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摘è¦
明场 (BF) å…‰å¦æ˜¾å¾®é•œæ˜¯ä¸€ç§ä¼ 统的生物æˆåƒå·¥å…·ï¼Œæœ€è¿‘åœ¨è¯„ä¼°æ ‡æœ¬å½¢æ€æœŸé—´è¿›è¡Œäº†æ·±åº¦è¾¨åˆ«æµ‹è¯•ï¼›ç„¶è€Œï¼ŒçŽ°æœ‰æ–¹æ³•éœ€è¦ä¸“用仪器或广泛的计算机建模。我们报告了一ç§åœ¨ BF 显微镜ä¸è¿›è¡Œä¸‰ç»´ (3D) æˆåƒçš„ç›´æŽ¥æ–¹æ³•ï¼Œé€‚ç”¨äºŽæ— æ ‡è®°æ ·å“,我们在相干状æ€ä¸‹ä½¿ç”¨ç§‘å‹’ç…§æ˜Žå’Œä¼ ç»Ÿçš„æ•°å—图åƒå¤„ç†æ»¤æ³¢å™¨æ¥å®žçŽ°å…‰å¦åˆ‡ç‰‡ã€‚通过å¯è§†åŒ–真èŒã€åŠ¨ç‰©ç»„织和æ¤ç‰©æ ·æœ¬å¹¶ä¸Žå…‰ç‰‡è§å…‰æ˜¾å¾®é•œæˆåƒè¿›è¡Œæ¯”较,我们è¯æ˜Žäº†è¯¥æ–¹æ³•çš„å‡†ç¡®æ€§å’Œé€‚ç”¨æ€§ï¼Œå±•ç¤ºäº†æ ‡å‡†æ˜¾å¾®é•œå¦‚ä½•æˆä¸ºä¸€ç§æœ‰æ•ˆçš„ 3D æˆåƒè®¾å¤‡ã€‚
ç»å…¸çš„明场 (BF) 显微镜是任何生物实验室ä¸å¯æˆ–缺的工具,通常用于评估染色二维 (2D) æ ·å“ä¸çš„细胞或组织形æ€ã€‚然而,在没有染色的情况下,相ä½å¯¹è±¡çš„ BF 图åƒæ˜¾ç¤ºçš„对比度很å°ã€‚å‡ ç§æˆåƒæ–¹å¼è§£å†³äº†è¿™ä¸€é™åˆ¶ï¼Œä»ŽçŽ°åœ¨å¹¿æ³›ä½¿ç”¨çš„早期替代方案(例如,Zernike 相ä½å¯¹æ¯”和微分干涉对比)到å…许对å¤æ‚æ ·å“场进行定é‡æµ‹é‡çš„最新进展(例如,定é‡ç›¸ä½å¯¹æ¯”)。
尽管å˜åœ¨ç¼ºç‚¹ï¼Œä½† BF ä»ç„¶å…·æœ‰å¸å¼•åŠ›ï¼Œå› 为它是一ç§ç®€å•ã€å¿«é€Ÿä¸”廉价的显微镜方法,与è§å…‰æ˜¾å¾®é•œç›¸æ¯”,光æŸä¼¤å’Œå…‰æ¯’性大大é™ä½Žã€‚BF ä¸çš„三维 (3D) æˆåƒæ˜¯é€šè¿‡å°†ä»Žä¸åŒè§’度获å–的多个图åƒå¤„ç†æˆå•ä¸ªé‡å»ºæˆ–使用深度å¦ä¹ æ¥é¢„测 3D è§å…‰ä¿¡å·èŽ·å¾—的,尽管有专门的仪器或广泛的计算机需è¦å»ºæ¨¡ã€‚
从广义上讲,从相应的输出图åƒé‡å»ºè¾“入对象构æˆäº†æ˜¾å¾®é•œä¸ä¼—所周知的逆问题。åå·ç§¯æ˜¯è§£å†³æ¤é—®é¢˜çš„一ç§æ ‡å‡†æ–¹æ³•ï¼Œé€šå¸¸åˆ†æžå‚…里å¶åŸŸä¸çš„图åƒï¼Œå¹¶å·²æˆåŠŸåº”用于 2D ä¸çš„ BF。在这里,我们介ç»äº†æ˜Žåœºæ˜¾å¾®é•œ (OSBM) ä¸çš„å…‰å¦åˆ‡ç‰‡ï¼Œè¿™æ˜¯ä¸€ç§åŸºäºŽåœ¨çœŸå®žç©ºé—´ä¸åˆ†æžç›¸ä½ç‰©ä½“的高对比度 BF 图åƒçš„ 3D 图åƒé‡å»ºæ–¹æ³•ã€‚
