2021 年台湾人感染重配猪源 A(H1N2)v 流感病毒

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背景
通过流感病毒实验室监测系统发现一例感染新型流感病毒的病例。通过病毒培养和/或实时 RT-PCR 对临床标本进行检测。通过基因测序和系统发育分析鉴定并表征了该病毒。

结果

值得注意的是，A/Taiwan/1/2021(H1N2)v 的 HA 和 NA 基因分别属于台湾猪特有的特定进化枝，并被提议在不同时期从人类引入。人和猪之间的双向传播有助于流感病毒的多样性，并构成下一次大流行的威胁。

背景

甲型流感病毒感染多种宿主物种，包括禽类、猪和人类，并引起轻微至严重的症状，从而导致沉重的疾病负担。甲型流感病毒可引起跨物种感染，导致产生导致全球大流行的新型病毒变种，例如 1918 年的甲型流感（H1N1）、1957 年的甲型（H2N2）、1968 年的甲型（H3N2）和甲型流感病毒。 (H1N1)pdm09 在 2009。一般来说，猪被认为是产生大流行病毒的“混合容器”宿主，因为它们可以被禽流感病毒和人类甲型流感病毒感染。2009 年的流感大流行证明了这一假设，因为它是由猪源甲型 H1N1 流感病毒引起的，该病毒具有最近北美 H3N2 和 H1N2 猪病毒（禽/人/猪“三重”重配病毒）与欧亚禽类的独特重组- 像猪病毒。经过四重重组后，该病毒含有北美禽病毒来源的 PB2 和 PA 基因，人类 H3N2 病毒来源的 PB1 基因，经典猪病毒来源的 HA、NP 和 NS 基因，以及欧亚禽病毒的 NA 和 M 基因。像猪病毒一样起源。然而，大流行性病毒从人类到猪的反复溢出，导致病毒大量进化，并在全球范围内为猪播种了新的病毒多样性。在美国，甲型 H1N1 流感病毒于 1930 年首次从猪中分离出来，并被认为源自 1918 年的人类大流行病毒。此后，随着人类和禽流感 A 病毒在不同时期多次引入猪群，通过亚型间和亚型内的重组产生了 A(H1) 和 A(H3) 病毒的多种基因型和进化枝 . 后来，在 2009 年大流行后，人类甲型流感（H1N1） pdm09病毒的病毒基因库被重新引入猪群，导致猪中不同基因型的循环，增加了下一次大流行的威胁。由来自 A(H1N1)pdm09 的内部蛋白基因的 A(H1)v 和 A(H3)v 流感病毒引起的人类感染已有零星报道 。在这项研究中，我们报告了一例感染猪流感 A(H1N2)v 重配病毒的病例，该病毒含有来自台湾猪流感 A(H1N2) 的 HA 和 NA 基因片段以及来自人类 A(H1N1)pdm09 病毒的 6 个内部基因。 . 我们介绍了在台湾长期建立的猪流感病毒，该病毒含有独特的 HA 基因（来自经典猪 A(H1N1)）和人源 NA 基因（来自 A(H3N2)，1970 年代）。我们还对感染猪流感 A(H1N1) 和 A(H1N2) 的人类分离株的病毒全基因组序列进行了表征和比较，强调了 2009 年大流行后猪流感遗传多样性的地理差异增加。

方法

临床标本和病毒分离物的收集

在台湾，有一套完善的流感病毒实验室监测系统在社区传播。临床标本通常从患有流感样疾病的门诊患者处收集，并运送到委托实验室通过病毒培养和/或实时 RT-PCR 进行流感检测。从阳性病例中获得的所有流感分离株都被运送到台湾疾病控制中心 (CDC) 进行进一步的病毒学鉴定。该监测系统由台湾疾病预防控制中心协调，并作为迅速应对每年季节性流感流行或由新型病毒株引起的意外大流行的基础。

流感病毒基因测序和系统发育分析

为调查本研究中鉴定的甲型流感（H1N2）v病毒的分子系统发育，美国2015年至2021年期间鉴定出的具有代表性的甲型流感（H1N1）v病毒的全基因组序列（（H1N1）v (H1N2)v)、德国 ((H1N1)v)、荷兰 ((H1N1)v)、丹麦 ((H1N1)v)、加拿大 ((H1N2)v) 和巴西 ((H1N2)v) 以及人类季节性流感 A(H1N1)、A(H1N1)pdm09 和 A(H3N2) 病毒在 1968 年至 2019 年之间分离，选择了几种猪和禽流感 A 病毒作为参考序列并包括在详细分析中（附加文件1：表 S1） . 如前所述 [ 20 ] 进行病毒 RNA 提取和病毒基因的核苷酸序列分析]。使用 MEGA6 软件  和 BioEdit基于核苷酸序列进行多序列比对、蛋白质翻译和系统发育分析。使用邻接法构建系统发育树，并进行 1000 次自举复制以评估稳健性。

