核磁共振追踪和代谢模型确定的人前列腺癌细胞分泌柠檬...

ZOY · 发表于 2022-4-8 15:03:06

核磁共振追踪和代谢模型确定的人前列腺癌细胞分泌柠檬酸盐的碳源和途径
意义
人类前列腺会积累高水平的腔内柠檬酸盐以维持精子活力。只有关于维持这些水平的代谢途径和碳源的间接定性证据。向分泌柠檬酸盐的人前列腺癌细胞提供13 C-标记的底物，并记录细胞外液的 NMR 光谱。我们报告了前列腺细胞的绝对柠檬酸盐产生率和直接证据表明葡萄糖是分泌的柠檬酸盐的主要碳源。丙酮酸羧化酶提供足够的回补碳来支持柠檬酸盐的分泌。谷氨酰胺碳与碳交换分泌柠檬酸盐，但可能不参与其净合成。此外，我们开发了使用13细胞外柠檬酸盐中的 C 分布作为输入以评估细胞内途径，然后是碳向柠檬酸盐。

摘要

前列腺上皮细胞具有分泌大量柠檬酸盐的独特能力，但维持这种生产的碳源和代谢途径尚不清楚。我们绘制了人前列腺癌转移细胞系 LNCaP 和 VCaP 中柠檬酸盐碳的潜在途径，为此我们首先确定它们分泌柠檬酸盐（对于 LNCaP，每 10 6 个细胞 5.6 ± 0.9 nmol/h）。使用13 C 标记的底物，我们追踪了13通过细胞外液的 NMR 将 C 转化为柠檬酸盐。我们的结果提供了直接证据，表明葡萄糖是分泌柠檬酸盐的主要碳源。我们还证明了来自供应的谷氨酰胺的碳通过氧化克雷布斯循环和还原羧化途径流向分泌的柠檬酸盐中的位置，但可能不有助于其净合成。潜在的回补碳源天冬氨酸和天冬酰胺对柠檬酸盐碳没有贡献。我们开发了一个定量代谢模型，采用13 C 分布在细胞外柠檬酸盐后13C 葡萄糖和丙酮酸应用以评估分泌柠檬酸的碳的细胞内途径。根据该模型，估计在 LNCaP 中，约 21% 的进入克雷布斯循环的丙酮酸通过丙酮酸羧化酶作为回补途径转化，其速率足以通过柠檬酸分泌补偿该循环的碳损失。该模型提供了对包括柠檬酸盐在内的分子分数的估计，每一次都离开克雷布斯循环。细胞外柠檬酸盐中不同位置的13 个C 原子的测量比率可作为（恶性）上皮细胞代谢的生物标志物。
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健康的前列腺上皮细胞具有将柠檬酸盐分泌到前列腺导管中的独特能力。柠檬酸由草酰乙酸和乙酰辅酶A缩合形成，由柠檬酸合酶催化，作为三羧酸循环的第一步。这种柠檬酸盐的一部分从克雷布斯循环转移到细胞质中，由线粒体内膜中的柠檬酸盐转运蛋白促进。然后它可以被分泌到前列腺的导管中，涉及一个独立的电生运输系统。前列腺管腔中的柠檬酸盐可达到约 180 mM 的水平，这被认为主要作为精子细胞的能量来源。通过与锌的结合抑制柠檬酸转化酶间乌头酸酶促进柠檬酸积累，锌在前列腺上皮细胞中以相对较高的水平被吸收（图1A）。
图。1。

