RNA 诱导的 tau 原纤维的冷冻电镜结构揭示了一个小的 C 末...

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RNA 诱导的 tau 原纤维的冷冻电镜结构揭示了一个小的 C 末端核心，它可能使原纤维形成成核
意义

电子低温显微镜 (cryo-EM) 的应用极大地扩展了我们对成熟病理性淀粉样原纤维原子结构的理解，但在原纤维形成起始的分子水平上知之甚少。RNA 已被证明是 tau 蛋白原纤维形成的一种辅助因子，并且还已知与其他蛋白质结合，包括 TDP-43、FUS 和 HNRNPA2，这些蛋白质会形成病理性内含物。我们的带有 RNA 的重组 tau 蛋白的冷冻电镜结构揭示了与 RNA 结合的 36 个残基、C 末端原纤维核心，该核心与原纤维轴平行。我们推测这种结构可能代表 tau 原纤维形成的早期步骤。

摘要

在包括阿尔茨海默氏症和肌萎缩侧索硬化症在内的神经退行性疾病中，与 RNA 结合的蛋白质在尸检大脑中以聚集形式存在。有证据表明 RNA 有助于这些病理聚集体的成核。然而，该机制尚未在原子结构水平上进行研究。在这里，我们展示了在 RNA 存在下全长重组 tau 蛋白原纤维的 3.4-Å 分辨率结构，通过电子低温显微镜 (cryo-EM) 确定。该结构揭示了熟悉的注册交叉β淀粉样蛋白支架，但具有跨越残基 Glu391 至 Ala426 的小原纤维核心，这是所有先前研究的 tau 多晶型物的模糊涂层中无序的区域。RNA 在原纤维表面与带正电的 Arg406 和 His407 残基结合，并平行于原纤维轴。添加 RNase 后原纤维溶解，表明 RNA 是原纤维完整性所必需的。虽然这种结构不能与从患者大脑中提取的 tau 原纤维结构同时存在，但可以想象它可以解释 RNA 辅因子的成核效应，然后随着原纤维的成熟而重塑。


阿尔茨海默病 (AD) 的两个病理特征是伴随大脑神经元丢失的细胞外 Aβ 斑块和细胞内 tau 神经原纤维缠结。tau 聚集体在大脑中的沉积也是数十种称为 tau 病变的痴呆和运动障碍的病理标志，包括进行性核上性麻痹 (PSP)、皮克病 (PiD)、慢性创伤性脑病 (CTE) 和皮质基底节变性 (CBD) )。在每种情况下，单体 tau 蛋白堆积形成淀粉样蛋白原纤维，但对原纤维化的触发因素知之甚少。相同的 tau 拷贝堆叠成长的 β-折叠，然后紧密配合形成空间拉链；这些原纤维是所有淀粉样蛋白疾病的共同特征。

辅因子是在体外和体内形成和稳定 tau 原纤维所必需的。在体外，重组 tau 的原纤维化需要肝素、RNA 或花生四烯酸等辅助因子。最近肝素诱导的 tau 丝的电子低温显微镜 (cryo-EM) 结构表明它们是异质的，与 AD 或 PiD 的不同，后者具有更大的原纤维核心和不同的结构。在体内，已知许多辅助因子与 AD 中的神经原纤维缠结有关。这些辅因子已被证明可刺激重组 tau 的 AD 样磷酸化，其中一些辅助因子对于体外播种活性很重要。从 CTE、CBD 和 PSP 患者的大脑中提取的 tau 丝的冷冻电镜结构揭示了归因于未知辅因子的残余密度：CTE 中的疏水性和 CBD 中的阴离子。这些辅因子可以稳定特定的 tau 原纤维多晶型物，并与翻译后修饰一起控制人脑中哪种原纤维多晶型物占主导地位。

RNA 被认为是与肌萎缩侧索硬化症相关的 RNA 结合蛋白 (RBP) 原纤维形成的辅助因子，例如 FUS、TDP-43 和 hnRNPA1。这些 RBP 通过形成核糖核蛋白复合物和参与 RNA 加工步骤（包括可变剪接、应力颗粒形成和 RNA 降解）在基因表达中发挥重要作用。FUS 和 hnRNPA1 等 RBP 通过液-液相分离凝聚形成功能性颗粒。进一步聚集，有时由 RBP 突变促进，导致病理性淀粉样蛋白形成并加速神经退行性疾病的发展。值得注意的是，这些蛋白质包含低复杂性结构域 (LCD)，其通过尚不清楚的机制进一步促进相分离。

尽管 tau 不是真正的 RBP，也不包含 LCD，但RNA 还诱导 tau 凝聚成类似于 RBP的单独相。RNA 与 tau 形成亚稳态复合物。RNA 带负电荷的磷酸骨架被认为与 tau 分子的正电荷相互作用以促进其聚集。这些聚集物具有病理后果。例如，细胞培养和小鼠大脑中含有 RNA 的 tau 聚集体已被证明可以改变前 mRNA 剪接。此外，凝聚相中 tau 分子的拥挤有助于 tau 以交叉 β 方式堆积以产生淀粉样蛋白原纤维。同样，RNA 在体外和体内加速朊病毒传播。

