BIRC5在体外和体内调节炎症性肿瘤微环境诱导的阴茎癌发展...

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BIRC5在体外和体内调节炎症性肿瘤微环境诱导的阴茎癌发展加重
背景
含有 5 (BIRC5) 的杆状病毒 IAP 重复序列过表达，并在各种人类癌症的进展中发挥关键调节作用。炎性肿瘤微环境 (ITM) 与癌症的发展密切相关。然而，BIRC5 在阴茎癌 (PC) 和 ITM 诱导的 PC 异常进展中的作用仍不清楚。
方法
在这项研究中，招募了 PC 患者的血清和组织来评估 BIRC5 的表达谱。我们使用 PC 细胞系（Penl1 和 Penl2）构建了 PC 异种移植小鼠模型，以探索 BIRC5 沉默对小鼠增殖、迁移、侵袭和肿瘤生长以及存活的影响。此外，干扰素（IFN）-γ被用来模拟PC细胞的ITM。
结果
我们的结果表明，BIRC5 在 PC 患者的血清和组织以及 PC 细胞系中显着上调。BIRC5的敲低抑制了PC细胞的增殖、迁移和侵袭。同时，它抑制了 PC 异种移植肿瘤的生长并提高了小鼠的存活率。此外，IFN-γ在体内和体外都显着加重了 PC 的进展，而 BIRC5 的沉默则逆转了这些不利影响。
结论
总之，我们的数据显示，BIRC5 沉默抑制了 ITM 诱导的 PC 细胞过程和肿瘤发展的恶化。这表明 BIRC5 可能成为未来 PC 的诊断和治疗靶点。

背景
阴茎癌 (PC) 在经济不发达国家中是一种容易被忽视的侵袭性癌症。总之，25% 的 PC 患者最初被诊断为晚期癌症，原因是不够重视和尴尬。目前，PC 的临床治疗方法包括手术、化疗和近距离放射治疗 。尽管临床治疗有效地减缓了疾病的进展，但 PC 患者的存活率仍然很低。盆腔淋巴结转移患者的 5 年总生存率甚至为 0%。癌症治疗迫切需要更好地了解与 PC 相关的生物标志物。
含有 5 个 (BIRC5) 的杆状病毒 IAP 重复序列 (BIRC5)，也称为 survivin，于 1997 年首次报道并被发现是位于人类 17q25 染色体上的凋亡蛋白 (IAPs) 家族的抑制剂。迄今为止，已有大量证据表明 BIRC5 的过度激活发生在各种肿瘤疾病中，并在致癌过程中发挥了致癌作用。康德等人。证明 BIRC5 通过抑制细胞凋亡相关途径影响癌症侵袭性，从而促进细胞增殖。BIRC5 表达增加与肿瘤组织学恶性标志物和胶质瘤患者预后不良有关。最近一项基于 TCGA 数据集和医院数据的研究表明，与正常个体相比，BIRC5 在乳腺癌组织中高表达，可作为一种有前途的治疗性生物靶点。然而，缺乏研究能够准确说明 BIRC5 在 PC 发病机制中的作用和功能。
肿瘤微环境是指肿瘤的发生、生长和转移以及肿瘤细胞所处的内外环境。免疫细胞浸润已被证明存在于肿瘤微环境中，其分泌的炎性细胞因子在调节包括PC在内的多种肿瘤疾病的肿瘤生长和发展中起关键作用。最近，一些类型的促炎因子已被用于预测患者的预后。Anuja 及其同事指出，持续暴露于炎症与 PC 肿瘤的前肿瘤密切相关。此外，大量的炎症性阴茎疾病被认为最终发展为 PC 的可能性很高。因此，探索炎症性肿瘤微环境（ITM）对PC进展的潜在调控机制非常必要。
在我们的研究中，PC 细胞系和 PC 异种移植肿瘤小鼠模型被用来研究 BIRC5 在 PC 发育中的表达和功能。此外，我们进一步探讨了 BIRC5 在 ITM 诱导的 PC 恶化中的作用。我们的研究结果有望为 PC 诊断和治疗提供一种新方法。
方法患者样本采集和伦理批准
