AXL 调节 neuregulin1 表达导致头颈癌中的西妥昔单抗耐药

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抽象的背景
受体酪氨酸激酶 (RTK) 表皮生长因子受体 (EGFR) 过表达，是头颈癌 (HNC) 的重要治疗靶点。西妥昔单抗是目前唯一获得FDA批准用于治疗HNC的EGFR靶向药物；然而，对西妥昔单抗的内在和获得性耐药是临床上的一个主要问题。我们实验室之前报道过 AXL 通过激活 HER3 导致西妥昔单抗耐药。在这项研究中，我们研究了 AXL、HER3 和 neuregulin1 (NRG1) 基因表达之间的联系，重点是了解它们相互依赖的信号如何促进 HNC 对西妥昔单抗的耐药性。
方法
进行质粒或 siRNA 转染和基于细胞的测定以测试西妥昔单抗的敏感性。定量PCR和免疫印迹分析用于分析基因和蛋白质表达水平。评估了七个 HNC 患者来源的异种移植物 (PDX) 的蛋白质表达水平。
结果
我们发现 HER3 表达对于没有 AXL 表达的西妥昔单抗耐药是必要的，但还不够。我们的结果表明，将 HER3 配体 NRG1 添加到西妥昔单抗敏感的 HNC 细胞中会导致西妥昔单抗耐药。此外，过表达 AXL 的细胞在转录水平上调节 NRG1，从而促进西妥昔单抗耐药。免疫印迹分析显示，与西妥昔单抗敏感的 HNC PDX 相比，NRG1 在西妥昔单抗耐药的 HNC PDX 中的表达相对较高。最后，NRG1 的遗传抑制使过表达 AXL 的细胞对西妥昔单抗重新敏感。
结论
这项研究的结果表明，AXL 可能通过 NRG1 通过 HER3 发出信号以促进西妥昔单抗耐药，并且靶向 NRG1 可能对 HNC 治疗方法具有重要的临床意义。
同行评审报告背景
头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 从呼吸消化道的黏膜内层发展而来。据估计，2020 年美国将有超过 53,000 例新的 HNSCC 病例和 11,000 例死于该疾病。HNSCC 是一种复杂的异质性疾病，起源于口腔、舌、咽、喉和唾液腺等多个部位。90% 以上起源于口咽轴的肿瘤是鳞状细胞癌。在美国，2009-2015 年口腔和咽部的 5 年相对生存率为 65%。用于治疗这种癌症的治疗方案通常包括手术、放疗、化疗、靶向治疗和/或免疫治疗。
用于治疗 HNC 患者的常见全身性药物是单一疗法或包含铂类、紫杉烷类、免疫检查点抑制剂和西妥昔单抗的联合疗法。西妥昔单抗是一种靶向表皮生长因子受体（EGFR）的嵌合单克隆抗体，于 2006 年获得 FDA 批准用于治疗 HNC。EGFR 是 HER 受体酪氨酸激酶（RTK）家族的成员，EGFR 的异常表达导致在 HNSCC 的病因学中受到强烈关注。西妥昔单抗是唯一对局部晚期和复发/转移性 HNC 均有效的药物。它通过以高亲和力结合 EGFR 的细胞外结构域、阻断配体结合和刺激受体内化来发挥作用。作为 IgG1 类抗体，它还刺激抗体依赖性细胞毒性。当添加到放疗或化疗方案中时，西妥昔单抗靶向 EGFR 可提高 HNSCC 患者的总体生存率。尽管西妥昔单抗治疗有临床益处，但患者可能会对西妥昔单抗产生耐药性 。因此，对耐药机制的研究可以为改进 HNSCC 的治疗策略提供新的见解。
RTK AXL 是 TAM 受体家族（ Tyro 、AXL 、MER）的成员，并且与许多恶性肿瘤的发展和进展有关。这些研究表明 AXL 在癌细胞增殖、迁移、血管生成和转移中的作用。AXL mRNA 表达与 HNSCC 的不良疾病结果相关，表明 AXL 在这种疾病的发展和/或进展中具有推定的作用。此外，AXL 蛋白表达水平在 HNSCC 肿瘤进展期间增加。我们的实验室先前报道，AXL 表达与 HNSCC 患者较高的病理分级、远处转移和较短的无复发生存期显着相关。许多研究发现，AXL 还可以介导对抗 EGFR 抑制剂的耐药性，这进一步揭示了 AXL 在治疗耐药性中的作用。