与前列腺中柠檬酸盐的生物合成相关的代谢途径的示意图和进入三羧酸循环的化合物中13 个C 原子的示意图及其在多个循环中产生柠檬酸盐的命运。( A ) 在健康的前列腺上皮细胞中，锌离子通过 ZIP1 转运蛋白输入，抑制乌头酸酶，该酶催化柠檬酸立体特异性异构化为异柠檬酸。产生的过量柠檬酸盐通过柠檬酸盐转运蛋白 (CT) 转运至胞质溶胶，并由细胞通过柠檬酸盐转运蛋白 KCitT 排泄到管腔空间中。恶变后，Zn 2+摄取减少，因此乌头酸酶的抑制作用被释放，柠檬酸被更多地氧化为异柠檬酸，而不是被分泌。为克雷布斯循环提供碳的潜在代谢物以绿色表示。当柠檬酸盐分泌物从该循环中排出碳时，需要进行回补。天冬氨酸可以通过草酰乙酸进入克雷布斯循环。谷氨酰胺转化为谷氨酸，其碳作为五碳代谢物 α-酮戊二酸进入克雷布斯循环。丙酮酸可通过 PC 转化为四碳克雷布斯循环中间体草酰乙酸。指出了还原和氧化代谢途径。( B )源自 [1,6- 13 C 2 ] 葡萄糖的13 C 标签的分布。( C) 来自 [2- 13 C] 丙酮酸的同上。由 PC 转化为草酰乙酸的丙酮酸碳由蓝色圆圈表示，由 PDC 转化为乙酰辅酶 A 的那些由红色圆圈表示。( D ) 13 C 标签在涉及 [U- 13 C 4 ] 天冬氨酸的可能回补中的分布。( E ) 同上涉及 [ 5-13C]谷氨酰胺。由氧化代谢转化的谷氨酰胺碳由红色圆圈表示，由还原交换转化的由蓝色圆圈表示。在该图中，指示了每种化合物中的碳数，并且为简单起见，省略了柠檬酸盐的线粒体和细胞输出。柠檬酸盐碳编号的选择方式是乙酰辅酶 A 的 C1 和 C2 最终位于柠檬酸盐的 C1 和 C2。
前列腺癌是全世界的主要健康负担。前列腺恶性转化后显着的代谢变化是组织中柠檬酸盐浓度的局部降低。这可能是肿瘤细胞占据导管空间、物理置换管腔液和/或代谢重编程以转移较少柠檬酸盐的结果。上皮细胞转化为癌细胞的一个关键代谢事件被认为是锌转运蛋白 ZIP1 的下调，导致锌摄取减少，因此间乌头酸酶活性和柠檬酸氧化增加，而不是分泌到导管中（图 1) 。前列腺 MR 光谱图像中柠檬酸盐信号的降低被用作识别癌症病变的生物标志物。了解恶性转化中的代谢重编程可能有助于更好地诊断和治疗前列腺癌。
一个主要问题是前列腺的代谢网络如何支持高水平的柠檬酸盐生产。对大鼠前列腺上皮细胞和腹侧组织的研究表明，葡萄糖是柠檬酸盐的主要碳源。大鼠上皮前列腺细胞仅在培养基中产生柠檬酸盐和天冬氨酸，这表明天冬氨酸是一种必需的前体。它的摄取由氨基酸转运蛋白 EAAC1 介导，随后线粒体天冬氨酸氨基转移酶 (mAAT) 的转氨作用提供草酰乙酸。大鼠和人前列腺中 EAAC1 的高表达似乎进一步支持了天冬氨酸的重要性。然而，这些研究都没有提供直接证据表明来自葡萄糖或天冬氨酸的碳原子确实最终进入细胞外柠檬酸盐以及这些碳遵循哪些代谢途径。
因为在克雷布斯循环中产生的柠檬酸盐流向管腔空间并流向从头脂肪生成，所以该循环耗尽了维持其维持所需的碳原子，因此需要补充补充。在葡萄糖是柠檬酸盐的主要碳源的情况下，天冬氨酸可作为回补剂供应。还可以通过丙酮酸和谷氨酰胺（图1A）发生回补。丙酮酸可通过丙酮酸羧化酶 (PC) 转化为草酰乙酸，谷氨酰胺可通过谷氨酰胺酶转化为谷氨酸，随后通过谷氨酸脱氢酶 (GDH) 转化为三羧酸循环中间体 α-酮戊二酸。由于前列腺细胞含有大量谷氨酰胺转运蛋白和谷氨酰胺在血液中的含量相对较高，它可以作为柠檬酸盐的碳源。
为了确定上述底物和代谢途径中的哪些可能在人前列腺中柠檬酸盐的产生中贡献碳，我们搜索了能够分泌足够量的柠檬酸盐用于代谢分析的人源前列腺上皮细胞。先前的研究表明，前列腺癌淋巴结转移细胞系 LNCaP 分泌柠檬酸盐。LNCaP 细胞还表达氨基酸转运蛋白 EAAC1，通常用作研究前列腺癌代谢的模型。VCaP 是一种源自椎骨转移的前列腺癌细胞系。与 LNCaP 细胞一样，VCaP 细胞表达谷氨酰胺转运蛋白 ASCT2，对雄激素敏感，并产生前列腺特异性抗原 (PSA)，反映了它们的前列腺起源和仍然分化的性质，因此也可能分泌柠檬酸盐。
跟踪组织和细胞代谢的一种优雅方法是向它们提供13 C 标记的底物，并通过13 C NMR 光谱监测13 C 原子的命运。代谢产物的特定13 C 标记提供了有关其合成路线的信息。在这项研究中，我们专注于分泌柠檬酸盐的特定13 C 标记模式，作为对其碳骨架有贡献的细胞内代谢途径的读数。最终，细胞外柠檬酸盐的标记模式可用作细胞内代谢的指纹，用于诊断目的。
在确定 LNCaP 和 VCaP 细胞确实分泌柠檬酸盐后，我们研究了天冬氨酸、天冬酰胺、葡萄糖、丙酮酸盐和谷氨酰胺是否以及如何作为这种细胞外柠檬酸盐的碳源。为此，我们采用VCaP 和LNCaP 细胞的生长培养基的一维(1D) 和二维(2D) 13 C 和1 H NMR。我们开发了一种代谢模型，该模型使用细胞外柠檬酸盐的特定13 C 标记，经过13C 葡萄糖和丙酮酸补充剂，作为输入以提供支持柠檬酸碳供应的细胞内代谢的定量信息。最终，参与柠檬酸盐产生的化合物和代谢途径可以作为表征（恶性）上皮细胞代谢的生物标志物，并可以被视为治疗的目标。

结果

所有实验均在生长至完全汇合的细胞上进行，然后用补充剂孵育 48 小时。从相似数量的细胞开始，LNCaP 达到完全融合的速度大约是 VCaP 的两倍（在 75-cm 2烧瓶中约 2 周对 1 个月）。LNCaP 和 VCaP 细胞的细胞培养培养基的所有1 H NMR 光谱显示了源自柠檬酸质子的四重重峰（图2A ）。这些柠檬酸盐信号的正确分配通过向样品中加入柠檬酸盐和双量子过滤相关光谱 (DQF-COSY) 实验 (图2B ) 来验证，显示出双峰信号的双峰，正如柠檬酸盐所预期的那样。
[size=0.75]图 2。

细胞培养基的1 H NMR 光谱中的柠檬酸盐共振。( A ) RPMI-1640 培养基的光谱，其中细胞生长 48 小时（VCaP：橙色；LNCaP：蓝色）。在两个光谱中，都显示了柠檬酸质子的四重信号。（乙）通过来自 VCaP 细胞的生长培养基的 DQF-COSY 谱确认柠檬酸盐共振的分配。双峰的柠檬酸盐双峰的交叉峰在 2.71、2.68、2.57 和 2.54 ppm 处清晰可见。
柠檬酸盐的产生和Zn 2+的影响。

LNCaP 的柠檬酸盐产量是 VCaP 的 10 倍：5.6 ± 0.95 nmol/h 每 10 6 个细胞，而 0.43 ± 0.16 nmol/h 每 10 6 个细胞平均 48 小时（SI 附录，表 S1）。测试是否 Zn 2 +在培养培养基中影响这些细胞的柠檬酸盐分泌我们确定了柠檬酸盐的平均产量，每 10 6 个细胞在 48 小时内，以及作为额外的代谢传感器，乳酸和丙氨酸（SI 附录，图 S1 和表 S1）。50 µM Zn 2+的存在并未改变任一细胞系的细胞计数，但 LNCaP 产生的柠檬酸盐、丙氨酸 ( P < 0.05) 和乳酸含量显着降低 (P < 0.01)。然而，提供给VCaP细胞的Zn 2+不影响柠檬酸盐和丙氨酸的产生，仅略微增加了乳酸( P < 0.05)。添加 Zn 2+后，柠檬酸盐/乳酸和柠檬酸盐/丙氨酸的代谢物比率没有变化，但 LNCaP 的丙氨酸/乳酸显着增加（SI 附录，表 S1）。