我们的研究招募了 27 例来自 PC 患者（年龄：32~69​​ 岁，平均：52 岁）的血清样本和来自健康受试者（年龄：29~72 岁，平均：50 岁）的等量血清样本。PC患者经病理诊断为阴茎鳞状细胞癌伴腹股沟淋巴结转移15例。TMN的临床分期按照WHO病理分期法进行。所有患者均于2014年3月至2018年10月在滨州医科大学烟台附属医院确诊，并按照NCCN PS指南进行临床治疗，所有患者均于2014年3月至2018年10月期间接受过近距离放射治疗或化疗。PC 患者接受的具体治疗与之前的研究一致。整个研究符合赫尔辛基宣言。此外，7例患者（年龄：48～69岁，平均：55岁）接受了阴茎切除术并采集了PC及邻近组织样本。患者以淋巴结转移为特征，从淋巴结中收集组织，同时匹配邻近组织，距肿瘤部位 2 cm。术后立即将组织冷冻保存于-80℃。所有患者均提供了书面知情同意书，我们的研究获得了滨州医科大学烟台附属医院机构研究伦理委员会的批准。
细胞培养和炎症治疗
人表皮角质形成细胞（HaCaT）用作正常对照，获自国家细胞系资源基础设施（中国武汉）。PC 细胞系（Penl1 和 Penl2）由中山大学肿瘤中心泌尿外科友情提供。细胞在添加了 10% 胎牛血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 中在 5% CO 2的湿润气氛下于 37°C 培养。
干扰素 (IFN)-γ 购自 Roche (Basel, Switzerland) 并以不同浓度制备。对于浓度和时间梯度筛选实验，在将细胞接种到 96 孔板后，将 IFN-γ 添加到培养基中。为了构建炎症微环境，我们使用 IFN-γ 对转染了短发夹 RNA (shRNA) 的 PC 细胞进行了适当的时间和浓度处理。shRNA 的转染先于 IFN-γ 处理。并且证实了shRNA的转染效率。
细胞转染
为了沉默 PC 细胞中的 BIRC5 表达，由 Invitrogen (CA, USA) 设计和构建 shRNA，并将其连接到慢病毒载体中。然后，将PC细胞以1×10 5细胞/孔的浓度接种到6孔板中，并培养至2×10 5细胞/孔。第二天，将培养基更换为补充有 6 μg/mL 聚凝胺的新鲜培养基。然后，加入慢病毒悬浮液并在 37°C 下孵育 PC 细胞 72 小时。随后，使用氨苄青霉素筛选细胞 10 U/mL。培养后，收集转染样品，评价转染效果及后续功能检测。
异种移植小鼠构建
经滨州医科大学烟台附属医院动物伦理委员会批准，饲养适应实验环境的BALB/c裸鼠（6周龄，17g～23g；北京维塔河提供）约7天。他们可以在没有病原体的笼子里自由地获取食物和水。为了构建异种移植模型，HaCaT 细胞（对照）、不同处理下的 Penl1 细胞（乱序 shRNA；BIRC5 shRNAb、IFN-γ；IFN-γ + 乱序 shRNA、IFN-γ + BIRC5 shRNAb）和 Penl1 以及任何类型的处理（模型）皮下接种（100 µL 含 1 × 10 6细胞）在小鼠被麻醉后的右腋窝。在整个肿瘤生长过程中测量肿瘤大小和重量并计算肿瘤体积。此外，记录小鼠的存活情况。整个研究符合《实验动物护理和使用健康指南》（美国国立研究所），并遵守 ARRIVE 指南。
蛋白质印迹法
PC 细胞中的蛋白质表达均通过如前所述的标准程序进行评估。抗体信息如下：兔多克隆抗BIRC抗体（ab76424；1：1000）、兔单克隆抗基质金属蛋白酶2（MMP2）抗体（ab92536；1：1000）、兔单克隆抗MMP9抗体（ab76003；1：1000） )、兔单克隆抗 E-钙粘蛋白抗体 (ab40772; 1:1000) 和兔单克隆抗 β-肌动蛋白抗体 (ab8227; 1:2000)。所有抗体均获自 Abcam (Cambridge, MA, USA)。通过化学发光试剂（Millipore，MA，USA）观察印迹信号。使用 Image J 软件对蛋白质条带进行定量。