结果在具有科勒照明的 BF ä¸ï¼ˆå›¾ 1 A),é™ä½Žèšå…‰é•œçš„数值å”径 (NA),建立相干状æ€ï¼ˆNAèšå…‰é•œ= 0)。然而,通过引入接近景深的散焦é‡ï¼Œæˆ‘们å‘现 BF æˆåƒä¸Žåœ°é¢å®žå†µå¾ˆå¥½åœ°å¯¹åº”(图 1 Cå’ŒSI 附录),这表明å¯ä»¥ä»Ž BF ä¸æå–å‡†ç¡®çš„æ ·æœ¬ä¿¡æ¯ã€‚
图。1。
OSBM的原ç†ã€‚(一)我们的高炉显微镜设置示æ„图,显示照明和散射光线(ç°è‰²å’Œç»¿è‰²ï¼Œåˆ†åˆ«ï¼‰ã€‚镜头被æ绘为åŒç®å¤´ã€‚( B ) BF pPSF 的图åƒï¼Œä½¿ç”¨å‚考文献9ä¸çš„å…¬å¼ 1 计算:λ = 450 nm,n = 1.0,NA物镜= 0.1;视野() OSBM(圆盒)的数å—管é“和活的T. atrovirideæ ·æœ¬çš„ç»“æžœå›¾åƒã€‚( E ) D (红色)ä¸æ˜¾ç¤ºçš„ OSBM 的“最终图åƒâ€ä¸Žç›¸åº”çš„ LSFM 图åƒï¼ˆç»¿è‰²ï¼‰çš„å åŠ ã€‚
å› æ¤ï¼Œç¡®å®šäº†ä¸€ä¸ªé€†æˆåƒé—®é¢˜ï¼Œå…¶ä¸å…·æœ‰è½´å‘强度梯度的 BF 图åƒå †æ ˆæž„æˆäº†è¾“出信å·ã€‚æˆ‘ä»¬é€šè¿‡ä½¿ç”¨æ ‡å‡†æ•°å—处ç†æ»¤æ³¢å™¨ ( 11 )找到这些梯度æºçš„è½´å‘ä½ç½®æ¥é‡å»ºè¾“å…¥ 3D å¯¹è±¡ã€‚å› æ¤æ‰¾åˆ°çš„点集对应于组æˆæ ·æœ¬çš„散射结构。
OSBM 程åºåŒ…括在 Köhler 照明 (Ï‚ = 0.1 至 0.2) 下æ“作 BF 显微镜,æ•èŽ·æœªæŸ“è‰²æ ·å“çš„zå †æ ˆå›¾åƒï¼Œå¹¶å°†ä»¥ä¸‹æ•°å—管é“应用于图åƒï¼ˆå›¾1D)。首先,从原始 BF 图åƒä¸è¿‡æ»¤æŽ‰å¤§çš„空间结构。其次,通过执行æˆå¯¹å›¾åƒå‡æ³•è®¡ç®—z梯度,然åŽè¿›è¡Œé«˜æ–¯å¹³æ»‘。最åŽï¼Œåº”用一个过滤器æ¥çªå‡ºå°è€Œæ˜Žäº®çš„特å¾ï¼ˆä¾‹å¦‚白色礼帽)。) 对应物,使用光片è§å…‰æ˜¾å¾®é•œ (LSFM)。OSBM äº§ç”Ÿçš„æ— èƒŒæ™¯ã€è½´å‘定ä½çš„斑点与 LSFM 产生的斑点有很好的é‡å (图 1 E)。
为了演示使用 OSBM çš„ 3D æˆåƒï¼Œæˆ‘们首先考虑一个活的ä¸çŠ¶ç½‘络 ( T. atroviride ),其ä¸æ•£å°„结构定ä½è‰¯å¥½å¹¶ä¸”大部分彼æ¤è¿œç¦»ï¼ˆä¸Žç¯ä¸ç›´å¾„相比)。OSBM 的应用导致从模糊(原始 BF)到清晰(最终)图åƒçš„æˆå‰§æ€§è½¬å˜ï¼ˆå›¾2A)。在 OSBM å’Œ LSFM 之间å‘现了æžå¥½çš„一致性(图 2 Aå’ŒB),能够对èŒä¸ç»“构进行适当的 3D 渲染(图 2 C和电影 S1)。由于 OSBM ä¸ä½¿ç”¨çª„èšç„¦æ¿€å…‰æŸï¼Œå› æ¤å¯ä»¥åœ¨æ•´ä¸ªè§†é‡ŽèŒƒå›´å†…产生清晰的图åƒï¼Œä»Žè€Œè¡¥å…… LSFM。