RTK HER3 已被证明在包括 HNSCC 在内的许多癌症类型中上调，并且与侵袭和转移有关。也有报道称，膜性 HER3 表达与 HNSCC 中较差的总体存活率显着相关。我们的实验室报道，在非小细胞肺癌 (NSCLC) 和 HNSCC 中，对西妥昔单抗的获得性耐药伴随着 HER3 的 EGFR 依赖性激活。我们还发现 HER3 的基因沉默能够使西妥昔单抗耐药的克隆对西妥昔单抗治疗重新敏感，这表明 HER3 在驱动耐药中发挥作用。这一作用也在一项研究中得到证实，该研究表明抑制 HER3 与西妥昔单抗联合在西妥昔单抗耐药 HNSCC 患者衍生的异种移植物中具有很强的抗肿瘤活性。所有这些研究都强调了 HER3 在治疗抵抗中的重要作用。总的来说，AXL 或 HER3 可以在介导对西妥昔单抗的耐药中发挥重要作用，并且 AXL 或 HER3 的靶向可以使西妥昔单抗治疗重新敏感。
基于我们之前在西妥昔单抗耐药背景下对 AXL 和 HER3 的研究，我们研究了这两种受体之间的联系，重点是了解它们相互依赖的信号传导以促进对西妥昔单抗的耐药性。AXL 过表达模型显示 AXL 通过激活 HER3 导致西妥昔单抗耐药，但我们发现 HER3 的遗传过表达不足以导致西妥昔单抗耐药。然而，HER3 配体 neuregulin1 (NRG1) 的外源性表达确实会导致西妥昔单抗耐药。进一步的实验表明，AXL 可以在 mRNA 水平调节 NRG1，以促进西妥昔单抗耐药。其他西妥昔单抗耐药模型的 AXL 和 NRG1 表达相对较高，在这些模型中靶向 NRG1 足以克服西妥昔单抗耐药性。集体，
材料和方法
试剂
西妥昔单抗（IMC-C225，Erbitux）购自威斯康星大学药房。Gas6 和 NRG1 获自 R&D systems (Minneapolis, MN)。DMSO (MilliporeSigma, St. Louis, MO) 用作体外载体对照。人 IgG (MilliporeSigma, St. Louis, MO) 是西妥昔单抗的对照。
细胞系和 HNSCC PDX
UMSCC1、UMSCC6 和 HNSCC PDX 是从 SPORE 资源中获得的。HN30 和 PCI37A 细胞系分别是来自加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城的 Ravi Salgia 博士和加利福尼亚州加州大学旧金山分校的 Jennifer Grandis 博士的礼物。所有细胞系均在含有 4.5 g/dL 葡萄糖、10% FBS、青霉素（100 单位/mL）和链霉素（100 mg/mL）的 DMEM 中培养。威斯康星大学麦迪逊分校的 TRIP 实验室使用短串联重复分析和公开可用的数据库确认了细胞系的身份。PCI37A 的 STR 参考未公开提供，但基因组完整性保持相似超过 2 年。支原体检测是通过威斯康星大学麦迪逊分校的 WiCell 核心服务完成的。补充材料和方法中列出了有关细胞系和 PDX 的详细信息。
质粒和转染
如前所述制备和选择质粒。根据制造商的说明 ，使用 Lipofectamine3000 和 Opti-MEM (Life Technology, Carlsbad, CA) 进行转染。在维持细胞时，使用杀稻瘟菌素 (3ug/mL) 作为选择性抗生素。
siRNA转染
非靶向对照池 siRNA (Cat#D-001810)、SMARTpool siRNA 靶向 HER3 (Cat#L-003127)、AXL (Cat#L-003104) 和 NRG1 (Cat#L-004608) 购自 Dharmacon, Inc ( Lafayette, CO) 用于转染 Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies)。免疫印迹证实成功敲低。
基于细胞的测定