逆转录定量PCR
为了分析 PC 细胞的 mRNA 表达，使用从 Invitrogen (CA, USA) 购买的 TRIzol 试剂盒提取总 RNA。纯化和定量后，按照 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, USA) 的方案，将 50 ng RNA 逆转录为一级 cDNA。然后，在 ABI 序列检测系统（7500，Applied Biosystems，Foster City，USA）上进行 qPCR。为了计算目标基因的最终表达水平（相对），我们进行了 2 -ΔΔCt方法并使用 β-actin 作为参考基因。设置含有BIRC5序列的质粒作为阳性对照，监测RT-qPCR反应体系是否正常。
细胞活力检测
如前所述，使用 CCK-8 试剂盒（Beyotime，上海，中国）评估细胞活力。将 PC 细胞接种到 6 孔板中，并用 shRNA 和 IFN-γ 处理。之后，再加入 CCK-8 溶液 1 小时。通过自动酶标仪（Molecular Devices，USA）在 450 nm 处测量光密度（OD）值。
迁移和入侵
为了评估 PC 细胞的迁移能力，我们将它们以每孔 5 × 10 5 个细胞的密度接种在 6 孔板中并培养 48 小时以达到汇合。然后，在无菌条件下将划伤伤口放置在中央孔中。24 小时后，在共聚焦显微镜（Roche，Basel，Switzerland）下检测到载玻片伤口距离。
进行 Transwell 测定以测量细胞侵袭。Transwell 小室（8 µM，Sigma，St. Louis，USA）用 Matrigel (50 µL) 预处理，PC 细胞在 37℃ 下生长 36 小时。然后，我们分别用无水乙醇和结晶紫固定和染色膜上的侵入细胞。最后，用冰醋酸洗脱细胞，并在酶标仪（Corning Inc.，NY，USA）上在 570 nm 波长下定量。
统计分析
所有数据均表示为平均值±平均值标准误差 (SEM)，并在经过 Graphic Prism 软件处理后从多个独立实验（至少三次重复）中获得。使用两个尾t检验和单向方差分析分析来评估组间的差异。p  < 0.05 被认为具有统计学意义。

结果BIRC5 在 PC 进展中上调
在我们的研究中，首先评估了 BIRC5 在 PC 发育中的表达谱。根据图 1A，与健康供体相比，PC患者血清中BIRC5的mRNA水平显着升高。我们还发现，与邻近组织相比，患者的 PC 组织中BIRC5 mRNA（图 1 B）和蛋白质（图 1 C）的表达显着上调。此外，在 mRNA 和蛋白质水平方面，Penl1 和 Penl2 细胞均显示出比 HaCaT 细胞显着升高的 BIRC5 表达（图 1 D 和 E）。
图。1
BIRC5 在 PC 进展期间被上调。RT-qPCR检测PC病例血清( A )和组织( B )以及PC细胞(Penl1和Penl2)( D )中BIRC5 mRNA的表达。**代表p  < 0.01 vs HacaT 细胞 ( D )。（C和E ）使用蛋白质印迹研究PC组织（ C）和细胞（E）中BIRC5蛋白的表达。列表示为平均值 ± SEM ( n  ≥ 3)

沉默BIRC5抑制PC细胞的生长和运动