图 2。
æµ‹è¯•æ ·å“çš„ OSBM æˆåƒå¹¶ä¸Ž LSFM 进行比较。( A - C ) 真èŒæ ·æœ¬ã€‚( D - F ) æ¾„æ¸…çš„è¡€ç®¡æ ·æœ¬ã€‚( Aå’ŒD ) BFã€OSBM å’Œ LSFM 的最大强度投影 (MIP) 图åƒã€‚(Bå’ŒE )分别显示在Aå’ŒDä¸çš„ OSBM(红色)和 LSFM(绿色)的åˆå¹¶å›¾åƒã€‚(Cå’ŒF)从相应的OBSMå…‰å¦æˆªé¢èŽ·å¾—的三维图åƒã€‚Cå’ŒF的视场,1,495 × 1,495 × 1,016 μm 3å’Œ 1,495 × 1,495 × 1,128 μm3,分别。
电影 S1。
å‡è‰²ï¼ŒT. atroviride æ ·å“çš„ OSBM 图åƒæ˜¾ç¤ºåœ¨æ£æ–‡çš„图 2C ä¸ã€‚视野,1495×1495×1016 μm 3。
接下æ¥ï¼Œæˆ‘们测试了具有连ç»æ•£å°„ç»“æž„çš„æ ·æœ¬ï¼Œå³å…‰å¦é€æ˜Žçš„血管(图2D)。该组织的 OSBM 图åƒæ˜¯ç‚¹ç”»å¼çš„,其ä¸ç‚¹çš„集åˆæ供了组织边界和褶皱ç‰ç»“构的清晰定ä½ã€‚OSBM å’Œ LSFM 图åƒä¹‹é—´çš„æ¯”è¾ƒæ˜¾ç¤ºäº†æ•´ä½“æ ·å“å½¢æ€çš„良好对应(图 2 Då’ŒE)。3D é‡å»ºå¦‚图2F和电影 S2所示。
电影 S2。
æ£æ–‡å›¾ 2F æ‰€ç¤ºè¡€ç®¡æ ·æœ¬çš„å‡å½©è‰² OSBM 图åƒã€‚视野,1495×1495×1128 μm 3。
我们应用 OSBM æ¥å¯è§†åŒ–具有ä¸åŒå…‰å¦é€å°„率的未ç»å¤„ç†çš„æ ·å“。一层浸在水ä¸çš„洋葱表皮细胞大部分是é€æ˜Žçš„,å¯ä»¥åœ¨ BF ä¸å®žçŽ°æœ€ä½³å¯è§†åŒ–ã€‚å› æ¤ï¼Œæˆ‘ä»¬åœ¨çºµå‘ ( x - z ) å’Œæ¨ªå‘ ( y - z ) 视图(图 3 A)ä¸è§‚察到特å¾æ´‹è‘±ç»†èƒžå½¢çŠ¶ï¼Œå…¶ä¸å‘¨å£æ›²çŽ‡å¾ˆå®¹æ˜“识别。洋葱细胞的 OSBM-LSFM 比较(电影 S3)显示了 OSBM 在没有è§å…‰çš„地方的良好匹é…和一致的细胞å£æˆåƒï¼Œå¼ºè°ƒäº† OBSM å’Œ LSFM 之间的互补性。由于洋葱细胞å£åŽšçº¦ä¸º 6 μm ( 13),OSBM å¯ä»¥æ£€æµ‹ä»…å‡ å¾®ç±³åŽšçš„å¤ç«‹åŠå¹³é¢æ•£å°„结构(使用 10 å€ç‰©é•œï¼‰ã€‚最åŽï¼Œæˆ‘们考虑了具有显ç€å…‰å¦ä¸é€æ˜Žåº¦çš„æ‹Ÿå—芥幼苗。通过与 LSFM 比较,OSBM æ˜¾ç¤ºäº†ç»†æ ¹æ¯›å’Œé¢å‘ç‰©é•œçš„ç²—æ ¹è¡¨é¢çš„适当 3D æˆåƒï¼ˆå›¾ 3 B和电影 S4)。对于光å¦åŽšçš„ç”Ÿç‰©æ ·å“,使用红外光应该有助于改善 OSBM æˆåƒï¼ˆSI 附录图 3。