柠檬酸盐是否通过补充 [U- 13 C 4 ] 天冬氨酸或天冬酰胺来标记？

为了测试天冬氨酸或天冬酰胺是否是柠檬酸盐的碳源，我们在存在 11 mM 非标记葡萄糖的情况下向两种细胞系提供了这些化合物，均匀地13 C 标记。天冬氨酸实验也通过用 7 mM 未标记的丙酮酸代替葡萄糖来进行。天冬氨酸或天冬酰胺的13 C 标记可能最终通过草酰乙酸形成柠檬酸盐，随后与乙酰辅酶 A 缩合（图1D）。在13 C-NMR 光谱和介质的 2D 1 H- 13 C 异核单量子相干 (HSQC) 光谱中，这些实验均未导致任何可检测到的柠檬酸盐的13 C 共振（图 3）。然而，在相同样品的1 H NMR 光谱中检测到未标记的柠檬酸盐，证实产生了柠檬酸盐（SI 附录，图 S2）。补充有[ 13 C]天冬氨酸的LNCaP细胞提取物的13 C NMR光谱未显示可检测水平的标记天冬氨酸。
[size=0.75]图 3。

补充13 C 天冬氨酸后，柠檬酸盐的13 C 信号缺失。( A ) 13 C NMR 光谱和 ( B ) RPMI-1640 培养基的1 H- 13 C HSQC 光谱，其中 VCaP 细胞或 LNCaP 细胞在培养基中添加 [U- 13 C] 天冬氨酸 (U- 13 C] 天冬氨酸 (频谱中的主要信号）。仅显示预期柠檬酸盐的13 C2/4 信号的化学位移范围。在该光谱范围内未观察到柠檬酸盐信号，但在1 H NMR 光谱中观察到柠檬酸盐信号（SI 附录，图 S6）。
柠檬酸盐是否通过补充 [1,6- 13 C 2 ]葡萄糖来标记？

由前列腺细胞分泌的柠檬酸盐的主要潜在碳来源是葡萄糖。为了测试葡萄糖碳是否确实最终以分泌的柠檬酸盐形式存在，我们为前列腺细胞提供了 11 mM [1,6- 13 C]葡萄糖，其中的13 C 碳预期通过克雷布斯循环标记柠檬酸盐（图 1B ）。与以13 C天冬氨酸或天冬酰胺作为前体的实验相反，补充 [1,6- 13C]葡萄糖 48 小时的 LNCaP 和 VCaP 细胞培养基的13 C NMR 光谱显示13 C-标记的柠檬酸盐的共振，在特别是在~46.4 ppm处的碳2/4和~76.2 ppm处的碳3的位置（图4）。拟合这些共振，包括13 C– 13 C 耦合，以估计柠檬酸盐的不同碳原子的相对13 C 积分（SI 附录，图 S3）。
图 4。

[1,6- 13 C 2 ]葡萄糖补充后柠檬酸盐的13 C 标记和 2D 异核相关实验验证13 C 柠檬酸盐信号分配并识别[1,6- 13 C]葡萄糖补充后其他化合物中的13 C 标记LNCaP 细胞。( A ) 柠檬酸盐，标明碳数。( B ) LNCaP 细胞 RPMI-1640 培养基的13 C NMR 光谱，在补充 [1,6- 13 C 2 ] 葡萄糖 48 小时后。指出了柠檬酸盐的 C2/4 和 C3 峰和乳酸的 C3 峰的化学位移位置。( C ) 13的一部分已在其中生长 VCaP 细胞（红色）或 LNCaP 细胞（蓝色）的培养基的 C NMR 光谱。在这两个光谱中，在~46.5 ppm 处观察到宽共振，对应于柠檬酸盐 C2 和 C4 位置的13 个C 碳。两个光谱都被缩放并参考 -2.0 ppm 的13 C TSP 信号。( D )介质的1 H- 13 C HMBC光谱在相应的13 _ _ _C-化学位移。柠檬酸盐交叉峰以红色表示。葡萄糖、甘油、谷氨酸 (Glu)、脯氨酸 (Pro)、丙氨酸 (Ala)、乳酸 (Lac)、乙酸 (Ac) 和甘氨酸 (Gly) 的信号也具有高强度。另见SI 附录，表 S5。
通过 LNCaP 介质的1 H- 13 C HSQC 和1 H- 13 C HMBC（异核多键相关）异核相关研究中柠檬酸盐1 H 和13C 化学位移的交叉峰的存在证实了这些共振的归属，补充[1,6- 13 C]葡萄糖（图4D）。

补充[1,6- 13 C 2 ] 葡萄糖后，培养基中存在的其他13 C 标记代谢物以及丙酮酸和乙酰辅酶 A 池的13 C 富集。

除了标记的柠檬酸盐和 [1,6- 13 C 2 ]葡萄糖本身的13 C 信号外，培养基的 2D 1 H- 13 C HSQC 和1 H- 13 C HMBC 异核相关光谱也显示出相对较高的13 C 信号[3- 13 C]乳酸、[3- 13 C]丙氨酸、[4- 13 C]脯氨酸、[2- 13 C]甘氨酸、[1/3- 13 C]甘油和[4- 13 C ]的强度]谷氨酸（图 4D和SI 附录，表 S5）。显然，葡萄糖碳用于合成前列腺上皮细胞系分泌的几种代谢物。
在为细胞提供 99% 富集的 [1,6- 13 C 2 ] 葡萄糖后，丙酮酸库的 13 C 富集是由乳酸的13 C富集确定的，假设这反映了丙酮酸富集，因为丙酮酸的速率-乳酸转化率高。从培养介质的1 H 光谱估计乳酸 C3 的分数富集；由于3 J HH与相邻质子偶联，未标记乳酸的甲基质子在 1.33 ppm 处显示为双峰，而 [ 13 C 3 ] 乳酸的甲基质子由于额外的1 J CH以双峰形式出现耦合。LNCaP的培养基和细胞提取物的[ 13 C 3 ]乳酸与[ 12C 3 ]乳酸的比率表明，细胞中约80%的丙酮酸库是13 C标记的。对于 VCaP，大约 75% 的丙酮酸池是13 C 标记的（SI 附录，图 S4 和表 S2）。根据分泌的谷氨酸的13 C 3标记模式估计，乙酰辅酶A的13 C富集度估计为 LNCaP 的 56% 和 VCaP 的 50%（SI 附录，表 S2）。