为了了解 RNA 如何在原子水平上与 tau 相互作用并触发原纤维形成，我们确定了 RNA 诱导的重组全长 tau 原纤维的冷冻电镜结构。通过这种结构和相关的生化实验，我们解决了几个问题：1）哪些 tau 残基构成了 RNA 结合位点？2) 为什么从 tau 病患者的尸检大脑中提取的 tau 原纤维中 tau 的 C 末端区域排列不良？3）RNA如何促进原纤维组装的可逆性和调节原纤维的稳定性？4) RNA 在成核或阻止病理性 tau 原纤维多形体的形成中起什么作用？

结果生成全长重组 Tau 原纤维。

为了测试 RNA 是否可以作为辅助因子帮助全长 tau（残基 1 到 441，称为 tau40）的原纤维形成，我们在从小鼠肝脏中提取的总 RNA 存在下孵育 tau40。我们选择小鼠肝脏的 RNA 是因为肝脏的 tau 蛋白比其他器官少。在存在 RNA 的情况下，单体 tau40 聚集成淀粉样蛋白原纤维（图1A）。相反，在没有 RNA 的情况下没有观察到 tau 原纤维，这表明 RNA 诱导了这些原纤维并且可以作为构建块掺入（图1B）。为了确定原纤维是否含有全长 tau 或降解产物，可能是由于 tau 的自切割，将原纤维制成颗粒并洗涤，并使用 SDS/PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）验证它们的分子量。我们观察到由 RNA 诱导的 tau 原纤维主要由全长 tau 组成，并含有少量较高分子量的物种，如图1C所示。
图。1。

RNA 诱导全长 tau 淀粉样蛋白原纤维的形成。（一）在从小鼠肝脏中提取的总 RNA 存在下生长的 tau40 原纤维的负染色电子显微照片。通过将 200 µL 的 50 µM 单体 tau40 与 400 µg/mL RNA 混合在 20 mM 醋酸铵缓冲液 pH7 中制备 Tau 原纤维，并在 37 °C 下振荡孵育 2 天。( B ) 在A的条件下，在没有 RNA 的情况下，单体 tau40 的电子显微照片。( C) tau-RNA 原纤维在 159,000 × g下离心并用无 RNA 水洗涤两次后的 SDS/PAGE 分析。( D ) tau-RNA 原纤维播种活性的量化，在表达 YFP 标记的 tau-K18 的 HEK293 生物传感器细胞中测量。(E）在 HEK293 生物传感器细胞中播种产生的聚集体的代表性图像。用 tau-RNA 原纤维（左）和仅作为对照的 RNA （右）接种的细胞。红色箭头突出显示代表包含聚合的单元格。白色箭头突出显示代表不包含聚集体的单元格。（比例尺，25 µm。）
接下来，我们检查了 tau-RNA 原纤维是否具有在表达 YFP 标记的 tau-K18 的 HEK293 tau 生物传感器细胞中播种 tau 聚集的能力。如图1D和E所示，tau-RNA 原纤维在生物传感器细胞中强烈地播种 tau 聚集，而单独的 RNA 基本上没有播种活性。

RNA 辅因子对于全长 Tau 原纤维的形成和稳定性至关重要。

为了测试 RNA 长度对 RNA 诱导的 tau 原纤维形成的作用，我们使用总 RNA 或用 RNase 处理的 RNA（称为预消化 RNA）进行了体外原纤维化实验。将预消化的 RNA 与 tau40 单体一起孵育，但即使在摇动 60 小时后也没有形成淀粉样蛋白原纤维（图 2）。相反，未消化的 RNA 在同一时间过程中诱导自发原纤维形成，这表明聚合的 RNA 作为辅助因子在诱导 tau 聚集中的作用。
图 2。


RNA 使 tau 能够在体外形成原纤维。（一）在RNA存在下重组tau40的代表性EM图像。（乙）在没有RNA的情况下tau40的EM图像。( C ) tau40 在预消化 RNA 存在下的 EM 图像。（D）仅代表 RNA 的 EM 图像。( E ) 仅消化 RNA 的 EM 图像。通过将 RNA 与 RNase 以 4:1 的比例在 37 °C 下孵育 6 小时来进行 RNA 的消化。（比例尺，100 nm。）

菲乔等人。报道了合成 RNA (polyU) 的存在是维持截短形式 tau 原纤维（称为 tau187，残基 255 至 441）的生长所必需的，即使通过接种肝素诱导的 tau 来消除成核屏障原纤维或小鼠衍生的原纤维。为了研究 RNA 对 tau 播种效率的影响，我们在体外使用 RNA 诱导的 tau40 原纤维在预消化或未消化的 RNA 存在下播种单体 tau。我们观察到在未消化的 RNA 样品存在的情况下 tau 原纤维的强烈播种（SI 附录，图 S1 A）。在消化的 RNA 存在下形成的原纤维越来越少（SI 附录，图 S1 B）。在存在 5% 种子（2.5 µM 超声处理的 tau40 原纤维）和不存在 RNA（ SI 附录，图 S1 C和D ）的情况下，我们没有观察到任何原纤维，这与聚合 RNA 在支持原纤维形成中的关键作用一致。同样，当 RNA 和种子都被 RNase 预消化时，没有观察到原纤维（SI 附录，图 S1 E）。我们推测，如果没有伴随原纤维种子的少量 RNA，消化的 RNA 将不足以产生短的 tau 原纤维，这与在消化的 RNA 和消化的种子存在下播种单体缺乏甚至缺乏的观察结果一致。短纤维状结构。这些结果表明，聚合的 RNA 似乎是自组装和播种活性 tau 原纤维的重要组成部分。

