA-4和IL-4多态性也可诱导 HCC 进展。IL-4基因多态性与CTLA-4与 HCV 介导的 HCC 未在巴基斯坦人群中进行研究。目前研究的目的包括预测IL-4 -590 C/T（rs2243250）和CTLA-4  + 49 A/G（rs231775）的致病性以及IL-4 -590 C/T之间的关联研究（ rs2243250) 和CTLA-4  + 49 A/G (rs231775) 多态性与 HCV 诱导的 HCC。IL-4多态性位于启动子区域；因此，还估计了IL-4 -590 C/T 多态性对调节IL-4表达的潜在影响。预测和研究由于多态性导致的CTLA-4蛋白结构变化CTLA-4结构变化对HCC一线和二线治疗的疗效进行了研究。该研究确定了 HCV 诱导的 HCC 的推定的诊断前遗传标记，并提供了关于IL-4和CTLA-4遗传变异在 HCV 介导的 HCC 中的功能影响的见解。
方法计算机方法数据检索
IL-4和CTLA-4的SNP 是通过文献回顾 确定它们在几种疾病中的不可或缺的作用来选择的。有关IL-4和CTLA-4变体的信息分别从具有基因组组装“GRCh38:CM000667.2”和“GRCh38:CM000664.2”的 ENSEMBL 中检索到。ENSEMBL 和 RegulomeDB 用于获得IL-4 (+ 49 A/G) 和CTLA-4 (-590 C/T) SNP 的坐标，并在基因组组装 GRCH38.p13 上作图。访问蛋白质数据库以下载CTLA-4和IL-4的蛋白质结构。
单核苷酸多态性分析
使用以下六种工具预测IL-4 SNP（变体 ID：rs2243250）和CTLA-4 SNP（ID：rs231775）的致病性：SIFT、PolyPhen2.0、REVEL、MetaLR、MutationAssessor 和 CADD。SIFT 和 PolyPhen2.0 根据一级序列的同源性和相邻氨基酸之间的理化关系预测蛋白质功能变化。REVEL 整合了 SIFT、PolyPhen、MutationAssessor、MetaLR、REVEL 和 CADD 的预测分数，以对变异进行致病性预测。MetaLR 使用等位基因频率和逻辑回归整合变异有害性评分来预测错义变异的影响。MutationAssessor 利用进化保守知识在同源性的基础上预测蛋白质的功能变化。CADD 用于通过功能或进化保守数据预测 SNP 变体的有害性。Regulome DB 用于确定 SNP 的坐标、等级和得分。
转录调控预测
阿里巴巴2.0被用来预测转录因子结合位点的变化。HOPE项目分析用于确定蛋白质结构改变并预测由此产生的致病性。
原位诱变
从 Alphafold 数据库 (AF-P16410-F1) 中检索到CTLA-4的蛋白质三级结构。野生型CTLA-4结构的突变是通过 PyMol v4.0.2 的诱变工具引入的。CTLA-4的突变和野生型结构都被叠加以突出差异。
分子对接
从 PubChem 数据库下载 Avastin (PubChem 349,985,080) 和 Sorafinib (PubChem 216,239) 的化学结构。在 CB Dock 中完成了针对CTLA-4 (AF-P16410-F1) 的药物对接，并检索了 vina 评分和空腔大小。PyMOL 用于对接结构可视化。LigPlot（版本 v.1.4.5）用于可视化蛋白质和配体之间的氢键和疏水相互作用。
体外方法研究设计和患者选择
进行了一项回顾性病例对照研究，患者从巴基斯坦拉瓦尔品第联合军事医院招募。样本量 (N) 为 429，其中 213 名是 HCC 患者，216 名是对照患者。纳入标准设定为 HCV 感染的 HCC 患者，排除所有其他 HCC 患者。通过定量逆转录酶聚合酶链反应 (qRT-PCR) 对病毒载量进行量化，从而确认患者是否感染了 HCV。通过即时病毒 RNA 试剂盒 CE IVD ªAnalytik Jena 从患者血浆中分离 HCV RNA。TaqMan 探针用于在 iQ5 实时 PCR 检测系统 ªBio-Rad Laboratories 中对 HCV 进行定量。健康受试者用作对照。并使用适用于 Windows 的 G*Power 软件版本 3.1.9.2 进行验证。在获得受试者的书面同意后进行样本采集。该研究得到了巴基斯坦伊斯兰堡国立科技大学机构审查委员会委员会的批准（IRB No. 04-2019-03/06）。该研究是根据赫尔辛基宣言的原则进行的。