序列信息

分析了 A/Taiwan/1/2021(H1N2)v 病毒的全长基因组序列，以研究该病毒的系统发育和遗传特征（GISAID 登录号 EPI1918923-EPI1918930）。

结果

患者和流行病学调查

通过全国实验室监测网络，从居住在台湾中部县的一名 5 岁儿童身上分离出 A(H1N2)v 流感病毒。她分别于 2021 年 3 月 12 日和 13 日出现咳嗽和发烧症状，并于 3 月 14 日到当地医院急诊科就诊。入院时采集了咽拭子标本，经快速免疫层析检测为甲型流感阳性，并进一步进行流感病毒分离。奥司他韦在入院当天凭经验服用，无需住院。共通知了她的曾祖母、祖父、祖母、父亲、母亲和弟弟等6名家庭成员，其中4人（祖父、祖母、父亲和母亲）是养猪场工人。值得一提的是，父亲，母亲和弟弟在 3 月 15 日至 22 日期间出现了轻微的呼吸道症状（咳嗽或流鼻涕）；然而，没有采集呼吸道样本或进行流感检测。病例患者及其弟弟有时会与家人一起去养猪场度假，根据流行病学调查，他们没有直接接触猪。

甲型流感（H1N2）v病毒的病毒分离和系统发育分析

该病毒在MDCK细胞中成功繁殖。一个当地实验室使用实时 RT-PCR 对网络流感监测进行初步鉴定，结果显示一种非亚型甲型流感病毒，因为只有甲型流感的基质蛋白 (M) 基因检测呈阳性，而针对 HA 基因的亚型检测人类 A(H1)pdm09 和 A(H3) 病毒均为阴性。病毒分离物随后被送往台湾疾病预防控制中心，并根据病毒 HA 和 NA 基因的全长序列（命名为 A/Taiwan/1/2021(H1N2)）进一步定性为 A(H1N2)v 亚型v，简称TW01/21）。此外，还于 2021 年 4 月 8 日从所有 6 名家庭成员那里获得了咽拭子样本，并且在台湾 CDC 的实时 RT-PCR 检测中均检测出流感病毒阴性。

成功确定了TW01/21病毒的全长基因组序列。关于 TW01/21 与其他全球确定的甲型（H1）v 流感病毒的进化关系，对八个病毒基因片段进行了系统发育分析。基于病毒 HA 基因序列的系统发育（图 1 A），TW01/21 被命名为进化枝 1A（经典猪样），其命名法与世界卫生组织 (WHO)  一致。]。TW01/21 与最近发现的来自加拿大 (A/Alberta/01/2020(H1N2)v, 1A.1, 经典猪样)、丹麦 (A/丹麦/1/2021(H1N1)v, 1A.3, 经典猪类, H1pdm09 谱系), 巴西 (A/Parana/3625/2020(H1N2)v, 1B, 类人类季节性), 德国 (A/Hessen /47/2020(H1N1)v, 1C.2, 欧亚禽猪样）和荷兰（A/Netherlands/10370-1b/2020(H1N1)v, 1C.2, 欧亚禽猪样）。此外，TW01/21 的 HA 表明该病毒属于特定亚群，仅包含 2002 年至 2013 年期间在台湾分离的多种猪流感 H1 病毒，并且与 2013 年发现的病毒聚类最接近。 TW01/21 是人类季节性病毒，与台湾猪流感 A(H1N2) 病毒聚集， 1B )。其余 6 个内部蛋白基因（PB2、PB1、PA、NP、M 和 NS）都被建议与 H1N1pdm09 谱系的人类甲型流感（H1N1）病毒一起位于进化枝中（附加文件2：图 S1），表明TW01/21 病毒是一种 2 + 6 重配病毒。

图。1



A/Taiwan/1/2021(H1N2)v病毒A HA和B NA表面蛋白编码基因的系统发育关系。指出了特定进化进化枝的分类。最近在加拿大、丹麦、巴西、德国和荷兰发现的 A(H1)v 流感病毒作为参考序列以粗体显示。指示超过 70 的分支值

TW01/21 病毒的分子特征

还研究了与宿主适应、受体特异性、发病机制和抗病毒耐药性相关的分子特征（表1）。该病毒在 HA 蛋白中具有标记 190D 和 225D（H3 编号），表明优先结合人型流感受体。未检测到 NA 蛋白中的替代物，包括 E119V、I222L、R224K 和 R292K，它们会损害对神经氨酸酶抑制剂的敏感性。然而，鉴定出 M2 蛋白中的 S31N 取代，表明对 M2 离子通道抑制剂具有抗性。此外，该病毒的HA裂解位点不含多元氨基酸残基（PSIQSR/GLF），表明该病毒属于低致病性类型。还检测到与小鼠聚合酶活性增加有关的聚合酶酸性 (PA) 蛋白中的 L336M 取代。