细胞计数试剂盒 8（CCK8，Dojindo Molecular Technologies，MD）和结晶紫测定用于确定细胞增殖或细胞活力，如前所述。对于 CCK8 测定，将相同数量的细胞铺在 96 孔板上。处理后，根据制造商的说明进行 CCK8 分析。对于结晶紫测定，将相同数量的细胞接种在 6 孔板中。处理后，细胞用0.5%结晶紫染色。将板风干，用 0.1 M 柠檬酸钠 (pH 4.2) 和乙醇 (1:1) 洗脱染料。将洗脱液转移到 96 孔板中，在 540 nm 处读取吸光度以确定细胞增殖情况。对于使用 siRNA 和其他试剂联合处理的研究，首先用 siRNA 转染细胞。24 小时后，细胞用其他试剂再处理 72 小时。所有处理一式两份或一式三份进行。
免疫印迹分析
使用 RIPA 缓冲液（50 mM Hepes、pH 7.4、150 mM NaCl、0.1% Tween-20、10% 甘油、2.5 mM EGTA、1 mM EDTA、1 mM DTT、1 mM Na3VO4、1 mM PMSF、1 mM β-甘油磷酸盐 (BGP) 和 10 μg/ml 亮肽素和抑肽酶）。如前所述进行免疫印迹分析。根据制造商的说明使用抗体：AXL (Cell Signaling Technologies, MA (CST) #8661)、pAXL/pMerTK/pTyro3 (CST #44463)、HER3 (CST #12708)、pHER3 Y1197 (CST #4561)、AKT (CST #2920)、pAKT (CST #4060)、NRG1 (CST #2573)、GAPDH (CST #2118)、α-微管蛋白 (MilliporeSigma #CP06)。
RNA分离、cDNA合成和qPCR
如前所述进行 RNA 分离、cDNA 合成和 qPCR。简而言之，使用RNeasy试剂盒（Qiagen）从细胞中分离总RNA。然后通过 NanoDrop 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）对 RNA 进行定量。使用 qScript™ cDNA SuperMix (Quantabio, Beverly, MA) 将 RNA 逆转录为 cDNA。使用 Bio-Rad CFX96 实时 PCR 系统 (Bio-Rad, Hercules, CA) 进行定量实时 qPCR。真核 18S rRNA（4,333,760，Life Technologies）和人类 ACTB（4,333,762，Life Technologies）用作标准化对照。使用ΔΔC t方法分析基因表达水平。
统计分析
使用 Prism (GraphPad Software, Inc.) 进行统计分析。使用带有 Bonferroni 事后检验的重复测量 ANOVA 评估多组之间的差异。当P  < 0.05时，差异被认为是显着的。

结果
AXL 导致西妥昔单抗耐药和 HER3 活性增加
以前，我们报道了许多西妥昔单抗耐药的 HNSCC 细胞系相对于西妥昔单抗敏感细胞系表现出 AXL 的表达和活化增加。此外，我们通过使用小干扰 RNA (siRNA) 分析表明，表达 AXL 的 HNSCC 细胞系依赖于该受体进行增殖。由于 siAXL 损害了西妥昔单抗抗性 HNSCC 细胞的增殖，我们首先试图确定配体诱导的 AXL 激活是否可能介导西妥昔单抗抗性。我们用 Gas6（一种 AXL 配体）刺激对西妥昔单抗敏感的 HN30 细胞，以确定这是否会导致对西妥昔单抗的耐药性增加。Gas6 在 HN30 细胞中对 AXL 的刺激确实导致了对西妥昔单抗治疗的抗性（图 1 ）一种）。免疫印迹分析表明，即使在存在西妥昔单抗的情况下，用 Gas6 刺激的 HN30 细胞也具有强烈的 AXL 和 HER3 受体表达和磷酸化。AKT 也被 Gas6 刺激高度磷酸化。这一结果表明 Gas6 对 AXL 和 HER3 的激活可以刺激细胞增殖和存活途径，从而逃避西妥昔单抗的抑制作用。
图。1