RNA 是 Tau 原纤维的组成部分。

为了从生物化学上评估 RNA 分子是否仍然与 tau 原纤维相关或在原纤维形成时解离，我们进行了共沉淀测定。我们将原纤维制成颗粒并用无 RNA 水洗涤两次。沉淀后，将颗粒重新悬浮在不含 RNA 的水中，通过量化 260 nm 处的光吸收并进行 RNA 电泳来评估 RNA 结合。这些实验表明，主要具有两种分子量的 RNA 被整合到原纤维结构中（SI 附录，图 S2），这与先前报道 polyA RNA 与 tau-K18 和 tau-K19 原纤维结合的研究一致 .
与 RNA 结合的全长 Tau-RNA 原纤维的冷冻电镜结构。为了发现 RNA 如何诱导 tau 聚集，我们确定了 RNA 诱导的全长 tau 原纤维的冷冻电镜结构，总分辨率为 3.4 Å。我们在低温 EM 图像和二维 (2D) 分类中发现了两种原纤维多晶型物：一种原纤维多晶型物是扭曲的，而另一种则没有扭曲。扭曲的种类较多，占原纤维的75%。缺乏扭曲的物种占剩余的 25% 的原纤维，不适合结构测定。扭曲的 tau-RNA 原纤维的节距为 829 Å。它由两条由伪 2 1螺旋轴相关的原丝组成。它表现出 179.16° 的螺旋扭曲和 2.4 Å 的螺旋上升（表 1、图 3 B和SI 附录，图S3）。原丝由平行堆叠的扁平 tau 分子组成，对齐的 β-折叠排列（SI 附录，图 S4）。原纤维核心在 tau 的 C 端附近跨越 36 个残基，从 Glu391 到 Ala426，并包含 5 个 β 链（β1、Glu391 到 Val393；β2、Ser396 到 Ser400；β3、Asp402 到 Pro405；β4、His407 到 Ser413；和β5、Asp418 至 Val420）（图 3 A和E）。值得注意的是，该 tau 区域已被表征为所有先前确定的 tau 原纤维结构中的无序模糊涂层，其中包括来自 AD、CBD、PSP、GGT（球状胶质细胞 tau 病）和 CTE 患者以及肝素的离体原纤维-诱导的原纤维 。
表格1。
 数据收集原子细化统计展开表

	Tau-RNA 原纤维 (PDB: 7SP1)
数据收集和处理
放大	×130,000
电压 (kV)	300
电子暴露 (e –  Å -2 )	52
散焦范围 (μm)	0.76–3.9
像素大小 (Å)	1.06
施加的对称性	C1; 螺旋
螺旋扭曲（度）	179.16
螺旋上升 (Å)	2.40
初始粒子图像（编号）	234,037
最终粒子图像（编号）	26,061
地图分辨率 (Å)	3.4
FSC 阈值	0.143
地图分辨率范围 (Å)	200–3.4
细化
使用的初始模型	从头
模型分辨率 (Å)	3.4
FSC 阈值	0.5
模型分辨率范围 (Å)	200–3.4
地图锐化B因子 (Å 2 )	−233.0
模型构成
非氢原子	4,343
蛋白质残基	540
RNA残基	20
B因子 (Å 2 )	84.4
蛋白质
RMS 偏差
键长 (Å)	0.007
键角 (°)	1.435
验证
MolProbity 评分	1.75
冲突分数	11.67
较差的旋转异构体 (%)	0
拉马钱德兰情节
青睐 (%)	97.1
允许 (%)	0
不允许 (%)	0

图 3。


与 RNA 结合的全长重组 tau 原纤维的冷冻电镜结构。（一）全长tau（tau40，残基1至441）的示意图，包括两个交替剪接的N端结构域和四个微管结合结构域（R1至R4）。我们的 tau-RNA 原纤维结构中有序核心的序列以黑色显示。（乙）我们的 tau-RNA 原纤维的冷冻电镜重建，显示两条相同的左旋原丝（粉红色和黄色）。（C）平行，tau分子（粉红色）和polyG RNA（青色）与原纤维轴平行排列。( D ) tau fibril-RNA 模型的特写视图，显示 Arg406、His407 和 Asp402 以及残基和 polyG RNA 之间的 H 键合。( E) 沿着原纤维轴观察的 tau 原纤维核心的一个横截面层的原子模型和密度图。( F ) tau 原纤维-RNA 相互作用的特写视图，显示 Arg406、His407 残基和 polyA RNA 之间的模拟 H 键合。

残留的冷冻电镜密度条纹沿着两条 tau 原丝的长度延伸，类似于原纤维表面上的 RNA 链（图 3 C和D）。在每个条纹中，我们看到三个相邻的密度类似于磷酸盐、核糖和碱基部分的斑点，沿着原纤维轴每 4.8 Å 重复一次，与堆叠的 tau 分子的重复相称。密度不足以清楚地区分四个核苷酸碱基，因此我们将 polyA 和 polyG（分别）建模为残余密度（图 3 C和F）。最近有报道称 PolyA 是 tau 聚集的辅助因子，并定位于 P301S 小鼠大脑中的核和细胞溶质 tau 聚集体。我们停靠的 RNA 链的位置与其停靠的 tau 原纤维表面化学相容：1) 磷酸 OP1 原子位于距离 Arg406 NH1 原子 2.8 至 3.0 Å 处，表明它们是氢键合的; 2) 核糖 2'-OH 原子位于距离 His407 NE2 原子 2.7 Å 处，表明这些原子也是氢键合的，腺嘌呤碱基与 His407 和 Pro423 接触（图 3 C和D）；3) 富含精氨酸的基序在 RNA 结合域中很常见，包括人类核糖体蛋白 L7、人形噬菌体 N 蛋白和 HIV-1 Rev 蛋白。