引物设计
Primer1  用于设计IL4 -590 C/T (rs2243250) 和CTLA4  + 49 A/G 基因的等位基因特异性引物组。对于CTLA4，用作内部对照的正向和反向引物序列分别是 CACAAGGCTCAGCTGAACCTGGATG（对于等位基因 A）和 ACAGGAGAGTGCAGGGCCAGGTCCTAGT（对于等位基因 B）。正向和反向外引物分别为 GTGGGTTCAAACACATTTCAAAGCTTCAGG 和 TCCATCTTCATGCTCCAAAAGTCTCACTC。对于IL4，用作内部对照的正向和反向引物序列分别为 TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC 和 GCCTCCCAACCATTCCCTTA。而ACACTAAACTTGGGAGAACATTGTC用于C等位基因检测，ACACTAAACTTGGGAGAACATTGTT用于T等位基因检测。
DNA提取使用标准化的苯酚-氯仿方案从血液中分离总 DNA。
四扩增难突变系统聚合酶链反应（Tetra ARMS-PCR）
Tetra ARMS-PCR 用于鉴定基因中的CTLA-4  + 49 A/G 和IL-4 -590 C/T 多态性。通过加入 5X 缓冲溶液 (4μL)、2 mM dNTPs (2μL)、Taq 聚合酶 (0.5 U)、引物（各 10 pmol）、蒸馏水 (10.9 μL) 和 DNA 模板 ( 1 微升）。PCR 中使用的条件是：变性（95°C 4 分钟）、25 个变性循环（95°C 45 秒）、退火（58°C 45 秒）和延伸（72°C 45 秒） ，和最终延伸（72 °C 5 分钟）。2%琼脂糖凝胶用于分析ARMS-PCR的PCR产物。在 PCR 产物旁边还加载了一个 100 bp 的梯子，用于比较大小。结果通过 Wealtec dolphin-doc 凝胶分析系统进行分析。
统计分析
Microsoft office 2016 Excel (Rehmond, WA, USA) 用于组织基因分型结果。使用 GraphPad Prism 软件 ver8.0.1 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) 测试结果的统计显着性。通过双向Fisher精确检验计算患者和健康对照中基因多态性的基因型分布及其相关强度（优势比，OR和相对风险，RR）。分别计算 Koopman 渐近分数和 Baptista-Pike 方法用于计算 OR 和 RR。小于 0.05 的概率被认为是显着的。
结果计算机预测CTLA-4 SNP + 49A/G的致病性
RegulomeDB 提供了变体的坐标、分数和等级（变体 ID：rs231775）。CTLA-4 +49A/G多态性等级 为5，描绘了CTLA-4中的转录因子结合位点和DNase峰。该 SNP 的得分为 0.13454，表明 SNP 的调节功能作用较小。ENSEMBLE将 CTLA-4  + 49A/G SNP 指示为错义变体。表1包括 RegulomeDB 注释评分和有关CTLA-4的染色体位置 (Chr:bp)、等位基因突变 (A)、氨基酸改变 (AA) 和坐标 (AA coord.) 的信息单核苷酸多态性。CTLA + 49A/G 多态性（变体 ID：rs231775）的计算机致病性预测结果为：SIFT“耐受”（得分：0.2）、PolyPhen“良性”（得分：0.009）、CADD“可能良性”（得分：0 )、REVEL “可能是良性的”（得分：0.007）、MetaLR “耐受”（得分：0）和 MutationAssessor “低”（得分：0.28）。总体而言，CTLA-4 SNP rs231775 被预测为“良性或非致病性” 。
表1 CTLA4和IL4 SNP的注释评分和染色体位置（Chr: bp）、等位基因突变（A）、氨基酸改变（AA）和坐标（AA coord.）

