新冠疫情下儿童呼吸道感染病毒病原学的变迁及诊断策略

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呼吸道感染是儿童就诊最主要的原因，病毒是最重要的病原体，尤其是5 岁以下儿童的呼吸道感染。新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID- 2019）疫情自2019年底暴发以来，迅速波及全球多个国家和地区，引起全球大流行。自2020年 1 月以来，世界范围内实施了一系列公共卫生预防措施，包括戴口罩、手卫生消毒、隔离、关闭学校、限制旅行、关闭边境等，有效地遏制了新冠病毒的传播，同时也减少了其他呼吸道病原体的传播。本文重点对新冠疫情期间儿童常见呼吸道病毒感染的流行病学情况及相关诊断问题进行阐述。
1 病毒是儿童呼吸道感染的主要病原体
呼吸道感染包括上呼吸道感染和下呼吸道感染，上呼吸道感染60%~70%的病原是病毒；下呼吸道感染中最主要的疾病是肺炎，肺炎仍然是全球 5岁以下儿童死亡的首位原因，约占新生儿后期死亡人数的12.8%。2021年中国疾病预防控制中心在Nature Communications期刊发布了一项来自106个城市、277家哨点医院和92个实验室，历时11年的呼吸道传染病监测数据显示 5 岁以下儿童急性呼吸道感染病毒检出阳性率最高，为46 . 9 %，流感病毒（influenza virus，IV）、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）和人鼻病毒（humanrhinovirus，HRV）是前三位的病毒病原，其中呼吸道合胞病毒（28.1%）和鼻病毒（18.3%）是儿童肺炎的主要病毒病原。PERCH研究纳入了来自7个非洲和亚洲国家4 232例1～59月龄的重症肺炎住院患儿（无人免疫缺陷病毒感染）以及5 119例社区对照组儿童，采集了鼻咽拭子及血液、痰液和其他液体样本进行病原学检测，发现病毒占61 . 4 %，其中呼吸道合胞病毒是最重要的病原体，检出率为31. 1%, 人鼻病毒、人偏肺病毒（human metapneumovirus，HMPV）、副流感病毒（parainfluenza virus，PIV）、肺炎链球菌、结核分枝杆菌流感嗜血杆菌各占病因学分布的5 %，说明病毒是5岁以下儿童肺炎的主要病原。因此，针对这些病原体的预防和治疗措施或可显著影响儿童肺炎的预后。
2 疫情期间病毒病原学的变化
2 . 1 流感病毒
COVID-19限制措施直接导致北半球多国的流感提前结束。截至2020年底，欧洲哨点监测显示IV病毒活动水平极低，第40～53周仅检出415例IV阳性病例，相比2019年同期检出26 525例阳性病例有显著下降。在南半球，流感的流行季节为每年6月至8月，而来自大洋洲（澳大利亚）、南美洲（智利）和南部非洲（南非）的数据显示，在2020年的6月至8月的IV活动也常低。澳大利亚从以往每年流行季节（3月至9月）平均检出15万例降至2020年的7 029例[8]，即使在5月之后解除了部分限制措施，IV 检出率依旧没有回升。国内也表现出相同的趋势。国家流感中心显示，自2020年初我国采取新冠疫情防控措施后国内IV活动呈持续下降趋势，截止2020年年底，中国内地IV持续保持在较低水平，仅南方省份检出少量IV[9]。北京地区2020年2月至5月IV检出率较疫情前平均水平下降94 . 67 %。西安地区2020年度IV检出率降至5 %以下。苏州地区2020年2月—12月间IV的检出率仅为0 . 08 %，较 2016 年—2019 年间 IV 检出率 7 .79% 明显下降。2021 年随着疫情常态化管理，部分病毒正在恢复期流行病学特点，冬季 IV 呈现流行趋势。欧洲哨点 2021 年第 40～52 周共向 TESSY 报告了23 246例感检测，恢复至疫情前平均水平。根据国家流感中心显示，我国2021年冬季流感高发，且以B（Victoria）系占绝对优势，国内出现局部疫情，仅 2021 年 49 周 1 周内国内就报道流感局部暴发疫情225起。
2 . 2 呼吸道合胞病毒
RSV 的流行季节也在疫情后发生了明显的变化。新冠疫情暴发前，RSV检出率冬季高夏季低，但新冠暴发后，由于佩戴口罩、手卫生和保持社交距离等措施，世界各地都出现 RSV 检出率急剧下降，最高下降幅度可达70%~90%。欧洲预防和疾病控制中心2021年第31周报告RSV从疫情前流行季每周可检出2 000 ~ 2 500例降至疫情后每周700例