AXL 导致西妥昔单抗耐药和 HER3 活性增加。A：HN30 细胞用 100 nM IgG、100 nM 西妥昔单抗 (Ctx) 或 Ctx 和 Gas6 的组合 (200 ng/uL) 处理 72 小时，通过结晶紫测定确定细胞活力。平均值、SE 和统计分析代表两个独立实验。N  = 3，** P  < 0.01。收获全细胞裂解物并通过 SDS-PAGE 分级分离，然后对所示蛋白质进行免疫印迹。GAPDH 用作上样对照。B：在用西妥昔单抗处理 72 小时后，通过结晶紫测定法测量 AXL 过表达细胞中的细胞活力。平均值、SE 和统计分析代表三个独立实验。N  = 3, ** P < 0.01。收获全细胞裂解物并通过 SDS-PAGE 分级分离，然后对所示蛋白质进行免疫印迹。α-微管蛋白和 GAPDH 用作上样对照
为了进一步评估 AXL 的过表达是否会增加 HNSCC 细胞中的 HER3 磷酸化，我们通过稳定转染在西妥昔单抗敏感细胞系 HN30 (HN30-AXL) 和 PCI37A (PCI37A-AXL) 中过表达 AXL。通过免疫印迹评估 HN30 和 PCI37A 细胞系中 AXL 和 HER3 的内源性水平（补充图1）。增殖试验表明，与载体细胞相比，过表达 AXL 的细胞系对增加剂量的西妥昔单抗具有显着抗性（图 1 ）乙）。免疫印迹分析证实细胞中总 AXL 表达增加，也表明 HN30-AXL 和 PCI37A-AXL 细胞中 HER3 的磷酸化增加。总的来说，这些结果表明 AXL 的过表达导致西妥昔单抗耐药和 HER3 活性增加。
HER3 是 AXL 介导西妥昔单抗耐药所必需的
为了确定 HER3 在其抗性由 AXL 过表达引起的西妥昔单抗抗性细胞中是否重要，使用西妥昔单抗处理和靶向 HER3 的 siRNA 进行细胞增殖测定（图 2A  ）。HN30-AXL、PCI37A-AXLC1 和 PCI37A-AXLC2 细胞的细胞增殖在使用 siHER3 和西妥昔单抗的组合治疗时与单独使用任一治疗相比受到显着抑制。免疫印迹分析显示，siHER3 和西妥昔单抗联合治疗降低了 AKT 的磷酸化。
图 2

HER3 是 AXL 介导西妥昔单抗耐药所必需的。将 HN30-AXL 和 PCI37A-AXL 细胞铺板并用 30 nM HER3 siRNA (siHER3) 或 30 nM 非靶 siRNA (siNT) 处理。第二天，用 100 nM IgG 或 100 nM 西妥昔单抗 (Ctx) 处理细胞 72 小时。在药物处理后通过CCK8测定测量细胞增殖。平均值、SE 和统计分析代表三个独立实验。N  = 5–10，** P  < 0.01。处理后 24 小时收集全细胞裂解物，通过 SDS-PAGE 分级分离并针对指定的蛋白质进行免疫印迹。GAPDH 用作上样对照。乙 将 UMSCC1 和 UMSCC6 HNSCC 细胞铺板并用 30 nM siAXL 或 30 nM siNT 处理。第二天，用 100 nM IgG 或 100 nM Ctx 处理细胞 72 小时。在药物处理后通过结晶紫测定测量细胞活力。平均值、SE 和统计分析代表三个独立实验。N  = 3，** P  < 0.01。在处理后 24 小时收集全细胞裂解物，通过 SDS-PAGE 分级分离，并对所示蛋白质进行免疫印迹。GAPDH 用作上样对照

因为 siHER3 抑制 HN30-AXL 和 PCI37A-AXL 细胞的增殖，我们接下来研究了在对西妥昔单抗（UMSCC6、UMSCC1）具有内在抗性的细胞系中靶向 AXL 是否会增强西妥昔单抗的敏感性并降低 HER3 的磷酸化。在用 sinontarget (siNT)、西妥昔单抗、siAXL 或 siAXL 和西妥昔单抗的组合处理 UMSCC6 和 UMSCC1 HNSCC 细胞后进行细胞增殖分析。这些实验的结果表明，与单独的任一治疗相比，siAXL 和西妥昔单抗的组合对这些细胞具有显着的抗增殖作用（图 2 ）乙）。免疫印迹分析表明，联合治疗抑制了 HER3 的磷酸化。这些结果表明 HER3 信号传导与 AXL 协同调节细胞增殖和对西妥昔单抗的反应。为了进一步研究单独HER3的表达是否足以介导对西妥昔单抗的耐药性，对两种对西妥昔单抗敏感且表达很少或不表达内源性HER3的HNSCC细胞系被操纵以过表达HER3并用西妥昔单抗处理以进行细胞增殖分析（图 3 ））。该实验的结果表明，即使 HER3 过表达，HN30 和 PCI37A 细胞仍然对西妥昔单抗治疗敏感。AXL 磷酸化水平在 HN30-HER3 和 PCI37A-HER3 细胞中没有增加。总的来说，这些结果表明没有 AXL 激活的 HER3 过表达不足以产生西妥昔单抗耐药。