我们的 tau-RNA 原纤维中 RNA 和侧链的相互作用让人想起最近脑源性原纤维结构中侧链和未识别的辅因子之间的相互作用。我们的 tau-RNA 原纤维中两条带正电的侧链（Arg406 和 His407）附近的残余密度接近于离体 α-突触核蛋白原纤维的冷冻电镜图中所见的模式。例如，残留密度位于表面暴露的 Lys58 和 Lys60 侧链附近以及 MSA 案例 2 类型 II-1 (6xyp) 中的 Lys32 和 Lys34 附近。同样，在从 CTE 患者中提取的 tau 原纤维中，残留密度在相邻的 Lys317 和 Lys321 侧链附近很显着（6nwq）。因此，淀粉样蛋白原纤维中的常见模式是相邻的带正电荷的侧链对紧贴假定的补偿负电荷的辅助因子。

我们注意到 RNA 的密度相对较弱。对这一弱点的一种解释是 tau 和 RNA 的重复单元之间的距离可能不匹配。Tau 分子以 4.8 Å 的重复距离堆叠在原丝中，而 RNA 核苷酸的首选碱基堆叠距离为 3.3 Å。因此，核苷酸碱基堆叠的芳香族重叠比通常在典型 A 型 RNA 结构中观察到的要少。缺乏重叠可能限制了 RNA-tau 相互作用的稳定性。

Tau-RNA 原纤维是可逆的淀粉样蛋白。

为了确定 RNA 是整合在原纤维结构中还是仅在淀粉样蛋白原纤维形成中起催化作用，我们将成熟原纤维暴露于酶消化中。通过将原纤维与 RNase 以 1:0.6 和 1:3 的摩尔比 (原纤维:RNase) 在 37°C 混合 2 小时来消化 Tau-RNA 原纤维。如图4A所示，随着RNase浓度的增加，tau原纤维分解成小块，表明RNA是原纤维支架的分子胶，是原纤维结构的组成部分。基于这些发现，我们得出结论，RNA 诱导的 tau 原纤维是可逆的淀粉样蛋白，并在 RNA 被消化时分解。
图 4。

Tau-RNA 原纤维是可逆的淀粉样蛋白。( A ) RNase 对 tau 原纤维稳定性的影响。没有 RNase 的 tau-RNA 原纤维的 EM 图像（上图）。在 RNase 以 1:0.6 摩尔比存在的情况下，Tau 原纤维开始聚集并分解（原纤维：RNase；中间）。用较高摩尔比的 RNase (1:3) 处理的原纤维分解成短片段（底部）。RNase 与 tau 原纤维在 20 mM 醋酸铵缓冲液（pH 7.0）中于 37 °C 下孵育 2 小时。（比例尺，100 nm。）（乙）tau-RNA原纤维有序片段的溶剂化能量图。残基根据其从不利（蓝色；+2.5 kcal mol -1）到有利（红色；-2.5 kcal mol -1 ）的稳定能量着色）。( C ) tau-RNA 纤维结构与其他淀粉样蛋白结构的溶剂化能值的比较。

为了阐明赋予 tau-RNA 原纤维组装可逆性的结构特征，我们计算了我们结构的稳定能量图（图 4B）。我们的稳定能公式主要来自与溶解和暴露原子于水相关的惩罚。大的负值意味着稳定的组件，难以溶解。我们的原纤维结构（-14 kcal mol -1链-1，-0.39 kcal mol -1残基-1）的适度稳定能量与其他可逆淀粉样蛋白如 hnRNPA2 LCD（-19.5 kcal mol -1链- 1 , -0.34 kcal mol -1残基-1) 和 FUS (-12.2 kcal mol -1链-1 , -0.20 kcal mol -1残基-1 )   (图 4 B和C )。FUS 和 hnRNPA2-LCD 属于已知在无膜细胞器中相分离和发挥作用的一组 RNA 结合蛋白。hnRNPA2 和 FUS 原纤维的病理版本与疾病有关。与可逆原纤维相比，在离体病理原纤维如人血清淀粉样蛋白 A（-34.4 kcal mol -1链-1，-0.64 kcal mol -1残基-1 ) ( 4 , 45 )，大脑从 AD、PiD、CTE 和 CBD 患者中提取 tau 原纤维（图4C）。