左右。澳大利亚新南威尔士州急诊部的毛细支气管炎监测证实了RSV病例的急剧下降。北京地区2020年2月—5月RSV的检出率较往年同期下降92 . 17 %，苏州地区2020年2—12月间RSV的检出率为4 . 91 %，较2016—2019年RSV平均检出率10 . 26 %明显下降。但随着防控等级的下调和学校开放，RSV在2020年夏季出现流行的情况。湖南长沙6月开始，RSV阳性率逐月升高，到2020年8月检出率达12.51%，为2019年的6倍多，存在暴发流行。扬州地区在2020年9月出现RSV感染小高峰。同样，在美国和澳大利亚等国家也发现RSV再燃的现象，且RSV 感染的患儿年龄偏大，中位数年龄为18月龄，临床症状高热的比例增多。
2 . 3 人鼻病毒
相比IV及RSV在疫情后受到明显抑制，RV则表现为不同的流行趋势。澳大利亚研究人员发现，从2020年第22周开始，RV的检出率远远高于平均水平，这与大多数呼吸道病毒下降的趋势完全不同[21]。新南威尔士州仅在学校关闭的第15～21周检出率明显降低，第22周学校开放后RV阳性检出率显著升高，考虑与检测范围的扩大及缺乏IV和RSV的竞争有关。日本学者报道横滨在新冠疫情期间，与IV、RSV等呼吸道病毒感染率出现下降不同，10岁以下儿童中RV感染率出现明显上升[ 22 ]。首都儿科研究所赵林清教授团队就新冠疫情前后北京地区RV流行情况进行分析，发现疫情发生后，2020年2月—5月RV检出率与2017—2019年同期相比下降了 94.59%，保持在 6.00% 以下。但伴随着北京地区2020年第23周和24周的学校和幼儿园重新开放，从6月开始，RV阳性检出率迅速上升（13.77%），8月升至最高点（37.25%），显著高于2017—2019年8月的水平（22 . 51 %），并且这种上升趋势在3岁以上儿童中更为明显。苏州地区报道2020年2月—12月RV的检出率高于2016—2019年同期，在2020年6月迎来RV检出高峰，在住院患者中检出率高达44%，显著高于往年平均水平。这可能与学校和幼儿园的重新开放有关，提示儿童，尤其是在校儿童，在RV传播中的作用较大。
2 . 4 其他呼吸道病毒
其他病毒变化各地报道相对较少，日本Takashita等报道腺病毒、人博卡病毒、人偏肺病毒、副流感病毒等检出率在 COVID-19 流行期间均明显下降。北京地区报道腺病毒检出率较往年同期下降86 . 31 %。苏州地区报道PIV-3流行季节为每年3月至9月，但2020年其流行季向后推迟，9月才开始出现检出率升高，10月达到高峰，在住院患儿中检出率达12 . 99 %,显著高于疫情前流行季的检出率，而腺病毒、人偏肺病毒检出率则较2016—2019年同期分别下降78.7%、34.2%，人博卡病毒检出率则变化不明显。
3 病毒流行病学变化的可能机制
3 . 1 非药物干预措施的实施
呼吸道病毒感染传播的主要模式是飞沫传播和接触传播，为应对COVID-2019疫情，随着佩戴口罩、手卫生、保持社交距离、关闭学校、旅行限制、关闭口岸等一系列防控政策的实施，有效的切断了传播途径，这些非药物干预措施对流感病毒、呼吸道合胞病毒等同样有效，使得呼吸道病毒感染的发病率明显降低。
3 . 2 病毒互相干扰
有研究显示部分病毒如流感病毒、鼻病毒，可以在宿主或群体中干扰其他病毒的感染，一种呼吸道病毒可以通过刺激人气道上皮的抗病毒防御能力来阻断另一种呼吸道病毒的感染[25]。有学者认为，病毒干扰可能会影响流行病学的进程，感染一种病毒可提供暂时的保护，防止感染其他相关或不相关的病毒，例如2009年秋季的鼻病毒流行似乎延迟或打断了甲型H1N1流感在欧洲的大流行。一项关于婴儿鼻病毒和呼吸道合胞病毒共检测的研究表明，RSV和RV共检测呈负相关，通过免疫预防抑制RSV感染可能会增加HRV感染的风险，这也支持了病毒干扰假说。目前对于病毒干扰的机制，包括通过一种病毒直接被另一种病毒阻断病毒进入受体和病毒对宿主细胞的竞争，以及病毒诱导先天性或适应性免疫反应来防止相关或不同病毒的感染。研究表明，鼻病毒和其他RNA病毒感染后，即使没有症状，也能诱导人气道内ISG的表达，因此干扰素介导的抗病毒应答是一种可能的机制，当病毒感染细胞，细胞内的固有免疫传感器产生I型和III型干扰素以及诱导抗病毒ISG表达。进一步了解呼吸道病毒之间的相互作用可能有助于更好地预测呼吸道病毒流行的时间和规模。