CTLA-4的HOPE结构改变分析

HOPE分析用于预测该SNP对蛋白质结构和功能的潜在影响。HOPE 预测CTLA-4 SNP（变体 ID：rs231775）突变（苏氨酸转化为丙氨酸）导致比野生型残基更疏水的小尺寸氨基酸残基的取代。丙氨酸的取代可能会影响CTLA-4与其他蛋白质的相互作用，并且由于 H 键的丢失，增加的疏水性可能会改变蛋白质的折叠。改变的氨基酸不位于保守区域，表明这种突变可能不是高度破坏性的。
CTLA-4变异对化疗药物疗效的影响
FDA 批准的索拉非尼是一线治疗药物，而阿瓦斯汀是 HCC 的二线治疗药物。两种药物通过 CB-Dock 与野生型和突变的 CTLA-4蛋白对接，分析 SNP 对CTLA-4与阿瓦斯汀和索拉非尼的结合能和相互作用的影响。表2描述了通过 CB-Dock 获得的结果以及不同对接结构的 Vina 分数和腔尺寸。分子对接结果表明，在 CTLA-4 的第 17 位引入丙氨酸代替苏氨酸会导致CTLA-4 -Avastin 和CTLA-4 -Sorfanib 复合物中添加共价键。Avastin 与CTLA-4 的结合由于产生了五个疏水键和两个氢键相互作用，这是可能的。氨基酸 Glu83、Val84、Ile102、Leu119 和 Asp123 参与非静电相互作用，而氨基酸 Arg75 和 Tyr127 与 Avastin 氢键结合。残基 Arg75 与 Avastin 的氧原子形成两个氢键，估计距离为 2.96 埃和 3.19 埃（图 1a）。CTLA-4  + 49A/G 多态性减少了氢键的数量并引入了共价键（Met3）（图 1b）。CTLA-4和索拉非尼模型复合物也发现了CTLA-4多态性的类似影响。索拉非尼与​​CTLA-4相互作用通过形成两个氢键（Thr82 和 Val84）和十个疏水相互作用（Cys85、Glu83、Ala86、Ser101、Asp100、Ile102、Asp123、Leu119、Tyr127 和 Arg75）。CTLA-4中的等位基因G取代导致四个疏水相互作用以及共价键的加入（图 1c和1d）。
表 2 CTLA4/IL4（蛋白质）和四羟基黄烷酮（配体）对接结果的 CB Dock 评分

图。1
通过 LigPlot 预测CTLA-4野生型/突变型与阿瓦斯汀和索拉非尼之间的分子相互作用。CTLA-4（野生型）和阿瓦斯汀复合物。 B CTLA-4（突变）和阿瓦斯汀复合物。C CTLA-4（野生型）和索拉非宾复合物。D CTLA-4（突变）和索拉非宾复合物。紫色线代表配体原子之间的相互作用。橙线描绘了蛋白质原子之间的相互作用。氢键以绿色虚线显示。红色尖刺半圆表示疏水相互作用。配体和氨基酸之间的紫线代表共价键
SNP 对IL-4致病性影响的计算机预测
RegulomeDB 将IL-4 SNP 排名为 4，表明转录因子结合位点和 DNase 峰值，0.60906 的分数表明 SNP 的高调节功能（表1）。阿里巴巴 2.0 转录位点分析估计由于IL-4 rs2243250 产生了两个额外的 MIG1 和 SP1 转录结合位点。SP1 位于负责增强子活性的 E1 区域内。这种 SP1 位点产生突变被认为对 E1 区域的正常功能没有影响，但需要更多的研究来得出任何结论。
HCV 诱导的 HCC 患者中 HCV 的病毒载量
通过 HCV 诱导的 HCC 患者血浆中的 qRT-PCR 分析确定 HCV 的病毒载量，以确保 HCV 感染。超过 800,000 IU/L 的病毒载量被认为是高病毒载量。在这项研究中，观察到 HCV 的高病毒载量，平均病毒载量和发现的标准偏差为 339,840,893.2 ± 1,092,261,683 IU/L。
HCV 相关 HCC 患者CTLA-4  + 49A/G和 IL-4 -590 C/T 基因型的比较
CTLA-4和IL-4多态性与 HCV 诱导的 HCC 致病性的关联通过 ARMS-PCR 在 213 个患者样本中进行了评估。结果表明，CTLA-4基因型 AG（62.9%）的患病率高于 GG 基因型（37.1%）（表3）。OR 和 RR 评分表明，具有 AG 基因型的个体发生 HCV 诱导的 HCC 的风险更高（< 0.0001）。IL-4基因型 CC 和 CT 与 HCV 诱导的 HCC 相关（< 0.0001）。然而，获得的 RR 和 OR 值表明 CC 是危险因素基因型，CT 是 HCV 介导的 HCC 的保护基因型（表3）。
表3 HCV诱导的HCC患者和对照组CTLA4+49A/G和IL4-590C/T多态性的基因型频率