溶解 tau-RNA 原纤维的相对容易性可能部分归因于缺乏相当大的疏水核心。注意强稳定残基的缺乏（图 4 B，鲜红色）以及酸性残基 Asp418（深蓝色）的掩埋。原丝之间的界面主要由极性残基（Lys395、Thr403、Asn410、Ser412 和 Thr414）组成；它们对稳定性的适度贡献在图 4B中表现为淡淡的粉红色和蓝色。最值得注意的是，Asp418 被掩埋，附近没有补偿电荷（图 4 B，深蓝色）。几乎可以肯定，它在原纤维中质子化，否则相邻 Asp418 残基之间的电荷排斥会强烈破坏原纤维的稳定性。类似的埋藏谷氨酸 (Glu8) 归因于赋予 β-内啡肽原纤维的可逆性，而胰高血糖素中的三种埋藏天冬氨酸可能赋予其在低 pH 值下形成原纤维的倾向。似乎除了 RNA 之外，质子也可能被认为是这种原纤维组装的辅助因子。

为了测试 tau 原纤维在 RNA 存在下在提高 pH 值时分解的能力，将 tau 原纤维与 30 mM CAPS 在 pH 9.5 下在 37°C 下孵育 3 小时。电子显微照片中 tau 原纤维的丰度在 pH 9.5 时减少了约 5 倍，这支持了 pH 升高使 Asp418 和 Asp421 去质子化并促进 tau 原纤维分解的假设的有效性（SI 附录，图 S5）。

Tau-RNA 原纤维的冷冻电镜结构揭示了五个立体拉链界面。

tau-RNA 原纤维的冷冻电镜重建揭示了其 β-折叠之间的紧密配合界面，完全排除了水分子。这种由配对的β-折叠组成的稳定结构基序被称为空间拉链。我们的 RNA 诱导的 tau 原纤维由称为 A 1、A 2、B 1、B 2和 C 的五个空间拉链稳定（图 5 A）。立体拉链 A 1和 A 2是对称相同的拉链，分别位于原丝 1 和 2 中。每个都由一对β-折叠组成，通过一个片面（Asp418、Val420 和 Asp421）及其配对片面（His407、Ser409、Val411 和 Ser413）的侧链之间的范德华接触加强。立体拉链 B 1和 B 2由表面展示残基 Pro397、Val399 和 Thr403 与互补表面展示残基 Thr414、Gly415 和 Ile417 配对组成。立体拉链 C 与前面的拉链不同，因为它将来自不同原丝（同型）的相同 β-折叠结合在一起。β-折叠残基 Leu408、Asn410 和 Ser412 与相反原丝的相同残基配对。与我们的低温电磁模型一致，我们的 ZipperDB 数据库预测了形成这种同型空间拉链的潜力。Rosetta 计算同型六肽片段的能量稳定性。片段 408-LSNVSS-413 超过了用于识别淀粉样蛋白原纤维形成片段的 -23 kcal/mol 阈值（1.4 kcal/mol）。
图 5。

tau-RNA 原纤维的结构。（一）tau-RNA原纤维的两条相同原丝（粉红色和黄色）的卡通画。显示了每个原丝的八个 tau 层。β-折叠表面在五个立体拉链界面（A 1、A 2、B 1、B 2和 C，按字母着色）中配合在一起。（乙）tau-RNA低温电镜结构有序原纤维核心的氨基酸序列。RNA-tau原纤维核心由排列在交叉β支架上的残基Glu391至Ala426组成。立体拉链接口涉及 β-链 2、3、4 和 5（β1，Glu391 到 Val393；β2，Ser396 到 Ser400；β3，Asp402 到 Pro405；β4，His407 到 Ser413；和 β5，Asp418-Val420）在垂直于原纤维轴的层中。

请注意，聚阴离子 RNA 与 Arg406 和 His407 的 tau 碱性残基相互作用，从而稳定有序 tau 片段 C 末端的 β-arch 基序（残基 408 至 421）（SI 附录，图 S6）。Val411 和 Val420 侧链之间的疏水相互作用稳定了空间拉链 B1 和 B2，并有助于组装 RNA 结合位点。tau-RNA 结构核心，His407 到 Ser422 残基，采用 β-拱形基序，由多个反平行蛋白链（β4 和 β5）形成，它们垂直于原纤维轴堆叠成层（SI 附录，图 S6） .

RNA 刺激 Tau 微管结合重复序列转化为原纤维。

为了测试 RNA 是否可以通过与 tau 分子的其他区域结合而不是在我们的 tau-RNA 结构中可视化来诱导 tau 原纤维形成，我们测试了 tau 的三个截短版本的原纤维化：tau-K18（残基 244 到 372，重复 2）， tau-K18+（244 至 380，重复 2）和 tau-K19+（244 至 380，无重复 2）（SI 附录，图 S7 和 S8）。Tau-K18+/K19+ 在 tau-K18 上包含一个额外的 8 个残基 C 末端，以涵盖在 AD 原纤维结构核心中发现的所有残基（残基 306 至 378）。所有这三个构建体都缺少在我们的全长 tau-RNA 结构中排序的 tau 的 C 端结构域。EM 显微照片显示添加 RNA 促进 50 或 100 µM tau-K18 的原纤维形成（SI 附录，图 S7）。有趣的是，tau-K18 与 RNA 产生的原纤维的产量低于 tau40（与 RNA）的产量。当用 tau40-RNA 原纤维播种时，tau-K18 原纤维产量增加，表明这些含有 C 末端的种子可以将 C 末端缺陷的 tau-K18 单体诱导成原纤维。除了 tau-K18，我们发现构建体 tau-K18+ 和 tau-K19+ 在 RNA 存在下与 tau-K18 相比具有更多的原纤维形成。EM 数据还表明，用 tau40-RNA 接种可以导致更快和更丰富的原纤维形成（SI 附录，图 S8）。这些数据表明，RNA 可能能够与 tau 的微管结合区域中的区域结合并促进原纤维组装。在我们的全长 tau-RNA 结构中未发现来自 K18、K18+ 和 K19+ 的残基这一事实表明最强的 RNA-tau 结合位点在我们的结构中可见：Arg406 和 His407。

