巴基斯坦慢性粒细胞白血病患者细胞色素 P450 和谷胱甘肽 S...

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巴基斯坦慢性粒细胞白血病患者细胞色素 P450 和谷胱甘肽 S 转移酶多态性对尼罗替尼治疗反应的影响
背景
细胞色素 P450 (CYP) 和谷胱甘肽 S 转移酶 (GST) 是重要的生物转化酶，负责抗癌药物和致癌物的解毒。这些酶的多态性可能极大地影响对 CML 的易感性和酪氨酸激酶抑制剂的整体功效。本研究旨在评估 GST 和 CYP 多态性对 CML 发生的可能影响，以及预测巴基斯坦 CML 患者尼罗替尼治疗的治疗结果。
方法
通过 RFLP 或多重 PCR 评估 CYP 1A1*2C、GSTP1 (A3131G)、GSTT1 和 GSTM1 的多态性变异性。通过 qPCR 对 BCR ABL1 转录物进行量化，以监测对尼罗替尼的反应。
结果
CYP1A1*2C 杂合和 GSTP1 纯合多态性似乎是发生 CML 的一个促成因素。总共有 12 名无反应者、66 名反应者和 21 名部分反应者。应答者中最常见的基因型是无效的 GSTM1，其次是 CYP 1A1 和 GSTP1-野生型 ( p  = < 0.05)。而纯合 GSTP1 和 GSTT1 无效基因型仅在尼罗替尼无反应者中显着更高。
结论
因此，可以得出结论，野生型 CYP1A1、GSTP1 和无效 GSTM1 可能经常与接受尼罗替尼治疗的患者的良好结果相关，正如大多数 CML 患者的持续深度分子反应所描述的那样。
背景
慢性粒细胞白血病 (CML) 是一种骨髓祖细胞的血液病。由于不受控制的过度生产，它通常表现为白细胞增多以及骨髓细胞和中性粒细胞的积累。CML 的病因很复杂，并且与过度暴露于辐射有关。CML 的诊断基于是否存在异常易位的染色体，称为费城染色体 (Ph)。由于这种易位，致癌基因 ABL1 从 22 号染色体移动到 9 号染色体上的 BCR 基因，BCR 基因移动到 ABL1 位置，导致 BCR/ABL1 激酶的形成。由此产生的有缺陷的酪氨酸激酶会刺激细胞不受控制的增殖，从而导致细胞凋亡减少，从而导致基因组不稳定。作为一种治疗选择，酪氨酸激酶 (TKI) 的靶向抑制剂，如甲磺酸伊马替尼 (Glivec) 用于治疗 CML。最初它为 CML 患者提供了持续的分子缓解，但高达 33% 的患者由于突变和药代动力学变异性而产生耐药性和/或反应丧失。尼罗替尼 (Tasigna) 是第二代 TKI，它克服了耐药性和反应丧失问题，并实现了对 Ph 阳性 CML 的良好耐受性和反应。它是一种对 BCR ABL1 激酶具有更高选择性的氨基苯基嘧啶衍生物，由于更快、更深入和持续的细胞遗传学和分子生物学特性，被欧洲药品管理局 (EMA) 和美国食品和药物管理局 (FDA) 批准为 CML 的一线治疗药物。回应。相关的肝脏和胰腺毒性可以通过简单的测试进行监测，并且通常是可控的。在治疗白血病时，主要目标是通过靶向 TKI 疗法控制或减少异常细胞增殖。当与 TKI 相关的不良事件超出可接受的限度时，建议更改 TKI。不幸的是，巴基斯坦治疗 CML 的可用 TKI 仅限于伊马替尼和尼罗替尼。据报道，当地人群的 TKI 结构域突变频率很高，建议改用尼罗替尼或普纳替尼作为二线治疗。由于医疗基础设施薄弱和难以负担的长期癌症治疗，尼罗替尼被规定为巴基斯坦慢性和加速期 CML 的一线治疗药物，并对不良事件进行严格监测和管理。需要针对一线尼罗替尼治疗的长期结果及其安全性和有效性进行本地研究来支持这种做法。
此外，在使用第二代 TKI 作为成人 CML 的一线治疗时，不能忽视药物不良反应的风险。许多研究人员的兴趣已经发展到找出在药物代谢酶 (DMEs) 基因中存在种系多态性的耐药性和对 TKI 缺乏反应的任何关联以及有利的 TKI 治疗结果的显着关联（特别是伊马替尼）和 GST 和 CYP 的多态性缺陷已被记录。这些多态性可以调节药物摄取、代谢激活和消除。DME 有助于外源性物质失活和药物生物转化。这些 DMEs 基因中的多态性可能导致这些酶的活性丧失、降低或增加。因此，这些基因的任何缺陷都可能导致治疗失败、不良反应和中毒。人体内的药物代谢分为三个阶段，包括不同的药物解毒酶 DME I 期酶如 CYP 以及 II 期 DME 有助于将脂溶性非极性异生物质转化为极性亲水性无毒代谢物，从而可以很容易地被 III 期转运酶去除。重要的 II 期 DME 之一是 GST，它将异生素与水溶性化合物（如还原型谷胱甘肽 (GSH)、UDP-葡萄糖醛酸、甘氨酸）结合。除了缀合，过氧化氢的还原导致氧化型谷胱甘肽的产生也通过 GST 的作用发生。GST是同工酶的超级家族，进一步分为八类。它们是 mu (M)、theta (T)、pi (P)、alpha (A)、sigma (S)、kappa (K)、zeta (Z) 和 omega (O)。