如图2A所示 ，发生淋巴结转移的PC患者血清中BIRC5的表达显着高于非转移组。接下来，我们进行了功能丧失测定以研究 BIRC5 对 PC 发育的影响。效率分析证实shRNAb可以有效阻断BIRC的mRNA和蛋白表达（图2B 和C）。正如预期的那样，沉默 BIRC5 抑制了 PC 细胞的生长（图 2D）。Penl1 和 Penl2 细胞的迁移和侵袭能力也被 BIRC5 shRNAb 的转染抑制（图 2 E 和 F）。此外，BIRC5 沉默显着抑制 MMP2 和 MMP9 的蛋白质水平，同时促进 E-cadherin 表达（图 2）。 2G )。证据表明 BIRC5 抑制减弱了 PC 细胞的生长和运动。
图 2
沉默 BIRC5 抑制了 PC 细胞的细胞活力、迁移和侵袭。( A ) 使用 RT-qPCR 检测 BIRC5 的表达。用shRNA慢病毒载体转染PC细胞。（B和C）通过RT-qPCR和蛋白质印迹证实了BIRC5 shRNA的沉默效率。( D ) 通过 CCK-8、伤口愈合和 Transwell 分析研究细胞活力、迁移和侵袭。( G ) Western blotting 显示目标 EMT 蛋白的表达。列表示为平均值 ± SEM ( n  ≥ 3)。*和**代表p  < 0.05 和p  < 0.01

沉默 BIRC5 减轻了 IFN-γ 诱导的 PC 发育恶化
为了探索炎症对 PC 发育的影响，我们用多功能促炎细胞因子 IFN-γ 处理 PC 细胞。如结果所示，IFN-γ以剂量依赖性方式和时间依赖性方式显着增强PC细胞的活力，除了在24和48小时之间没有显着性差异（图 3A和B）。BIRC5 的表达也被 IFN-γ 刺激上调（图 3 C 和 D）。此外，与 IFN-γ 组相比，与 IFN-γ 组相关的 BIRC5 敲低中的 PC 细胞活力显着降低（图 3 ）E)。Penl1和Penl2细胞的迁移和侵袭能力，以及EMT过程相关蛋白表达（MMP2和MMP9）显着升高，BIRC5沉默降低；并且在 BIRC5 敲低组中 E-cadherin 的抑制表达被逆转（图 3 F、G、H 和 I）。
图 3
沉默 BIRC5 抑制了 IFN-γ 诱导的 PC 细胞过程的恶化。在 IFN-γ 处理（20 ng/mL，24 小时）之前，用 BIRC shRNAb 慢病毒载体转染 PC 细胞。( A和B ) CCK-8测定检测细胞活力。( C、D和E ) 进行 RT-qPCR 和蛋白质印迹测定以测量 BIRC5 的表达。在A和C中，* p  < 0.05 和 ** p  < 0.01 对比 2.5 ng/mL 组，# p < 0.05 和## p  < 0.01 对比 5 ng/mL 组，$$ p  < 0.01 对比 10 ng/mL；在B中，D和E，** p  < 0.01 对比 0 小时，# p  < 0.05 和## p  < 0.01 对比 6 小时，$$ p  < 0.01 对比 12 小时和 24 小时。( F、G和H ) 使用 CCK-8、伤口愈合和 Transwell 方法评估细胞活力、迁移和侵袭。(一)免疫印迹法检测EMT蛋白的表达。列表示为平均值 ± SEM ( n  ≥ 3)。* p  < 0.05 和** p  < 0.01

BIRC5 敲低在体内抑制肿瘤发展和 IFN-γ 诱导的 PC 肿瘤恶化
我们接下来验证了 BIRC5 在 IMT 条件下在 PC 开发中的作用。BIRC5沉默组的形态学大小、肿瘤体积和重量均显着低于模型组；IFN-γ 显着增加了小鼠 PC 异种移植肿瘤的这些指标，而 BIRC5 也削弱了 IFN-γ在体内的作用（图 4 A、B 和 C）。此外，与模型组相比，BIRC5敲低明显提高了PC小鼠的存活率；IFN-γ 加速了小鼠的死亡，而BIRC5沉默延长了那些在 IFN-γ 刺激下的 PC 小鼠的存活时间（图 4D）。