HCV 相关 HCC 患者 CTLA-4 + 49A/G 和 IL-4 -590 C/T 基因型的性别比较

基于性别的CTLA-4  + 49A/G 和IL-4 -590 C/T 基因型分析显示CTLA-4的 AG 和 GG 基因型与疾病显着相关。发现两性中的 AG 基因型是致病性的，而 GG 基因型则表明具有保护性（表4）。同样，基因型 CC 和 CT 在女性和男性中都与 HCV 诱导的 HCC 显着相关。两种性别的 CC 基因型都被认为是危险因素，而 CT 被证明是保护性的（表4）。
表 4 HCV 诱发的 HCC 患者与对照组 CTLA4 + 49A/G 和 IL4 -590C/T 多态性基于性别的基因型频率比较

HCV 相关 HCC 患者 CTLA-4 + 49A/G 和 IL-4 -590 C/T 基因型共存的关联

在本研究中，还评估了CTLA-4和IL-4基因型共存对 HCV 介导的 HCC 患者的影响。基因型 GG ( CTLA-4 ) 和 TC ( IL-4 ) 共存在于 11.74% 的患者中，并证明与 HCV 介导的 HCC 显着相关。然而，OR 和 RR 表明它们的共存是保护性的。同样，发现基因型 CA ( CTLA-4 ) 和 TT ( IL-4 ) 在 8.45% 与疾病显着相关的患者中共存。与基因型 GG ( CTLA-4 ) 和 TC ( IL-4 ) 相反，基因型 CA ( CTLA-4 ) 和 TT ( IL-4 )) 被确定为风险因素。类似地，基因型 GA ( CTLA-4 ) 和 CC ( IL-4 ) 也被确定为风险因素，并在约 45% 的患者中共存（表5）。
表 5 CTLA-4 和 IL-6 共存基因型，以及它们在 HCV 诱导的 HCC 患者中的相对风险、优势比和 p 值