表1 A/Taiwan/1/2021(H1N2)v病毒的分子分析

表2总结了基于完整基因组系统发育的 2020-2021 年 TW01/21 和其他 A(H1)v 病毒的遗传星座。因此，这些 A(H1N1)pdm09 样内部蛋白基因也在属于不同 HA 进化枝的加拿大、丹麦和巴西的 A(H1)v 病毒中检测到，这表明与人类 A(H1N1) 发生进化枝内和进化枝间重配有关。 pdm09 病毒介于甲型猪流感病毒之间（表2）。此外，TW01/21 的内部蛋白基因与 2007 年之前发现的台湾猪流感 A(H1N2) 病毒（经典猪样）在系统发育上分离，表明人类 A(H1N1)pdm09 病毒引入猪群2009年大流行后的台湾。



表 2 A/Taiwan/1/2021(H1N2)v 病毒的基因组讨论

由于猪种群的地理隔离以及从人类或鸟类中多次引入的病毒，猪流感病毒在不同大陆和地区之间存在遗传差异。在台湾，在 2009 年甲型 H1N1 流感大流行之前，国内流行的猪流感 H1 病毒的 HA 基因属于 1A.1（经典猪谱系），被认为起源于人类甲型 H1N1 ) 1918 年大流行。在 1968 年人类 A(H3N2) 流感大流行期间，人类 A(H3N2) 病毒传播给猪，并于 1969 年在台湾屠宰场检测到。人们认为猪流感的类人N2基因是在当时或之后被引入台湾猪群的。2009 年大流行后，人类 A(H1N1)pdm09 病毒的基因片段被重新引入地方性猪病毒，从而产生了 TW01/21 病毒。关于病毒基因的祖先起源，TW01/21 被认为从三种不同的人类大流行中获得了不同的基因片段：1918 年 A（H1N1）的 HA 基因、1968 年 A（H3N2）的 NA 基因和来自 6 个内部基因2009 A(H1N1)pdm09 病毒。值得注意的是，系统发育树中的HA和NA基因与台湾猪流感的基因形成了一个独特的簇（图 1)，表明 HA 和 NA 基因以单独和孤立的方式进化。由于人和猪流感病毒的进化和流行病学特征不同，一些从人类病毒引入的病毒基因在猪群中持续存在并“冻结”了几十年。然后，这些病毒重新感染新一代易感人群，并可能导致新的人类大流行。在本研究中，台湾猪A(H1N2)/A(H3N2)和TW01/21病毒的N2基因与1980年代人类A(H3N2)病毒的N2基因接近（图 1），与N2基因不同1990 年代北美猪病毒（例如 A/Alberta/01/2020）与人类 A(H3N2) 更密切相关（图 1)，表明不同地区的猪甲型流感病毒的N2基因是从不同时期的人甲型流感病毒中引入的。2009 年大流行后，A(H1N1) pdm09的基因片段被重新引入猪群，导致猪群中不同基因型的循环。偶尔检测到人类感染了带有 A(H1N1)pdm09 病毒基因库的重配猪流感病毒，据报道，带有A(H1N1)pdm09基因的欧亚禽类猪流感A(H1N1)病毒促进了人类感染。尽管目前从人类患者中分离出的猪流感病毒与在各个地区或国家的猪群中已知的地方性流行病相似，这些人类分离的猪流感毒株之间的动态和高度遗传多样性提高了在人类之间传播的可能性。人和猪病毒的复杂界面有助于病毒多样性并构成流感大流行的威胁。加强动物流感病毒监测与人流感病毒监测的整合与合作具有重要意义。我们的研究有一些局限性。首先，尽管 TW01/21 的 HA (91.5%) 和 NA (95.5%) 基因与 A/swine/Taiwan/NPUST0003/2013(H1N2) 和 A/swine/Taiwan/NPUST0011/2013 (H1N2) 基因的相似性最高病毒，我们无法识别可能与当前感染有关的当代猪流感病毒，因为缺乏足够的来自开源的台湾猪流感病毒的序列信息。第二，无法确定指示病例及其家庭成员之间的家庭传播，因为他们的急性期血清无法获得。然而，尽管由于缺乏证据表明她与养猪场的猪有直接接触，指示病例的传播来源尚不清楚，但我们的数据表明这种感染可能存在猪-人传播途径。

结论

在这项研究中，我们发现了一个感染人类病例的病例，该病毒感染了一种新型重配病毒，该病毒含有源自可能在台湾流行了数十年的猪流感 A（H1N2）病毒的 HA 和 NA 基因片段，以及其他 6 个内部基因（PB2、PB2 、PA、NP、M 和 NS) 来自人类 A(H1N1)pdm09 病毒。系统发育分析表明，HA 和 NA 基因分别属于台湾猪特有的特定进化枝，并被提议在不同时期从人类引入。人和猪之间的双向传播有助于流感病毒的多样性，并构成下一次大流行的威胁。