葡萄糖消耗率及其影响。

为了确定 VCaP 和 LNCaP 之间的总体能量代谢是否不同，它们的葡萄糖消耗率通过测量48 小时后两种细胞系的孵育培养基中[1,6- 13 C 2 ] 葡萄糖的消耗来估计。这通过首先积分13 C NMR 光谱中的[1,6- 13 C 2 ]葡萄糖峰并将积分与[ 13 C]乳酸峰积分进行比较来完成。随后，[ 13 C]乳酸浓度通过积分1中的13 C标记的乳酸峰来确定H NMR 光谱并将其与三甲基甲硅烷基丙酸 (TSP) 峰的积分（浓度 0.2 mM）进行比较，将乳酸和 TSP 的质子数考虑在内。LNCaP 细胞使用的葡萄糖（每 10 6 个细胞255 ± 19 nmol/h ）大约是 VCaP 细胞（每 10 6 个细胞 93 ± 22 nmol/h）的2.5倍（SI 附录，表 S2）。

将其与柠檬酸盐和其他分子的生产速率进行比较是有意义的（SI 附录，图 S1）。如SI 附录中所述，可以从这些数字推导出每 10 6 个细胞约 250 nmol/h 的估计氧化丙糖消耗率。如果 21% 通过 PC 途径进行（下文讨论），这将相当于每 10 6 个细胞约 53 nmol/h ，这远大于 LNCaP 中每 10 6 个细胞 1∼10 nmol/h 的柠檬酸盐生产速率。因此，PC 回补可以完全覆盖柠檬酸盐分泌造成的碳损失。此外，估计的氧化消耗率也高于乳酸和丙氨酸的产生率（SI 附录，表 S1)，表明大量的氧化代谢。

用 [2- 13 C]丙酮酸标记柠檬酸盐。

丙酮酸碳可以通过乙酰辅酶A通过PDHC（丙酮酸脱氢酶复合物）或通过草酰乙酸通过PC最终形成柠檬酸，这为向克雷布斯循环提供碳提供了回补途径（图1A-E）。为了估计丙酮酸碳的哪一部分通过PC进入克雷布斯循环，我们向LNCaP和VCaP细胞施用[2- 13 C]丙酮酸而不是13 C-标记的葡萄糖。这导致培养基中柠檬酸盐的碳 C1/5 和 C3 上有13 C 标记（图 5）。
[size=0.75]图 5。

[2- 13 C]丙酮酸补充后前列腺细胞生长培养基的13 C NMR光谱。显示了 RPMI-1640 培养基的光谱，其中 LNCaP 细胞（红色）或 VCaP 细胞（蓝色）在培养基中添加 [2- 13 C]丙酮酸后已经生长了 48 小时。指示了柠檬酸盐的 C1 和 C3 信号的位置。光谱以-2.0 ppm 为参考并缩放至 TSP。
当 [2- 13 C] 丙酮酸用于生产乙酰辅酶 A 时，13 C 标记将在 C1（第一轮克雷布斯循环）或 C5/6（第二轮）结束。然而，如果这个13 C 标签通过草酰乙酸 (PC) 进入克雷布斯循环，它将以柠檬酸盐 C3 和 C4 结束（克雷布斯循环的第一轮），其中一半将在 C3 和 C4 结束（均匀分布，第二轮周期）。C4 上的碳将在下一轮克雷布斯循环中进入 C5 和 C6，而 C3 上的碳将在下一轮中再次平均分布在 C3 和 C4 上。C5 和C6 作为CO 2损失。金额13对于 LNCaP，C1/5 位置的 C 标记比 C3 位置高约 5.2 倍，VCaP 高约 14 倍，这是流过乙酰辅酶 A 的丙酮酸碳相对于草酰乙酸的比例的估计值。

在这些实验中，LNCaP 细胞培养基中乳酸的富集分数（从乳酸和丙氨酸的 C2 位置的13 C/ 12 C 比率测量）估计为 83%。

是否通过补充 [5- 13 C] 谷氨酰胺来标记细胞外柠檬酸盐？

最后，我们测试了谷氨酰胺是否可以作为 LNCaP 和 VCaP 分泌的柠檬酸盐的碳源。谷氨酰胺碳可以通过 GDH 或转氨作用从谷氨酸产生的 α-酮戊二酸进入三羧酸循环，然后通过草酰乙酸进入氧化途径或通过异柠檬酸和异柠檬酸脱氢酶 (IDH) 进入还原途径。后一种途径也可以在胞质溶胶中进行（图1E）。当向细胞提供[5- 13 C]谷氨酰胺时，氧化和还原途径都可以为分泌的柠檬酸盐贡献13 C ，这将在C1、C5和C6位置不同地标记柠檬酸盐（图6A）。
[size=0.75]图 6。

[5- 13 C]谷氨酰胺补充后柠檬酸盐的13 C标记。( A ) 谷氨酰胺的13 C 碳可以在 C1 位（还原代谢）和 C5 和 C6 位（氧化代谢）标记柠檬酸盐。( B ) LNCaP 细胞培养培养基（红色）和加入柠檬酸盐（绿色）的培养基的13 C NMR 光谱。指示了 C1/5 和 C6 共振。( C ) B中介质的1 H- 13 C - HMBC异核相关谱。表明了柠檬酸盐共振。C6 共振从 182.6 ppm 处的重叠共振在二维光谱中得到解析。(D )补充有[5- 13 C]谷氨酰胺的VCaP细胞的孵育培养基的1 H- 13 C - HMBC并孵育48小时。表明了柠檬酸盐共振。非常低水平的柠檬酸盐 C6 信号证实了大多数以柠檬酸盐结尾的谷氨酰胺碳遵循还原羧化途径。
我们观察到[5- 13 C]谷氨酰胺的13 C标记出现在柠檬酸盐的碳位置C1/5处的13 C-NMR光谱中。用正确标记的柠檬酸盐掺入其中一个样品证实了这一分配（图 6B）。因为位置 C6的13 C 碳与 1D 光谱中焦谷氨酸的共振重叠，我们进行了1 H- 13 C HMBC 测量以减轻这种重叠。正如所料，柠檬酸盐 C1/5 共振清晰可见，但也观察到 C6 信号（图 6C和D）。这些分配通过在样品中加入柠檬酸盐来确认（SI 附录，图S5）。