图 3

仅 HER3 过表达不足以产生西妥昔单抗耐药。答：在对 HN30 细胞进行结晶紫测定和对 PCI37A 细胞进行 CCK8 测定之前，用 100 nM 西妥昔单抗 (Ctx) 处理稳定过表达 HER3 或 pcDNA6.0 载体的 HN30 和 PCI37A 细胞 72 小时。在处理后 24 小时收获全细胞裂解物，并在通过 SDS-PAGE 分级分离后进行免疫印迹分析。GAPDH 或α-微管蛋白用作上样对照。平均值、SEs 和统计分析代表两个或三个独立实验。N  = 3–6。NS：不显着

NRG1的外源表达导致西妥昔单抗耐药
我们之前曾报道过配体介导的 HER 家族受体激活，尤其是 HER3，可以介导对西妥昔单抗的耐药性 [ 31 , 39 ]。然而，在这项研究中，HER3 表达是必要的，但对于没有 AXL 表达的西妥昔单抗耐药是不够的。因此，我们假设 AXL 下游的另一个途径必须影响 HER3 和 HER3 配体 NRG1 的表达。为了验证这一假设，我们首先用 NRG1 刺激 HN30 和 PCI37A 细胞，以评估这是否会导致对西妥昔单抗的耐药性增加。将 NRG1 添加到 HN30 或 PCI37A 细胞确实会导致对西妥昔单抗的耐药性（图 4一种）。免疫印迹分析表明，在 NRG1 刺激后，两种细胞系中 HER3 和 AKT 的磷酸化水平均增加，并且在 NRG1 存在下不受西妥昔单抗的抑制。这一结果表明，NRG1 的存在足以刺激 HER3，从而调节细胞增殖和存活途径，从而绕过西妥昔单抗的抑制作用。
图 4

NRG1 的外源性表达导致西妥昔单抗耐药。将 HN30 和 PCI37A 细胞铺板并用 100 nM 西妥昔单抗 (Ctx)、100 ng/mL NRG1 或 Ctx 和 NRG1 的组合处理 72 小时。通过CCK8测定确定细胞增殖。平均值、SE 和统计分析代表两个独立实验。N  = 6，** P  < 0.01。在处理后 24 小时收获全细胞裂解物并通过 SDS-PAGE 分级分离，然后对所示蛋白质进行免疫印迹。GAPDH 用作上样对照。乙 HN30 和 PCI37A 细胞用 30 nM siHER3 或 30 nM siNT 转染 24 小时，然后用 Ctx (100 nM) 或 NRG1 (100 ng/ml) 再处理 72 小时。细胞活力或细胞增殖通过结晶紫测定法测定 HN30 细胞和 CCK8 测定法测定 PCI37A 细胞。平均值、SEs 和统计分析代表两个或三个独立实验。N  = 3–10，** P  < 0.01。在处理后 24 小时收获全细胞裂解物，并在通过 SDS-PAGE 分级分离后进行免疫印迹分析。GAPDH 用作上样对照

为了确定 HER3 激活在西妥昔单抗耐药中的重要性，我们用 siHER3 和西妥昔单抗处理西妥昔单抗敏感细胞系 HN30 和 PCI37A 72 小时，然后用外源 NRG1 刺激它们。细胞增殖分析表明，HN30 和 PCI37A 细胞在 HER3 敲低和 NRG1 刺激后对西妥昔单抗敏感（图 4B）。这一结果进一步证实了 HER3 激活是西妥昔单抗耐药所必需的。
基于这些结果，我们接下来评估了 AXL 是否刺激 NRG1 调节西妥昔单抗抗性细胞系中的细胞增殖。定量 PCR (qPCR) 和免疫印迹分析用于分析 HN30-AXL 或 PCI37A-AXL 细胞中的 NRG1 表达水平，分别与 HN30-载体或 PCI37A-载体对照相比（图 5A，补充图2）。在 HN30-AXL 和 PCI37A-AXL 细胞中，NRG1 的丰度在 mRNA 和蛋白质水平上都有所增加。