已广泛报道了不同人群中DMEs多态性患病率的变异性。由于多态性 DME 导致的这些代谢能力差异可能会影响药物代谢并最终影响治疗结果。DME 多态性的药物遗传学筛查可能有助于确定 TKI 的个性化剂量或为无反应的患者提供替代管理。由于缺乏关于巴基斯坦 CML 患者 GST 和 CYP 基因多态性变异频率的大量数据，本病例对照研究旨在确定它们的频率，以估计这些多态性与 CML 易感性增加的可能联系，其次确定GST 和 CYP 多态性对预测 CML 患者 TKI 治疗反应的影响。
方法学习规划
本病例对照研究于 2013 年至 2019 年在卡拉奇国家血液疾病和骨髓移植研究所 (NIBD) 进行。经 NIBD 伦理审查委员会 (NIBD/RD/ 155–37-2013 并符合赫尔辛基宣言的原则。
研究人群
本研究共招募了 99 名 CML 患者和 169 名年龄匹配的健康对照。患者的选择基于临床体征和症状（腹部不适、疲劳、体重减轻和贫血）和费城染色体或 BCR-ABL 基因融合的存在。
治疗和反应定义
为了研究 DME 多态性缺陷对尼罗替尼治疗的个体影响，在进餐 1 小时前接受尼罗替尼 300 mg 每天两次作为一线治疗的患者被纳入研究。治疗反应遵循 ELN 建议 2013。在治疗三个月时将完全血液学反应定义为正常的血细胞计数，没有未成熟的粒细胞、嗜碱性粒细胞或存在原始细胞以及不可触及的脾脏。主要分子反应定义为BCR-ABL/ABL的转录比小于0.1%。深分子反应（轻微和最小）定义为 BCR-ABL/ABL 在 IS 上的转录比率分别小于 0.01% 和 0.0032%。在达到分子反应后的任何时间失去反应和在 12 个月后未能达到分子反应被定义为治疗失败。还确定了 Sokal 风险评分。它被定义为 CML 患者的预后指标，可预测对治疗的反应和诊断时的存活率。患者被分为低、中、高风险，Sokal 评分 < 0.8、0.8-1.2 和 > 1。2分别。反应者是那些已经实现深度和主要分子反应的人。部分反应患者是那些在 3 个月时达到 CHR 的患者，而非反应患者是那些在给定时间点未能达到血液学和分子反应的患者。治疗反应评估的中位随访时间为 47 个月。
DME多态性的分子分析
将新鲜的全血样本收集在 EDTA 管中。制备外周血涂片用于显微镜评估，并通过自动溶血仪Sysmex XN1000（Kobe，Japan）进行细胞计数。使用来自 Qiagen (Qiagen Cat #51,306, USA) 的 QIAmp DNA 试剂盒从全血中分离基因组 DNA。GSTM1 和 GSTT1 基因的遗传多态性分析基于多重 PCR 方法，使用 Rocha 等人先前设计的引物。GSTT1 和 GSTM1 的纯合缺失或无效等位基因导致这些酶不表达，如通过 PCR 不存在扩增产物所证实的那样。β-珠蛋白用作每个样品的内部对照。GSTT1 阳性个体的预期扩增子大小为 480 bp，GSTM1 中的预期扩增子大小为 215 bp。如 Voso 等人所述，通过 RFLP-PCR 分析 GSTP1A313G 和 CYP1A1 * 2C 基因型。 和 Razmkhak 等人。。
统计分析
采用卡方检验比较患者和健康组多态性DMEs的频率。使用统计软件包 SPSS 22 版还确定了风险率和 95% 置信区间。小于 0.05的p值被认为具有统计学意义。索卡尔分数由索卡尔计算器确定。OS 采用 Kaplan-Meier 方法计算。
结果CML患者的临床特征
共有63名男性和36名女性。此外，分别有 97 人和 2 人被诊断为慢性期和加速期的 CML（表1）。在 99 人中，有 66 人是响应者（男性：36 人，女性：30 人）。六名患者因转化为急变危象而死亡（表1）。在功能生化变量中，与健康受试者相比，CML 组中只有 ALP 显着升高（表2）。
表 1 CML 患者的临床特征。