标记的相对量不能直接从1 H- 13 C HMBC 光谱中的峰强度推导出来，因为 J CH耦合和弛豫的差异。为了确定最终在 C1/5 和 C6 中的13 C标记的比率，我们在补充有未标记柠檬酸盐的培养基样品上记录了额外的1 H- 13 C HMBC光谱。将已知的 C1/5:C6 比率 (2:1) 与发现的峰强度 C1/5:C6 比率进行比较，给出校正因子以得出 [5- 13 C]中的真实 C1/5:C6 柠檬酸盐比率谷氨酰胺标记实验。[ 5-13后13 C6 和13 C1/5 柠檬酸盐的存在C]谷氨酰胺补充剂表明已遵循还原和氧化途径（SI 附录，表 S3）。

为了估计 C5 谷氨酰胺碳对分泌的柠檬酸盐中 C1、5、6 碳库的贡献，通过整合柠檬酸盐的13 C1/5 共振并使用还原性与氧化性的比率来确定13 C标记的柠檬酸盐碳浓度代谢，如上计算，以估计总富集柠檬酸盐碳积分（SI 附录）。使用产生的柠檬酸盐总量，通过整合柠檬酸盐的1 H 共振并将其归一化为 TSP 共振来确定，谷氨酰胺对柠檬酸盐的13 C 贡献估计为 26% 至 29%（SI 附录，表 S3）。由于这种标记可以通过谷氨酸库与 α-酮戊二酸、异柠檬酸和柠檬酸库之间的交换来解释，这并不意味着谷氨酰胺碳是柠檬酸生产的重要碳源，而是有可用的途径.

在上述计算中，假设柠檬酸盐中的 C5 和 C6 标记相同。然而，如果标记的柠檬酸盐与异柠檬酸盐快速交换，而 α-酮戊二酸 C6 标记可能会因与未标记的二氧化碳交换而丢失。SI 附录中描述了这些计算中 C6 标记减少的后果以及通过细胞溶质还原羧化进行柠檬酸盐标记的可能性。

模拟柠檬酸盐的分泌和 PC 的相对贡献。

前列腺细胞的一个独特特性是它们分泌大量的柠檬酸盐。因此，探索是否可以利用分泌的柠檬酸盐的特定13 C-碳标记模式来影响前列腺细胞内的代谢是有意义的。为此，我们开发了一个定量模型来计算柠檬酸盐（和其他分子）与克雷布斯循环的差异以及回补 PC 和丙酮酸脱氢酶复合物的相对贡献的测量值。在该模型中，[1,6- 13 C 2 ]葡萄糖和[2- 13 C]丙酮酸补充后的细胞外柠檬酸盐的13 C 标记模式用作简单输入（SI 附录）。

添加到培养基中的 [1,6- 13 C] 葡萄糖首先在糖酵解过程中转化为 [3- 13 C] 丙酮酸，然后标记物可以通过丙酮酸脱氢酶复合物和乙酰辅酶 A 进入三羧酸循环并在 C2 处掺入柠檬酸中(图1B )。在完成一个完整的克雷布斯循环后，该标签最终位于草酰乙酸的 C2 或 C3 位置。如果草酰乙酸随后与另一种13 C2 标记的乙酰-CoA发生缩合反应，则柠檬酸盐形成为 2,4- 13 C 2柠檬酸盐或 2,3- 13 C 2柠檬酸盐。柠檬酸盐共振 C2 和 C4 显示13 C- 13C 与 C3 和彼此耦合。来自不同13 C– 13 C 耦合 C2 或 C4 碳的共振导致柠檬酸盐的13 C 信号以 46.6 ppm 为中心由不同的部分重叠成分组成（图 4和SI 附录，图 S3）。除了通过 PDH 以柠檬酸盐结尾的标记外，丙酮酸标记还可以通过 PC 反应直接进入草酰乙酸，这使得标记最终以柠檬酸 C3 和 C4 结尾（由于苹果酸、富马酸和草酰乙酸池之间的快速交换而均匀分布） . 一个循环后，此标签将分布在柠檬酸盐 C3、C4、C5 和 C6 上。每个克雷布斯循环周期都会分泌一小部分柠檬酸盐，根据分泌前完成的循环次数，13 C 标记模式会有所不同。这些贡献的总和导致培养基中柠檬酸盐的特定13C-标记模式。由于这种标记模式可能会受到与克雷布斯循环不同的其他代谢物的影响，我们评估了13种明显的克雷布斯循环分泌物。柠檬酸盐碳上的 C 分布。
由于与 C5 和 C6 相比，柠檬酸盐的 C2+C4 和 C3 信号的积分更高，我们建议将这些信号的比率R 1作为与克雷布斯循环不同的柠檬酸盐分子的表观分数的第一个量度。我们使用这个比率作为模型的输入来计算明显的克雷布斯循环分泌分数d以及丙酮酸脱氢酶复合物 (PDC) 和 PC 途径的相对贡献（SI 附录）：

除了补充产生 [3- 13 C] 丙酮酸的 1,6- 13 C 2标记的葡萄糖外，我们还应用了 [2- 13 C]丙酮酸作为替代底物。[2- 13 C]丙酮酸的标记物通过乙酰辅酶A进入克雷布斯循环，首先进入柠檬酸C1，一个循环后进入柠檬酸C5和C6。通过 PC 生成草酰乙酸的碳原子将在 C3 和 C4 处以柠檬酸盐形式结束，在 C3、C4、C5 和 C6 处经过一个循环后（图 1B-E）。从这些标记模式中，我们提出了比率R 2来估计 PC 对分泌的柠檬酸盐的相对贡献，因为柠檬酸盐 C3 只能通过 PC 源自13 C（见图 1 B-E ):