讨论
几个高风险国家的 HCC 发病率正在下降，但在低风险国家其发病率正在增加。有许多与 HCC 相关的改良风险因素会增加个体与 HCC 的关联，例如饮酒、吸烟或接触毒素。除了外在因素外，遗传多态性也被确定为主要贡献者。HCV 感染是导致 HCC 的主要原因之一。本研究旨在确定CTLA-4  + 49 A/G 和IL-4 –590 C > T 多态性是否与 HCV 诱导的巴基斯坦 HCC 患者相关。另一个目的是评估这些多态性对 HCC 的潜在致病贡献。
IL-4和CTLA-4 SNP 分别定位于启动子区和蛋白质编码区。RegulomeDB 分析表明IL-4 SNP 的可能调控作用和转录因子结合位点，而CTLA-4多态性的基因调控作用估计为低。CTLA-4 SNP 表示为错义变体，该SNP 的致病性通过计算机 SNP 分析工具估计：SIFT、PolyPhen2.0、CADD、REVEL、metaLR 和 MutationAssessor。每个工具的得分将CTLA-4  + 49 A/G 和IL-4 –590 C/T SNP 分为耐受或良性类别。
来自文献的证据表明CTLA-4  + 49 A/G 变体与许多疾病有关，例如类风湿性关节炎、白塞病、格雷夫斯病、糖尿病、甲状腺疾病和结肠直肠癌癌症。然而，缺乏关于CTLA-4  + 49 A/G 多态性与巴基斯坦人群中 HCV 诱发的 HCC 关系的信息。在中国人群中进行的一项研究得出结论，CTLA-4  + 49 A/G 与 HBV 诱发的 HCC 相关。CTLA-4多态性 rs3087243 G > A 也显示与中国东部汉族人群中 HBV 诱发的 HCC 相关。CTLA-4多态性连同 IL-10 和 TNF-α 也报告与 HCC相关。在本研究中，CTLA-4  + 49 A/G 多态性被确定为巴基斯坦 HCV 诱发 HCC 的潜在危险因素。发现基因型 AG 在 HCV 诱导的 HCC 患者中的频率很高，而对照样本中的主要基因型是 GG。发现基因型 GG 对 HCV 诱导的 HCC 患者具有保护作用。
CTLA-4 + 49 中的等位基因 G 导致苏氨酸被丙氨酸取代。CTLA-4野生型和突变蛋白与索拉非尼和阿瓦斯汀的分子对接表明丙氨酸取代在CTLA-4和药物之间产生了额外的共价键。配体和蛋白质之间形成共价键是不可逆的，并且相互作用非常强。在大多数自然生物系统中，非共价相互作用是典型的]，与共价键相比，这些相互作用是弱且可逆的。突变的 CTLA-4之间存在共价键蛋白质和阿瓦斯汀和索拉非尼决定了强烈的相互作用。这进一步暗示了可能增强治疗影响的CTLA-4 GG 基因型的保护作用。
早先进行的研究提供了对IL-4多态性与 HCV 诱导的 HCC的可能作用的深入了解。当前研究的结果表明IL-4的 -590 C > T 突变与 HCV 诱导的 HCC 风险增加有关，并与包括IL-4在内的先前研究一致。来自 RegulomeDB 的 -590 SNP 注释分数表明该 SNP 的调节作用和转录因子结合位点的存在。阿里巴巴 2.0 分析进一步证实了这一发现。C > T 突变产生了 2 个额外的结合位点，MIG1 和 SP1。SP1 位于负责IL-4中增强子活性的 E1 区域内. 这种 SP1 突变被认为对 E1 区域的正常功能没有影响，但需要更多的研究来得出任何结论。这些突变可以改变正常的细胞功能，从而导致癌症的形成。这些发现支持 -590 C > T (rs2243250) 参与肝细胞癌。
IL-4 -590 C > T 多态性与癌症直接相关，并且与某些疾病有关，例如特应性哮喘和过敏性鼻炎和吸烟相关的癌症；然而，许多研究报告说，这种多态性与疾病发病率没有显着关联。一项与埃及人群相关的研究表明，IL-4 -590 C > T 多态性与 HCV 诱导的 HCC 相关。IL-4可以促进巨噬细胞和 Th 细胞的产生，进而支持 HCC 等癌症的进展。IL-4-590 C > T 多态性与高加索人群中的 HBV 和 HCV 诱导的 HCC 有关。在我们的研究队列中，发现基因型“CC”在 HCV 诱导的 HCC 患者中出现频率很高，并被指示为危险因素等位基因。
结论

在本研究中，CTLA-4  + 49 基因型 AG 和IL-4 -590 基因型 CC 被发现与 HCV 介导的 HCC 的致病性有关。基于年龄和基于性别的分析揭示了CTLA-4 AG 基因型与成人（20-39 岁）和两性之间的关联。同样，揭示了IL-4与 20-39 岁和 40-59 岁年龄组以及两种性别的关联。计算分析估计CTLA-4多态性可能影响蛋白质的疏水性和结构，而IL-4多态性可能导致其启动子区域的转录因子结合位点发生改变。CTLA- 4多态性可能会增强临床可用化疗药物的疗效。因此，CTLA-4和IL-4SNP 多态性与巴基斯坦患者中 HCV 诱发的 HCC 密切相关，可用作 HCV 患者 HCC 的前期和早期诊断和预后的遗传标志物。