讨论

RNA与淀粉样蛋白原纤维的相互作用在正常代谢和发病机制中都很常见，但关于这些复合物的结构基础却鲜有发现。为了帮助填补这一空白，我们用来自小鼠肝脏的未分级 RNA 形成了全长重组 tau 蛋白的淀粉样蛋白原纤维。这些原纤维的冷冻电镜结构揭示了一个熟悉的交叉β支架，由两个原丝 tau 36 残基核心形成。RNA 平行于 tau 的螺旋原纤维轴，与带正电荷的 tau 侧链相互作用（图 3 C）。由于 RNA 侧链的周期性间距与 4.8 Å 的 tau 淀粉样蛋白层间距不相称，因此 RNA 结构模糊，但显然共价完整。它的完整性通过添加 RNase 的破坏来证明，这会导致 tau 的分解和溶解。

tau-RNA 原纤维的有序核心由平行的、对齐的 β 折叠组成，折叠形成五个稳定原纤维的空间拉链界面，以及广泛的主链氢键网络。然而，这些拉链缺乏强疏水性。β-折叠之间的大多数接触涉及极性侧链（图 4 B）。此外，核心尺寸很小，只有 37 个残基（与其他 tau 原纤维结构中的 73 到 107 个残基相比）。计算表明 tau 核心的稳定能量很差（图 4 C）。RNA 结合似乎通过促进与 Arg406 和 His407 的静电和阳离子-π 相互作用来稳定 tau 核心。事实上，我们的原纤维在 RNase 处理后会降解成短片段。其他人也观察到辅因子去除后 tau 原纤维的分解。RNA 的聚合连接似乎是其稳定 tau 原纤维的关键特征，因为预消化的 RNA 无法将 tau 单体诱导成原纤维。该证据表明，RNA 链充当稳定原纤维的分子胶（图 4A ）。所有这些观察结果都与 RNA 可以作为 tau 蛋白可逆淀粉样原纤维形成的结构辅助因子的假设一致。

除了体外研究，其他观察结果表明 RNA 作为体内 tau 聚集的辅助因子。RNA 染色显示 RNA 与 AD 和 PiD 中的 tau 聚集体相关。此外，在细胞培养和小鼠脑模型中，细胞溶质和核 tau 与小核 RNA 和小核仁 RNA 形成复合物 。Tau 在与神经元细胞中的转移 RNA 结合后经历液-液相分离，然后转变为类似于病理原纤维的构象。

如果我们假设类似于图 5的 tau-RNA 细丝在体内形成，我们可以想象两种结果：如 NMR 研究所设想的那样，细丝催化致病性淀粉样蛋白多晶型物的成核或防止致病形式。在第一个结果中，我们的 C 末端 tau 丝可以通过外延成核促进致病 tau 丝的组装（图 6 A、B和F），通过提供 4.8 埃的间距来模板生长相称的病原原纤维。或者，结构顺序可以从 C 末端核心扩散到 R1 到 R4 区域，产生一个新的致病核心，然后原来的核心溶解。图 6 B、D和E )。第二种可能的结果是，一个有序的 C 末端核心，例如我们观察到的那个，可以与一个有序的重复区域共存，这可能会保护重复区域不形成病理构象。我们想象我们的 RNA 诱导的原纤维核心可能是这个更大但良性的原纤维核心的前体（图 6C）。
图 6。

RNA 诱导的 tau 原纤维可能具有保护作用，或者它们可能促进致病性 tau 构象的形成。（一）当本质上无序的 tau 分子在 RNA 存在下变得集中时，（乙）RNA 诱导 C 末端片段（残基 391 到 426）形成淀粉样蛋白核心。我们预计有四种可能的结果：RNA 的丢失导致原纤维溶解，使 tau 恢复到可溶状态（A）；( C ) 淀粉样蛋白-RNA 核心促进 R3 和 R4 的排序，R3 和 R4 按 Dregni 等人的建议将 C 末端核心包装在保护 tau 不形成病理构象的构象中。( D) 淀粉样蛋白-RNA 核心促进 R3 和 R4 在病理构象中的排序，例如 AD 中成对螺旋丝 (PHF) 的 C 形构象，然后 C 端核心分解，留下 ( E) PHF 构象; 或 ( F ) RNA-淀粉样蛋白核心外延成核病理性 tau 构象。

为了测试图 6中概述的可能性，在未来的工作中，可以想象几个实验。为了测试 tau-RNA 原纤维核心外的残基是否随着时间的推移变得有序，如图 6 C和D所示，可以进行 tau-RNA 原纤维的时间分辨结构研究。如果额外的残基变得有序，冷冻电镜图将揭示它们的结构。为了测试外延成核的可能性，如图 6 F所示，可以研究由 tau-RNA 播种的原纤维的结构。事实上，我们的实验已经通过我们在这里确定的 tau-RNA 结构对不同 tau 结构的模板化提供了一些支持。全长 tau、K18、K18+ 和 K19+ 都能够由全长 tau-RNA 播种。尽管在 RNA 存在下播种全长 tau 可能会导致种子结构的复制，但由于序列差异（K18、K18、 K18+ 和 K19+ 不包含全长 tau-RNA 原纤维的核心序列）。这表明 tau-RNA 原纤维可以促进其他 tau 分子外延成核成不同的 tau 原纤维结构，为图 6 所示的机制提供了可能性F。 _ 未来的工作需要对 tau-RNA 原纤维进行时间分辨结构研究，并优化在有或没有接种的 RNA 存在下原纤维化的不同 tau 构建体的原纤维，以测试我们在图 6中概述的各种可能性。