如果分泌的柠檬酸的相对贡献足够大，R 1可以作为间乌头酸酶抑制和柠檬酸分泌的指标。例如，如果分泌的柠檬酸盐部分支配其他从克雷布斯循环中发散碳的分解途径，则表观克雷布斯循环分泌部分d接近实际的柠檬酸分泌部分c（SI 附录）。然后，大部分在克雷布斯循环的第一轮发散，主要存在 C2（PDH 途径）和 C4（PC 途径）柠檬酸盐，使得R 1 ≈ 1（图 7 A）。另一方面，如果柠檬酸盐的碳原子在克雷布斯循环中进一步加工，则预计 C2、C3 和 C4 的标记大致相同，比率R 1接近 0.5。在这种情况下，其他 cataplerotic 途径的贡献变得更加突出（c < d）。图 7A中d = 0处的偏移是由于 PC 路由的贡献。
图 7。

PC 分数与表观分泌分数d与实验柠檬酸盐碳比率 R 1和 R 2。( A ) R 1与在生长培养基中添加 [1,6- 13 C 2 ] 葡萄糖后的分泌部分d 。( B ) PC 分数与分泌分数d的关系图，实验发现R 1 = 0.75 和R 2 = 5.2 在 LNCaP 在补充有 [1,6- 13 C 2 ] 葡萄糖或 [2- 13 C] 丙酮酸盐的培养基中孵育后48 小时。
两个 LNCaP 样品的比率R 1为 0.74 和 0.76， LNCaP ( n = 5) 的比率R 2估计为 5.2 ± 1.0， VCaP 的比率 R 2 估计为13.8 ± 1.4 ( n = 2)。使用这两个比率作为定量代谢模型（SI 附录）的输入，我们计算了 LNCaP 细胞在每个克雷布斯循环后分泌的柠檬酸盐的表观分数为 0.79（图7B），这转化为平均数量0.26 克雷布斯循环在标签被分泌之前转。此外，我们计算出 PC 对柠檬酸盐产量的部分贡献为 0.21。在这些计算中，具体的13考虑了丙酮酸和乙酰辅酶A的C富集。但是，离开克雷布斯循环的额外碳对 PC 的部分贡献的计算没有影响。

讨论

在这项研究中，我们绘制了参与为人类前列腺癌细胞系 LNCaP 和 VCaP 分泌的柠檬酸盐提供碳的代谢途径。为此，我们应用了13C 标记的底物，用于跟踪标记在柠檬酸盐的不同碳位置上的结合。我们的实验结果提供了直接证据，即供应的葡萄糖和谷氨酰胺的碳被这些细胞分泌的柠檬酸盐的碳骨架吸收。我们确定葡萄糖是柠檬酸盐合成的主要碳源，而 PC 是主要的回补途径，通过柠檬酸盐和其他分子的分泌来补偿克雷布斯循环的碳损失。对代谢转化率的进一步分析表明，谷氨酰胺碳可能对分泌的柠檬酸盐的净合成没有贡献，但可以通过谷氨酰胺酶氧化或还原羧化的碳交换最终进入该分子。提供的天冬氨酸或天冬酰胺碳的标记碳不会以分泌的柠檬酸盐结束。最后，分泌的柠檬酸盐的13 C 标记作为输入来描述从葡萄糖和丙酮酸盐到柠檬酸盐的碳流动。

正常的上皮前列腺细胞具有分泌大量柠檬酸盐的独特能力。目前解释这一特性的代谢模型是这些细胞吸收了大量的锌，这会抑制线粒体酶间乌头酸酶（仅次于参与呼吸和终末氧化的酶），因此导致柠檬酸盐的积累及其前列腺腔内的分泌物。由于这种抑制抑制了克雷布斯循环活性，前列腺上皮细胞具有相对较高的糖酵解与氧化磷酸化 (OXPHOS) 平衡。在转化为恶性肿瘤后，这些细胞对 Zn 的摄取被下调，从而释放间乌头酸酶的抑制作用，使得柠檬酸盐在三羧酸循环中以分泌为代价被氧化。我们证明，在转移性前列腺癌细胞 LNCaP 和 VCaP 细胞中，分泌柠檬酸盐的机制仍在运行。这可能是由于它们相对差异化的性质：两者都对雄激素有反应并产生 PSA 。PC3 和 DU145 等低分化细胞不产生柠檬酸盐用于分泌。然而，LNCaP 产生的柠檬酸盐是 VCaP 的 10 倍，这可能与 VCaP（骨）的转移起源与 LNCaP（淋巴结）相比，这表明 VCaP 的分化程度较低。

由于锌转运蛋白 hZIP1 仍存在于 LNCaP 细胞中，我们测试了将 Zn 2+添加到孵育培养基中的效果。柠檬酸盐产量减少 (LNCaP) 或不受影响 (VCaP)。这可能是因为细胞已经含有来自它们最初生长的胎牛血清中的锌，并且任何额外的 Zn 2+都不会进一步提高柠檬酸盐的产生。锌可能对这些细胞有毒，但在 50 µM 的浓度下，我们没有观察到细胞死亡，如先前报道的。尽管如此，锌对恶性细胞（如 LNCaP）具有多种抑制作用，例如对线粒体和糖酵解酶活性的抑制作用。事实上，分泌的柠檬酸盐、乳酸和丙氨酸水平降低以及丙氨酸/乳酸水平升高表明添加锌后 LNCaP 细胞的代谢活性发生了改变，这可能与锌的储存有关。

或者，尽管存在 hZIP1，锌的吸收和氧化过程的抑制在 LNCaP 细胞中可能不是非常有效，这与我们观察到的这些细胞的相对较高的估计氧化率一致。提出的前列腺上皮细胞恶性肿瘤的代谢进展首先涉及 OXPHOS 在糖酵解方面的上调，然后在更具侵袭性的癌细胞中转变为 Warburg 谱。LNCaP 细胞可能仍处于更具氧化性的阶段，这与表明亲代 LNCaP 细胞具有氧化特性的研究一致。