表2 CML患者生化指标


CYP1A1*2C、GSTP1A313G 和 GSTM1/GSTT1 基因型的频率分布

记录了 99 名 CML 患者和 169 名对照队列中 CYP1A1*2C、GSTP1A313G 和 GSTM1/GSTT1 基因型的频率。CYP 1A1*2C 的杂合基因型在 CML 患者中比在对照中更常见，OR 为 2.6（p  = 0.006；表3）。同样，与对照组 21（12%）和 6（4%）相比，CML 患者 20（15%）和 56（38%）的 GSTP1 Ile/Val 和 Val/Val 突变基因型表达显着更高。GSTT1 和 GSTM1 似乎与 CML 的发生无关，无论是单独还是相互结合（表3）。此外，还探讨了不同 DME 基因中多个多态性缺陷的组合对 CML 发生的影响（补充表1）。有趣的是，表3中列出的七种不同组合与 CML 显着相关，风险率为 4.1-11.51。
表 3 CML 患者与对照组 CYP1A1*2C、GSTP1A313G 和 GSTM1/GSTT1 的分布

基因多态性与血液学/分子反应的关联

根据诊断时的 Sokal 评分对患者进行隔离，观察到野生型 GSTP1 与低风险和中等风险组患者显着相关（图 1）。然而，双空缺失（GSTM1 和 GSTT1 均不存在）与高风险 Sokal 相对风险评分显着相关（图 1）。携带 AA 野生型 CYP1A1 基因型的患者具有较高的完全血液学反应率（42.85%）和深度分子反应率（73.33%，表4）。同样，在同时携带 GSTM1 和 GSTT1 基因的患者中观察到完全的血液学反应。注意到 T 缺失患者（50%）的部分血液学反应高于野生型基因（GSTM1/GSTT1，表3）。此外，无效 GSTM1 与主要分子反应显着相关（表4）。未能实现分子反应也受到不同基因组合的影响（补充表2）。有趣的是，Val/Val 在无反应者中显着高。GSTP1 杂合 (Ile/Val) 基因型与 TFS ( p = 0.005)之间存在显着关联， 而野生型 CYP1A1 和 GSTP1 (Ile/Ile) 在无事件幸存者中常见（表5；p  = 0.05）。
图。1
不同 Sokal 风险组中 DME 基因型的频率分布
表 4 CML 患者血液学和分子学反应与基因多态性的关系