总之，我们在此报告的 tau-RNA 原纤维的低温 EM 结构提供了结构化 tau C 末端的近原子分辨率视图，并提供了为什么 tau-RNA 原纤维是可逆淀粉样蛋白的结构解释。如果事实证明这种 tau-RNA 结构在体内形成并且是致病原纤维形成的中间体，那么我们的结构将为设计基于结构的 tau 病变化学干预提供信息。

方法重组蛋白表达和纯化。

人野生型 tau-K18（残基 244 至 372）、人 tau-K18+（4R 的残基 244 至 380）和人 tau-K19+（3R tau 的残基 244 至 380）在 BL21- 中的 pNG2 载体中表达金大肠埃希菌。人 tau40（残基 1 至 441）在 BL21-Gold大肠杆菌中的 pET28b 载体中表达。如前所述纯化所有蛋白质。

对于人类 tau-K18、tau-K18+ 和 tau-K19+ 纯化，BL21-Gold大肠杆菌细胞在 LB 中生长，在 600 nm 处光密度为 0.7。细胞在 37 °C 下用 0.5 mM IPTG 诱导 3 小时，并在加入 NaCl 500 之前在 20 mM MES 缓冲液 (pH 6.8) 中用 1 mM EDTA、1 mM MgCl 2、1 mM DTT 和 HALT 蛋白酶抑制剂超声裂解毫米最终浓度。裂解物煮沸 15 分钟，然后通过 32,000 × g离心澄清15 分钟并用 50 mM NaCl 和 5 mM DTT 透析至 20 mM MES 缓冲液 (pH 6.8)。在 5 mL HighTrap SP 离子交换柱上纯化透析的裂解物，并在 50 至 600 mM 的 NaCl 梯度上洗脱。蛋白质在 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg 中用 100 mM NaCl 和 1 mM DTT 在 10 mM Tris (pH 7.6) 中抛光，并通过使用 3-kDa 截止值的超滤浓缩至~20 至 60 mg/mL。

对于人类 tau40 纯化，Tau40 在 pET28b 中表达，在 BL21-Gold大肠杆菌中具有 C 末端 His 标签，在 TB 中生长至 OD600 = 0.8。细胞在 37 °C 下用 1 mM IPTG 诱导 3 小时，并在 50 mM Tris (pH 8.0) 中用 500 mM NaCl、20 mM 咪唑、1 mM β-巯基乙醇和 HALT 蛋白酶抑制剂超声裂解。通过超声裂解细胞，通过 32,000 × g离心澄清15 分钟，然后通过 5-mL HisTrap 亲和柱。用裂解缓冲液洗涤柱子，并在 20 至 300 mM 的咪唑梯度上洗脱。含有纯化 tau40 的级分用 50 mM NaCl 和 1 mM β-巯基乙醇透析到 50 mM MES 缓冲液 (pH 6.0) 中，并通过阳离子交换纯化。峰级分在 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 中的 1× PBS（pH 7.4）、1 mM DTT 上抛光，并使用 10-kDa 截止值通过超滤浓缩至 ~20 至 60 mg/mL。

从小鼠肝脏中分离总 RNA。

根据制造商的方案，用 RNA TRIzol 试剂（Life Technologies 的 Ambion，目录号 15596018）分离野生型小鼠肝脏 RNA。简而言之，将 100 mg 小鼠肝脏在 1 mL TRIzol 试剂中匀浆，用 0.2 mL 氯仿萃取，用 0.5 mL 异丙醇沉淀，然后溶解在 100 μL 无 RNase H 2 O中。

为 Cryo-EM 制备 tau40 原纤维。

重组 tau40 在 20 mM 乙酸铵中以 50 µM 稀释，pH 7.0，并与 400 µg/mL 的 RNA 一起孵育。在 37°C 摇动 2 天后，使用负染色透射 EM 检查淀粉样蛋白原纤维的形成。

体外 ThT 荧光检测。

重组 tau40、tau-K18、tau-K18+ 和 tau-K19+ 在 20 mM 乙酸铵、pH 7.0、10 μM ThT 中分别稀释至 50 μM，并与 400 μg/mL 的 RNA 混合。将蛋白质液化到 384 孔板 (Thermo Scientific Nunc) 的三个重复孔中，并将板在 37°C 下摇动孵育 60 小时。通过负染色透射 EM 证实了纤颤。

RNA 消化。

如图 2和SI 附录图 S1所示，通过在 20 mM 乙酸铵，pH 7.0 中孵育 RNA 或 tau-RNA 种子与 RNase A（Thermo Fisher Scientific 公司的 Invitrogen，批次 00522943）进行 RNA 的消化。RNA 的消化是通过将 RNA 或 tau-RNA 种子与 RNase 以 4:1 的比例在 37 °C 下孵育 6 小时来进行的。