图 5

AXL 调节 NRG1。A 通过qPCR和免疫印迹分析确定NRG1在HN30-Vector、HN30-AXL PCI37A-Vector和PCI37A-AXL细胞中的表达水平。α-微管蛋白用作上样对照。平均值、SE 和统计分析代表三个独立实验。N  = 2-4。B 从 HNSCC PDX 肿瘤中收集全细胞裂解物，并通过 SDS-PAGE 进行分级分离，然后对指定的蛋白质进行免疫印迹。GAPDH 用作上样对照。光密度值代表来自两个独立实验的 NRG1/GAPDH 的平均比率。误差线：SEM（* P < 0.05，Mann-Whitney 检验）

为了扩展这些发现，评估了 HNSCC 患者来源的异种移植物 (PDX) 的 NRG1 表达水平（图 5B  ）。先前对七种 HNSCC PDX 进行了表征并评估了西妥昔单抗的反应 [ 40 ]。从早期传代肿瘤中采集 PDX 样品，并通过免疫印迹分析评估 NRG1 的表达。有三种西妥昔单抗敏感的 PDX（UWSCC-22、UWSCC-34 和 UWSCC-36）和四种西妥昔单抗耐药的 PDX（UWSCC-1、UWSCC-17、UWSCC-25 和 UWSCC-64）。在这个小型队列中，免疫印迹分析显示，与西妥昔单抗敏感的 PDX 相比，西妥昔单抗耐药的 PDX 平均表达 NRG1 大约 8 倍（图 5 B，* p < 0.05)。总之，这些数据表明 NRG1 在西妥昔单抗耐药的 HNSCC 中过度表达。
AXL 调节 NRG1 导致西妥昔单抗耐药
我们的数据表明 AXL 增加了 HER3 活化，导致西妥昔单抗耐药。此外，AXL的过表达增加了西妥昔单抗抗性细胞中NRG1的表达水平，并且西妥昔单抗抗性PDX比西妥昔单抗敏感的PDX具有更多的NRG1表达（图 5）。因此，我们假设 NRG1 可能对 AXL 介导西妥昔单抗耐药至关重要。为了测试这一点，我们通过 siRNA 在 PCI37A-AXL 细胞中靶向 NRG1，并用西妥昔单抗处理 72 小时。细胞增殖测定表明 NRG1 表达的丧失使细胞对西妥昔单抗重新敏感（图 6一种）。在用 siNRG1 和西妥昔单抗处理的 PCI37A-AXL 细胞中，HER3 和 AKT 的磷酸化显着降低。总的来说，这些结果表明 AXL 通过 NRG1 发出信号以促进西妥昔单抗耐药。
图 6
AXL 调节 NRG1 导致西妥昔单抗耐药。用 30 nM NRG1 siRNA 或 30 nM siNT对 PCI37A-AXL 细胞进行电镀和处理。第二天，用 100 nM 的 100 nM IgG 或 100 nM 西妥昔单抗 (Ctx) 处理细胞 72 小时。使用CCK8测定在药物处理后测量细胞增殖。平均值、SEs 和统计分析代表七个独立实验。N  = 6–10，** P  < 0.01。在处理后 24 小时收集全细胞裂解物，通过 SDS-PAGE 分级，并对所示蛋白质进行免疫印迹。GAPDH 用作上样对照。B 提出的 AXL 调节 NRG1 导致 Ctx 抗性的模型

讨论
目前的报告提供的数据表明，AXL 可以通过 NRG1 通过 HER3 发出信号，以促进 HNC 中的西妥昔单抗耐药性。值得注意的是，我们的模型证明 NRG1 对西妥昔单抗耐药是必要和充分的。进一步研究表明，AXL 可以调节 NRG1 的表达，从而促进对西妥昔单抗的耐药性。这些发现共同表明 AXL 和 NRG1 表达可以预测患者对西妥昔单抗治疗的反应，并加强在 HNC 治疗策略中使用 AXL 或 NRG1 靶向治疗的基本原理。