由于正常上皮细胞中的柠檬酸盐与克雷布斯循环不同，因此需要提供该循环的回补碳。对大鼠前列腺上皮细胞的研究表明，柠檬酸盐的产生需要补充天冬氨酸，因此天冬氨酸转化为草酰乙酸可能是一种回补途径。这一观点得到了天冬氨酸-谷氨酸转运蛋白 EAAC1 广泛存在于人类前列腺上皮细胞中的发现的支持。由于这也包括 LNCaP 细胞，我们预计将13 C标记的天冬氨酸添加到 LNCaP 和 VCaP 细胞的孵育培养基中会导致13 C标记柠檬酸盐。然而，尽管在相同样品的1 H NMR 光谱中存在明显的柠檬酸盐峰，但在培养介质的光谱中没有观察到柠檬酸盐的可检测13 C 共振。我们也没有观察到LNCaP 和 VCaP 提取物中的13 C 天冬氨酸共振，这表明尽管存在天冬氨酸转运蛋白，但它们对天冬氨酸的摄取很低或不存在。当用天冬酰胺代替天冬氨酸时，也得到了类似的阴性结果。有趣的是，在 LNCaP 雄激素消融细胞的培养基中添加天冬氨酸不能挽救线粒体丙酮酸载体抑制的作用，而谷氨酰胺和谷氨酸能够做到这一点。显然，天冬氨酸或天冬酰胺不是人前列腺癌细胞产生柠檬酸盐的克雷布斯循环的绝对要求，但我们不能排除它们在正常前列腺上皮细胞产生柠檬酸盐中起作用。

为了进一步研究哪些化合物可以为我们的人类细胞系中分泌的柠檬酸盐提供碳原子，我们将它们与13C 标记的葡萄糖、丙酮酸盐或谷氨酰胺一起孵育。由于在所有情况下都在培养基中观察到富含13 C的柠檬酸盐，这将这些化合物确定为分泌柠檬酸盐的潜在碳源。在这些实验中观察到的标记模式只能在碳原子参与克雷布斯循环的多圈时发生，这进一步直接证明了间乌头酸酶（将柠檬酸转化为异柠檬酸的酶）具有活性。在我们的研究中，LNCaP 的增长速度比 VCaP 快得多，这与其高四倍的葡萄糖消耗率一致。

在用[ 13 C]葡萄糖或[ 13 C]丙酮酸补充LNCaP和VCaP细胞后显着产生13 C-标记的柠檬酸盐，这表明糖酵解是为这些细胞分泌的柠檬酸盐提供碳的主要途径。有趣的是，葡萄糖还刺激正常人前列腺上皮细胞释放锌。与 [2- 13 C]丙酮酸孵育后，柠檬酸 C1 与 C3的较高13 C 标记表明这些碳原子中的大部分通过丙酮酸脱氢酶 (PDC) 反应和乙酰辅酶 A 进入三羧酸循环。从比例>R2= C1 / 5/ C3 R2=C1/5/C3和碳分布模型，我们估计通过PC反应流入克雷布斯循环的丙酮酸碳的比例对于LNCaP约为0.21，对于VCaP约为0.12。在这种情况下，令人惊讶的是，VCaP 产生的柠檬酸盐比 LNCaP 少。PC 活性在肿瘤中差异很大，这可能代表了对每种肿瘤类型对回补的特定需求的适应。

[5- 13 C]谷氨酰胺的补充表明LNCaP和VCaP分泌的柠檬酸盐的碳也来源于谷氨酰胺。在增殖的癌细胞中，已知谷氨酰胺是主要的回补前体，增加的谷氨酰胺分解被认为是这些细胞代谢的一个关键特征。在将谷氨酰胺转化为 α-酮戊二酸后，其碳可以通过氧化代谢或通过 IDH 和乌头酸酶的还原羧化通过反向克雷布斯循环最终在线粒体中形成柠檬酸盐。还原性羧化也可以通过 IDH1 和 aconitase-1 反应在胞质溶胶中进行，这已证明在几种细胞系中是可操作的。根据我们的 HMBC 实验，在补充谷氨酰胺后在柠檬酸盐中观察到的13 C 中约有 60% 遵循 LNCaP 和 VCaP 中的还原羧化途径，而另一部分通过氧化克雷布斯循环途径进行。然而，由于还原羧化涉及交换反应，通过该途径观察到的13 C 可能来自同位素交换，而不是柠檬酸盐的净合成。在葡萄糖存在的情况下，谷氨酰胺占 LNCaP 和 VCaP 细胞外柠檬酸盐中碳的 20% 至 25%。尽管有这个标签，但我们对 PC 和柠檬酸盐分泌率的比较表明，在当前情况下，谷氨酰胺碳并不是回补柠檬酸盐分泌的绝对要求。

有趣的是，还原羧化似乎在癌症和其他克雷布斯循环受损的细胞中特别重要。由于正常前列腺上皮细胞中的这个循环受损，因此这些细胞中的柠檬酸合成不仅发生在克雷布斯循环的第一步中的线粒体中，而且还通过由 IDH 和乌头酸酶介导的谷氨酰胺还原羧化得到碳流的支持。 (图1A)。

尽管氧化磷酸化似乎在上皮前列腺细胞中受到限制，但克雷布斯循环活性降低的程度尚不清楚。SI 附录中描述的定量模型提供了每平均完整克雷布斯循环圈数的表观克雷布斯循环分泌分数的估计值。在该估计中，我们使用了在补充13 C 标记的葡萄糖或丙酮酸盐后获得的 NMR 光谱的13 C 信号积分的两个简单比率。该措施独立于碳进入克雷布斯循环的所施用补充剂的13 C 富集，独立于13 C J 耦合模式，并且可以轻松调整以与其他13C标记的补充剂。除了这个克雷布斯循环提取数之外，我们还估计了 PC 和 PDC 对进入克雷布斯循环的碳的部分贡献。从模型中计算出的表观分泌分数d不仅可以代表柠檬酸盐的分泌，还可以代表每个循环周期中其他代谢物的流出，这使得分泌分数d成为真实柠檬酸盐分泌分数c的上限。其他分泌途径如 GDH、天冬氨酸转氨酶、PEPCK 和苹果酸酶可以催化碳从克雷布斯循环中流出。后两种酶反应可促进丙酮酸的产生，因此可能是观察到的13稀释的原因。补充 99% [1,6 13 C] 葡萄糖和 [2- 13 C] 丙酮酸后，丙酮酸中的 C 浓缩至 80%。我们在本研究中估计的 PC 的过量回补供应可能会补偿这些流出物造成的克雷布斯循环碳的损失，例如谷氨酸的碳。