洋葱皮和æ¤ç‰©æ ¹éƒ¨çš„ OSBM æˆåƒã€‚( A ) OSBM 应用于一层洋葱表皮,沿x–y(左)ã€y–zå’Œx–z(ä¸ï¼‰æ˜¾ç¤º MIP 图åƒã€‚y–zå’Œx–z图åƒå¯¹åº”于x–y投影ä¸æ˜¾ç¤ºçš„白框。BF 最大强度投影图åƒæ˜¾ç¤ºï¼ˆå³ï¼‰ç”¨äºŽæ¯”较。( B ) æœªæ ‡è®°ã€æœªç»å¤„ç†çš„æ‹Ÿå—èŠ¥æ ¹æ ·å“çš„æˆåƒã€‚3D 渲染的视野,1,495 × 1,495 × 1,008 μm 3。
电影 S3。
ç”¨äºŽçš®è‚¤æ´‹è‘±æ ·æœ¬çš„ OSBM(绿色)和 LSFM(红色)的 yz MIP 图åƒå åŠ é›†ã€‚OSBM 切片始终显示细胞形状,å³ä½¿åœ¨è§å…‰ä¿¡å·è¾ƒå¼±æˆ–ä¸å˜åœ¨çš„地方也是如æ¤ã€‚æ¯ä¸ª MIP 图åƒå¯¹åº”于体积为 36.5 μm × 2111 μm × 1008 μm çš„ ROI,针对ä¸åŒçš„ x ä½ç½®èŽ·å¾—。视野,2111×1008 μm2;图åƒä¹‹é—´çš„分离,Δ× = 73 μm。
电影 S4。
æ£æ–‡å›¾ 3B 所示æ¤ç‰©æ ¹éƒ¨æ ·æœ¬çš„ OSBM 结果的 3D 视图。视野,1495×1495×1008 μm 3。
OSBM 的一个é™åˆ¶æ¥è‡ª pPSF 的对比度å转。当两个散射结构轴å‘è¿žç»æ—¶ï¼Œâ€‹â€‹å®ƒä»¬ä¼šåœ¨ BF 图åƒä¸äº§ç”Ÿé‡å 的过渡区域,从而阻ç¢æ£ç¡®çš„对象定ä½ã€‚与点状结构 ( I ∠r 6 ) 相比,这ç§æ•ˆåº”预计会在强散射物体(如ç¯ä¸ï¼‰ï¼ˆæ•£å°„强度I ∠r 3,其ä¸r是ç¯ä¸çš„åŠå¾„)上显ç€ã€‚在我们的实验ä¸ï¼Œæˆ‘们估计散射结构之间的轴å‘è·ç¦»ä½ŽäºŽ 70 μm(40 μm)会导致èŒä¸ï¼ˆè„‘è†œç»„ç»‡ï¼‰æ ·æœ¬çš„æˆåƒä¸æ£ç¡®ã€‚
总之,OSBM 擅长对光å¦è–„物体和具有低轴å‘ç©ºé—´å¯†åº¦çš„ç»“æž„çš„æ ·æœ¬è¾¹ç•Œè¿›è¡Œæˆåƒã€‚ä½œä¸ºä¼ ç»Ÿ BF 显微镜的数å—扩展和è§å…‰æ˜¾å¾®é•œæŠ€æœ¯çš„补充,OSBM 为 3D 生物æˆåƒæ供了一ç§ç®€å•ã€ç›´æŽ¥ä¸”æ— æ¨¡åž‹çš„æ›¿ä»£æ–¹æ¡ˆã€‚
æ料和方法SI 附录ä¸æ供了详细说明
使用 CLARITY ( 14 )处ç†è„‘膜组织;使用自制装置 ( 15 ) å’Œæ–济 ( 16 ) 进行光å¦æ˜¾å¾®é•œå’Œæ•°å—图åƒå¤„ç†
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