我们实验室和其他研究人员之前的研究表明，在对 EGFR 靶向产生耐药性后，几种受体酪氨酸激酶的表达水平增加，包括 AXL 和 HER3。癌症中 AXL 的改变表达已被研究为对西妥昔单抗的获得性耐药机制，并且已证明 AXL 的靶向可使细胞和肿瘤对 EGFR 靶向治疗重新敏感。在西妥昔单抗耐药模型中也观察到 EGFR 家族成员 HER3 的表达增加，从而导致开发了几种 EGFR-HER3 共同靶向治疗策略。在本研究中，我们发现 AXL 的过表达导致西妥昔单抗耐药和 HER3 活性增加（图 1），而 HER3 是 AXL 介导西妥昔单抗耐药所必需的（图 2）。我们还发现单独的 HER3 过表达不足以导致 HNSCC 细胞对西妥昔单抗的耐药性（图 3）。免疫印迹分析显示 HER3 的过表达不会增加 AXL 活性（图 3）。这些结果表明 AXL 和 HER3 的过表达可能是西妥昔单抗耐药所必需的。尽管 HER3 靶向在克服西妥昔单抗耐药性方面取得了广泛的临床前成功 ，HER3 抑制剂与西妥昔单抗的组合与单独的西妥昔单抗治疗相比没有表现出临床成功。因此，我们实验室继续研究 HER3 的信号传导作用，发现也许 AXL 和 NRG1 在西妥昔单抗耐药途径中更重要。
在目前的研究中，我们发现将 NRG1 添加到西妥昔单抗敏感的 HN30 和 PCI37A 细胞系中会使这些细胞对西妥昔单抗产生耐药性（图 4A）。根据该数据，我们之前报道 NRG1 自分泌信号是获得性西妥昔单抗耐药的主要驱动因素 。我们还发现，与载体对照相比，西妥昔单抗抗性 HN30-AXL 和 PCI37A- AXLC1细胞相对表达更多 NRG1（图 5A），并且西妥昔单抗抗性 PDX 肿瘤比西妥昔单抗敏感 PDX 具有更多 NRG1（图 5B  ， * p < 0.05)。这些发现表明 AXL 可以调节西妥昔单抗耐药 HNSCC 细胞中的 NRG1。此外，对 TCGA 中 89 个 HPV(+) 和 409 个 HPV(-) 原发性 HNC 肿瘤样本以及癌细胞系百科全书 (CCLE) 中的 33 个 HNC 细胞系的分析显示 AXL 和 NRG1 mRNA 水平呈正相关（补充图 S 3 )。有趣的是，尽管 AXL 过表达，但 PCI37A-AXLC2 细胞与载体对照相比没有表达更多的 NRG1（图 5A），而西妥昔单抗耐药的 PDX 肿瘤（UW-SCC25）即使具有 AXL 表达也不表达 NRG1（图 5）。  5 B)。许多小组已经开始研究 NRG1 在癌症中的表达，以及这与不同结果的治疗反应之间的关系。会见等人。发现 NRG1 表达与 HER3 抑制性抗体 AV-203的肿瘤生长抑制之间存在显着相关性，另一项研究表明 HER3 抑制在 NRG1 重排癌症中可能非常有效。巴罗等人。还发现自分泌 NRG1 信号传导的上调是 HNSCC 肿瘤中西妥昔单抗耐药的机制。使用 HER3 抗体 CDX-3379，他们能够克服西妥昔单抗耐药性并增强肿瘤生长延迟和放射敏感性 。相反，一项研究发现 HER3 的表达并不表明对 HER3 抗体或西妥昔单抗的敏感性。他们证明，NRG1 表达以及其他 EGFR 激活生物标志物与更好的抗 HER3 反应相关。在这项研究中，siRNA 联合西妥昔单抗治疗对 NRG1 表达的敲低通过损害西妥昔单抗抗性 PCI37A-AXL 细胞中的 AKT 存活信号传导导致细胞增殖减少（图 6A）。由于不同癌症模型的结果不同，必须完成对 NRG1 表达和西妥昔单抗反应的更多研究。还可以使用两种针对 NRG1 的高亲和力单克隆抗体来研究 NRG1 抑制和对西妥昔单抗重新敏感的额外测试或一种抗 NRG1 抗体，在胰腺癌的临床前模型中显示出对肿瘤生长的抑制作用。总的来说，其中提供的数据探讨了在 HNC 中西妥昔单抗耐药的情况下 AXL、NRG1 和 HER3 之间的信号连接（图 6B  ）。
结论
我们已经证明，在我们的模型中，NRG1 表达比 HER3 表达对于西妥昔单抗耐药是必要和充分的，并且 RTK AXL 可以调节 NRG1 的表达。该数据证实了 HER3 和 AXL 联合治疗可能比单独针对任何一种治疗更有效的发现。必须进行进一步探索以确定 AXL 和 NRG1 的共表达是否可以用作预测对西妥昔单抗耐药的生物标志物，或者 AXL 或 NRG1 的靶向策略是否会在耐药情况下提供治疗优势。