RNase 对 Tau-RNA 原纤维稳定性的影响。

将 Tau 原纤维以 159,000 × g离心1 小时，然后用无 RNA 水洗涤两次。原纤维在 20 mM 乙酸铵，pH 7.0 中以 1:0.6 和 1:3 摩尔比（原纤维：RNase）在 37 °C 下用 RNase A 处理 2 小时。

负染色透射 EM。

通过将 4 μL 溶液施加到安装在铜网格 (Ted Pella, Inc.) 上的 400 目碳涂层福尔伐克支撑膜上，制备负染色透射 EM 样品。在施加样品之前，网格被辉光放电 30 秒。将样品在网格上孵育 1 分钟，然后用滤纸吸干。网格用 4 μL 2% 醋酸铀酰染色 2 分钟，再用 4 μL 2% 醋酸铀酰洗涤，干燥 10 分钟。使用 T12 (FEI) 电子显微镜对网格进行成像。

在 Tau 生物传感器细胞中播种。

稳定表达 tau-K18 的 HEK293 细胞系由德克萨斯大学西南医学中心的 Marc Diamond 实验室设计。将细胞维持在 Dulbecco 改良鹰培养基（Life Technologies, Inc.，目录号 11965092）中，辅以 10%（vol/vol）FBS（Life Technologies，目录号 A3160401）、1% 抗生素抗真菌剂（Life Technologies, Inc. .，目录号 15240062）和 1% Glutamax（Life Technologies，目录号 35050061），37 °C，5% CO 2在加湿的培养箱中。Tau RNA-原纤维种子在杯角水浴中超声处理 5 分钟，然后与通过在 19 μL OptiMEM 中稀释 1 μL Lipofectamine 制备的 1 体积 Lipofectamine 3000（Life Technologies，目录号 11668027）混合。20 分钟后，将 10 μL 原纤维添加到 90 μL tau 生物传感器细胞中。通过使用 YFP 通道中的 Celigo 图像细胞仪 (Nexcelom) 一式三份对 96 孔板的整个孔进行成像来确定播种聚集体的数量。使用 ImageJ 通过从未接种的细胞中减去背景荧光，然后使用内置粒子分析仪计算荧光高于背景的峰数。将聚集体的数量标准化为每个孔的汇合处，并通过计算三次测量的平均值和 SD 值来生成剂量反应图。对于高质量图像，使用 YFP 荧光通道在 Zeiss Axio Observer D1 荧光显微镜上拍摄细胞。

Cryo-EM 数据收集、重建和模型构​​建。

将 2 微升 tau 原纤维溶液施加到 Quantifoil 1.2/1.3 电子显微镜网格上，使其辉光放电 4 分钟。网格用滤纸吸干以去除多余的样品，并使用 Vitrobot Mark IV (FEI) 将其浸入液体乙烷中。冷冻电镜数据集是在 300 kV Titan Krios (FEI) 显微镜上收集的，Gatan K3 相机位于斯坦福-SLAC 冷冻电镜中心 (S 2 C 2 ) 冷冻电镜中心。显微镜以 300 kV 加速电压和 20 eV 狭缝宽度操作。使用超分辨率模式获取电影，标称物理像素大小为每像素-1 1.06 Å （超分辨率电影帧中每像素 0.53 Å），每帧剂量为 ~1.3 e - /Å 2. 每部电影记录了 40 帧（每张图像的总剂量 52 e - /Å 2）。自动数据收集由 EPU 自动化软件包驱动。使用 Unblur 进行运动校正和剂量加权，使用 CTFFIND 4.1.8进行对比度传递函数估计。使用 EMAN2 e2helixboxer.py 手动挑选所有原纤维颗粒。我们使用RELION执行粒子提取、2D 分类、螺旋重建和 3D 细化。使用 1,024 和 686 像素的框大小提取粒子。我们使用 1,024 个像素粒子来执行 2D 分类并估计原纤维间距和螺旋参数。接下来，我们使用 686 像素的框大小执行 2D 分类。使用圆柱参考进行螺旋重建。使用三个类执行 3D 分类，并手动控制 tau_fudge 因子和 healpix_order 以将粒子分为好类和坏类。为了获得更高分辨率的重建，从 686 像素框 3D 分类中选择最佳粒子，并使用 320 像素的框大小提取对应于良好粒子的螺旋管。经过多轮 3D 分类以及螺旋扭曲和上升的细化后，我们使用最终的粒子子集执行高分辨率金标准细化。基于 0.143 傅里叶壳相关 (FSC) 分辨率截止值，最终的总体分辨率估计值为 3.4 Å。

原子模型构建。

如半图 FSC 所示，使用 phenix.auto_sharpen 在分辨率截止处锐化精制图。我们使用 COOT 从头构建近原子分辨率模型锐化地图。使用 phenix.sequence_from_map 验证序列注册。在最终的 3D 细化中，我们通过螺旋参数生成五层模型，然后使用 phenix.real_space_refine细化结构。最终模型使用 phenix.comprehensive_validation 进行了验证。所有统计数据汇总于表 1中。

稳定能量计算。

通过每个原子的掩埋面积和相应的原子溶剂化参数的乘积之和来计算每个残基的稳定能。总能量通过所有残基的能量总和计算，并且不同的颜色分配给溶剂化能量图中的每个残基。