表 5 不同基因型对所有治疗结果的影响


DME基因型对所有治疗结果的影响
治疗的总体结果也在平均随访 51.33 个月时确定。对尼罗替尼治疗有 66 名反应者、21 名部分反应者和 12 名无反应者（表5）。有趣的是，野生型 CYP1A1、GSTP1 和 GSTM1 缺失在响应者中非常频繁。部分应答者携带杂合突变基因型 CYP1A1、GSTP1 和野生型 GSTM1/GSTT1，而纯合 GSTP1 基因型与治疗失败显着相关。GSTT1缺失在失败组中也很常见，但未能达到统计学意义。在 99 名患者中，有 6 名患者在接受治疗后死亡，无论其 Sokal 风险评分如何。所有这些患者均为无反应男性，平均年龄为 41 岁。还通过对数秩检验研究了DMEs多态性与尼罗替尼治疗患者的总体生存率之间的关系。GSTM1 和 GSTT1 多态性不影响总生存期。然而，P  = 0.05）。此外，GSTP1A313G杂合突变基因型倾向于影响更好的存活率（对数秩检验P值：0.029，图 2）。
图 2
基于 DME 基因型表示 TKI 治疗后直至死亡作为终点的总生存期（天）的 Kaplan-Meier 生存曲线。CYP1A1 基因型（对数秩检验P  = 0.05）。b GSTP1A313G（对数秩检验P值：0.029）
讨论
TP53、KRAS、DDR2、KLK3等许多调控基因的突变和SNP等遗传改变是癌症易感性增加的主要原因。这些调节基因的变异影响重要细胞过程的调节，例如细胞周期、细胞分化/增殖、DNA 合成/修复、细胞凋亡、外源性和内源性物质的分解或合成以及免疫反应。有几种不同的化学治疗剂用于治疗通过在细胞周期的几乎每一步破坏快速生长的癌细胞来癌症。DME 通过生物转化在这些药物的活化和/或解毒中发挥关键作用 。DME 中多态性缺陷的存在已被证实是不同种族白血病和其他癌症发生和发病机制的一个促成因素。据我们所知，这是第一个包含 DME 多态性缺陷对巴基斯坦 CML 易感性和尼罗替尼治疗结果影响的病例对照研究。以前关于 DME 多态性缺陷与 CML 发生不相关的报道很多。迄今为止，只有少数研究人员记录了 DME 与 CML 风险的关联 。观察结果出现这种差异的一个可能原因可能是暴露于有害环境因素的程度不同，或者不同人群中 DME 多态性缺陷频率的差异导致这些缺陷的积累。第一阶段 DME 中的种系基因多态性 CYP1A1*2C 由于酶的过量产生而导致功能获得。过量 CYP1A1 的存在导致治疗剂的生物利用度降低和有害药物代谢副产物的积累增加，从而导致更多的药物不良事件。在目前的研究中，具有第一阶段 DME CYP 1A1 杂合基因型 (AG) 的健康个体对 CML 的易感性是 2.6 倍。同样，Hadeil 等人也报道了 200 名 CML 患者中 AG 的高患病率（OR：18.38）。GSTM1 和 GSTT1 基因（无效等位基因）的纯合缺失导致这些酶不表达。大约 30-60% 的个体具有 GSTT1 无效等位基因。过去，来自不同人群的 GSTT1 和 GSTM1 无效基因型的存在和 CML 发生的结果不一致。Hishida 等人记录了 GSTT1 无效等位基因对 CML 的一些影响，而在阿根廷人中，GSTM1 和 GSTT1 无效基因型都不是健康个体对 CML 易感性增加的促成因素。同样，在本研究期间，这两个基因的纯合缺失似乎对 CML 发病机制没有影响（表2）。相反，Bhat 等人报道了 GSTT1 的保护作用。来自克什米尔 。与 Rostami 等人的结果相反。GSTP1 杂合基因型 (Ile/Val) 在健康个体中很常见，并且不会单独带来任何 CML 风险。但当与其他 DME 基因型结合时，它似乎对 CML 发病机制的贡献更大，CML 机会相对较高（表 2）。
在 CML 的情况下，BCR ABL1 酶的异常激酶活性通过 TKI 治疗来控制。伊马替尼是第一个成功用于治疗 CML 的 TKI。尽管取得了可喜的成果；由于不一致的药代动力学、TKI 结合位点的遗传变异性和相关毒性，耐药率增加（约 30% 的患者）尼罗替尼被引入作为具有单独结合位点的二线 TKI。根据目前的 ELAN 建议，尼罗替尼可用作一线药物。大多数 TKI 的严重副作用与细胞色素 P450 介导的生物转化对这些 TKI 的代谢激活有关。尼罗替尼被认为比伊马替尼更安全，并且通过 CYP3A 的作用在肝脏中大量代谢。尼罗替尼的肝外代谢（如果有的话）知之甚少。野生型-Cyp1A1的存在，p  < 0.05；表3 )。
只有少数研究表明 DMEs 多态性对 CML 治疗结果的影响。总共有 6 名患者对尼罗替尼没有反应并过期。所有这些患者都存在 DMEs 基因缺陷，并且还携带 T315I 激酶结构域突变，这与 CML 患者的尼罗替尼无反应性相关。因此，可以假设这些患者的猝死也可能与由于二甲醚缺陷导致的生物解毒不足有关。
在马来西亚人中，多态性 GSTP1 基因型和无效 GSTT1 与伊马替尼耐药性相关，类似地，这些基因型在当前研究期间在对尼罗替尼的部分和无反应中很常见。GSTM1 无效基因型的频率与尼罗替尼治疗患者的良好反应显着相关（表5）。此外，患者达到MMR（42.85%）和DMR（40%）的频率也很高，但达不到统计学意义。在研究细胞色素和 GST 的拷贝数变异分析 (CNV) 以预测 TKI 在 CML 中的疗效时，研究人员提出 GSTM1 可能不是预测治疗结果的特异性标志物，但 GSTT1 可能与 CML 相关。因此，无效 GSTM1 似乎在尼罗替尼反应者中很常见，可能对药物反应产生影响。这与之前的研究相反，在之前的研究中，GSTM1 无效等位基因与伊马替尼治疗的 CML 患者的治疗失败有关 。由于药物代谢的增加或减少，活性酶的过量产生或缺乏可能对药物反应产生直接或间接的影响，并可用于药物剂量设计。
结论

本研究得出结论，CYP1A1杂合突变体和GSTP1基因纯合突变体可能是CML发病的一个促成因素。该研究还表明，CYP1A1、GSTP1 和 GSTM1 无效基因型的多态性变异可能会影响 CML 患者的分子反应和治疗结果。应进行更大规模的进一步研究，以评估多态性 DME 基因对治疗相关毒性（如果有）和疾病复发的影响。