图 4
沉默 BIRC5 抑制了 PC 异种移植小鼠的肿瘤生长和存活。将不同组的 Penl1 细胞（100 µL，含 1 × 10 6 个细胞）（scrambled shRNA、BIRC5 shRNAb、IFN-γ + scrambled shRNA；IFN-γ + BIRC5 shRNAb）和 HacaT 细胞（对照）在右侧腋窝皮下接种后小鼠被麻醉。活体小鼠肿瘤生长的图像。( B、C和D )测量肿瘤体积和肿瘤重量并计算存活率。列表示为平均值±SEM。*和**代表 与乱序 shRNA 组相比p  < 0.05 和p < 0.01。## 与 IFN-γ + 乱序 shRNA 组相比，p < 0.05 。每组n  = 5
讨论
细胞过程与BIRC5功能的关系越来越受到人类生理发育和医学研究领域的关注。科学家们发现，在神经母细胞瘤中，BIRC5 的高度激活抑制了线粒体的呼吸并诱导其断裂，最终通过阻止活性氧的积累导致 Foxo3 依赖性细胞凋亡 。吉尔-库利克等人。表明 BIRC5 是细胞有丝分裂的关键介质，并维持人类干细胞的分化。此外，新兴研究报道，BIRC5 在多种癌组织中的表达异常升高，在肿瘤的恶性进展中发挥了关键作用。已在肺腺癌中鉴定出 BIRC5 的高表达水平，并且与患者远处转移和携带肿瘤的高风险有关。Kimia 及其同事发现 BIRC5 拷贝数增加与乳腺癌个体之间存在显着相关性。此外，Marchi 等人的分子数据生成研究。表明 BIRC5 过表达与 PC 患者的不良生存率密切相关。我们的研究证实了 BIRC5 在 PC 血清和组织以及细胞系中的异常上调，这可能表明 BIRC5 作为 PC 的预后生物标志物。
此外，本研究表明，BIRC5 沉默同时显着抑制细胞增殖、迁移和侵袭，以及体内肿瘤生长。与我们的研究结果相似，BIRC5 的致癌作用已在其他肿瘤疾病中得到揭示。例如，玛丽娜等人。发现 U251-MG 细胞（胶质瘤细胞）中 BIRC5 水平升高导致 DNA 损伤恶化和染色体结构畸变，促进细胞增殖并减少细胞凋亡。使用 YM155 抑制剂阻断 BIRC5 表达有效降低卵巢癌细胞的迁移和侵袭率，EMT、迁移和侵袭也受到抑制。除此之外，下调 BIRC5 可提高抗骨髓瘤药物的效率并引发细胞凋亡，从而为多发性骨髓瘤带来治疗益处。
新兴研究表明，长期炎症是诱发肿瘤发生和恶性肿瘤的一个严重因素。在持续的炎症条件下，细胞代谢和体内平衡被中断，导致肿瘤的侵袭性生长。众所周知，肿瘤微环境是肿瘤细胞最接近的生长环境，为肿瘤的进化提供了基础。此外，被招募到肿瘤微环境中的免疫细胞分泌的炎性细胞因子被证实可诱导不可控的细胞增殖和抗死亡。这些表明肿瘤微环境中发生的炎症改变与癌症疾病的发展有重要联系。在 LPS 诱导的炎症条件下，结直肠癌细胞的细胞活力、侵袭和 EMT 过程得到了促进。另一项证据表明，IFN-γ 在其异种移植模型中刺激了胃肿瘤的生长和转移。一致地，我们的研究表明，IFN-γ 显着促进了 PC 细胞的增殖、迁移和侵袭，以及体内肿瘤的生长，而 BIRC5 的敲低则逆转了这些作用。

结论
我们发现 BIRC5 在 PC 组织和细胞系中上调。沉默BIRC5抑制PC细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，ITM 加重了 BIRC5 抑制减弱的 PC 进展。BIRC5 对肿瘤生长的影响也在 PC 异种移植模型小鼠中得到验证。我们的研究提供了 BIRC5 作为 PC 的潜在诊断和治疗靶点。