4 病原学诊断策略
COVID- 19 症状包括发热、干咳、乏力、头痛、肌肉酸痛、咽痛、流涕、恶心、呕吐和腹泻等，儿童病例症状相对较轻。这些症状也可由甲型流感、乙型流感、RSV、腺病毒、人偏肺病毒、副流感病毒、鼻病毒和人冠状病毒等引起，需要进行鉴别，鉴别诊断的要点主要包括流行病学史和多病原学实验室检测。混合感染在儿童肺炎中较为常见，有必要在有症状的患儿中同时检测 SARS-CoV-2 和其他呼吸道病毒。尤其在流行季节，使用灵敏度和特异度较高的病原学检测方法对呼吸道感染的患者进行呼吸道病毒的快速检测很有必要，准确的诊断，给予针对性的治疗，还可防止临床抗生素的滥用。
4 . 1 呼吸道感染病原学检测标本的采集
儿童呼吸道感染病原检测标本包括上呼吸道和下呼吸道标本，上呼吸道标本包括鼻/口咽拭子、鼻咽抽吸物，下呼吸道标本包括深部痰液、气道吸取物、支气管肺泡灌洗液等。上呼吸道采集的标本检测出病原是否可反映下呼吸道感染的病原目前存在争议，但由于采集儿童下呼吸道标本较为困难，因此上呼吸道感染检测出病毒可代替下呼吸道标本。
4 . 2 呼吸道感染病原学检测方法
4 . 2 . 1 呼吸道病毒抗原检测 该检测方法是基于
病毒抗原和特异性抗体相互结合的机制，快速检测标本中的抗原。目前国内最常用的直接免疫荧光法检测试剂盒可以检测七项常见的呼吸道病毒（RSV，ADV，IFA，IFB，PIV 1、2、3）。该检测方法特异度高、价格便宜、操作方便，目前国内多数基层医院仍在使用当中，但该方法的灵敏度较低。
4 . 2 . 2 多重PCR技术的运用 多重PCR技术采用
多对特异性引物同时扩增多个不同的 DNA 片段，具有快捷、敏感度和特异度高、操作简单等优点，利用一次多重PCR反应，可同时检测多种病原体，在临床多重感染的诊断上具有较高的实用价值。在COVID- 19疫情发生后，多重PCR检测方法得到了更多的应用，使用该法可快速检测SARS-CoV-2和与其症状类似的病毒，是儿科医师能快速地对症状类似的病毒感染尽早鉴别诊断。近期世界多地开发了自动化多重实时PCR检测，在COVID- 19疫情期间可检测 SARS-CoV- 2 和其症状类似的病毒RSV、IV-A和IV-B等四种病原体。
4 . 2 . 3 质谱在呼吸道病原诊断的运用
多重PCR检测的灵敏度和特异度均较高，但由于单个反应孔只能检测3、4种病原，检测更多病原需要更多反应孔，使检测的便利性和检测通量降低，而检测费用显著升高。核酸质谱检测整合了PCR技术的高灵敏度和质谱技术的高通量，能检测更多的病原体。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技术在细菌和真菌的检测中起重要作用[41-43]，COVID- 19疫情发生后MALDI-TOFMS 技术也被用于 SARS-CoV- 2 及其变异株的检测[44]。该技术可同时检测SARS-CoV- 2六种变异株（Alpha、Beta、Epsilon、Iota、Gamma和Delta）。
4 . 2 . 4 宏基因组病原检测方法
基于二代测序的mNGS方法一次能对几十万到几百万条核酸序列测序，可无偏倚检测标本中所有的病原微生物信息。mNGS测序技术为不明原因的疑难重症，新发、突发病原体的鉴定提供了新的选择，成为临床实验室的重要技术补充。mNGS技术在SARS-CoV- 2的发现上也起了重要的作用。但是目前mNGS也存在成本较高、缺乏规范化的质量控制、无法明确是致病菌还是定植菌等问题，正确的结果解读是利用好这一工具的关键。
5 结语
综上所述，新冠肺炎疫情期间，儿童呼吸道感染的病毒病原谱及流行病学趋势有所变化，但病毒仍然是最重要的病原体，我们在关注新型冠状病毒的同时，不能忽视其他呼吸道病毒的感染。随着科技的迅猛发展，病原体检测已从传统的病原体分离培养到免疫学技术和血清学检测，最终迈向了分子检测时代，多重PCR检测等新技术在检测病原的种类和时效性上具有较大优势，但传统的呼吸道病原检测方法不应被取代和忽视，两者互补可以更好地服务于临床，针对不同的检测人群和不同的检测目的，可采取不同的呼吸道病原体检测组合方案。对儿童呼吸道病原学进行检测和持续监测十分必要，这有利于新冠肺炎后疫情时代呼吸道病毒感染的精准防控和临床诊断及治疗。