多篇关于代谢通量模型的论文报告了与 α-酮戊二酸 - 谷氨酸转化相关的高交换通量，与总克雷布斯循环通量相当，来自心脏和大脑等组织的体内研究以及来自黑色素瘤、肝细胞和神经胶质瘤细胞的体外研究。根据未标记谷氨酸池的大小，这可能会影响13C 标记到其他代谢网络，并部分解释了标记碳从克雷布斯循环中流出。到目前为止，还没有关于这种交换通量的文献值可用于前列腺。未来可以努力通过估计促进克雷布斯循环流出的细胞内谷氨酸或其他丰富的代谢物来扩展模型，以更好地估计每个循环次数的实际柠檬酸分泌分数。

除柠檬酸盐外，通过 2D 1 H- 13 C 相关光谱法鉴定培养基中的其他标记代谢物。这些包括[3- 13 C]乳酸和[3- 13 C]丙氨酸，它们通过从[1,6- 13 C 2 ]葡萄糖经[3- 13 C]丙酮酸的糖酵解在细胞质中产生。在糖酵解的中途，13 C-标记的二羟基丙酮可以通过sn -glycerol -3-phosphate转化为 [1/3- 13 C]甘油，并且13 C-标记的 glycerate-3-phopshate 可以通过丝氨酸转化为 [2- 13C]甘氨酸。已发现甘氨酸的高合成率和消耗率与 60 种肿瘤细胞系中的肿瘤细胞增殖率相关，其中 PC3 以及摄取和分泌率的测定表明这些代谢物的分泌率不同。如果13 C 标记通过乙酰辅酶 A 进入克雷布斯循环，它可以通过 α-酮戊二酸掺入 [4- 13 C]谷氨酸中。谷氨酸随后可以通过 Δ 1 -pyrroline-5-carboxylate 转化为 [4- 13 C]脯氨酸，这一过程已被证明在前列腺癌细胞系 PC3 中被致癌转录因子 c-MYC 上调。这些代谢物也由其他细胞分泌，例如非小细胞肺癌细胞系 H1299 和 A549。

总之，我们确定了许多碳源和代谢途径，这些碳源和代谢途径有助于人前列腺癌细胞 LNCaP 和 VCaP 中分泌的柠檬酸盐中的碳。尽管预计健康上皮细胞的代谢会有所不同，但基本上这些来源和途径在这些细胞中也是可用的，因此是维持正常前列腺管腔中柠檬酸盐池的潜在候选者。应用13 C 底物后，细胞外柠檬酸盐中13 C 碳的比例可作为报告上皮细胞代谢（恶性）改变的生物标志物。

材料和方法细胞系。

细胞系 LNCaP (ATCC CRL-1740) 和 VCaP (ATCC CRL-2876) 均源自人类前列腺腺癌转移瘤，是科罗拉多大学健康科学中心 (Denver, CO) 的 Gary J. Miller 的礼物。在补充有谷氨酰胺 (2 mM)、胎牛血清 (10% vol/vol)、100 U/mL 青霉素和 100 µg 链霉素 (LNCaP 传代数约为 48) 的全 RPMI-1640 培养基中生长。在13 C 标记实验中，每个烧瓶使用大约 5 × 10 6到 15 × 10 6 LNCaP 细胞或 15 × 10 6到 20 × 10 6 VCaP 细胞。对于柠檬酸盐产生率实验，使用了～30 × 10 6 LNCaP 细胞或 40 到 50 × 10 6 VCaP 细胞。

13 C 标签。当细胞数量足够大时（即，达到完全汇合时），将生长培养基更换为补充有谷氨酰胺和不同13 C-标记底物的新鲜 RPMI-1640 培养基。除非另有说明，否则在该孵育期间不添加血清以避免由于血清的高蛋白质含量而在 NMR 光谱中出现宽基线。将细胞在 37°C、5% CO 2下孵育 48 小时。在所有实验中，低浓度的天冬氨酸 (150 µM) 存在于 RPMI-1640的标准配方中。
LNCaP 和 VCaP 均在葡萄糖 (11 mM) 被 99% 富集的 [1,6- 13 C 2 ] 葡萄糖 (11 mM) 替代的培养基中生长。在不同的实验中，添加 [U- 13 C 4 ] 天冬氨酸 (2.0 mM) 或 [U- 13 C 4 ] 天冬酰胺 (2.0 mM) 以测试天冬氨酸和天冬酰胺作为碳源，其中存在标准未标记的葡萄糖，或者它被丙酮酸（6 mM）取代。[5- 13 C]谷氨酰胺(2mM)和[2- 13 C]丙酮酸(7mM)也被测试为分泌柠檬酸盐的碳源。在使用13 C 标记的谷氨酰胺的实验中，它取代了未标记的谷氨酰胺。在实验中13使用 C-标记的丙酮酸，不含葡萄糖的培养基。在所有实验中，谷氨酰胺和葡萄糖浓度相同，除非葡萄糖被丙酮酸替代。所有13 C 标记实验一式两份进行，每个实验另外一个烧瓶补充相应的13 C 底物的未标记等效物。使用这些底物的补充物来分析分泌的柠檬酸盐中的13 C-标记模式（图 1 B-E）。

样品制备。

48小时后收集培养基并立即置于冰上。通过离心（3,750 rpm，2 °C，10 分钟）去除培养基中可能存在的分离细胞。接下来，取 4 mL 等分的培养基，加入 TSP 作为 NMR 参考，最终浓度为 0.2 mM。随后，在冻干前将样品冷冻过夜。

对于每个实验，使用含有13 C 标记底物的两个烧瓶中的一个来估计细胞数量。为此目的，在收集培养基后，用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 缓冲液洗涤细胞并通过添加胰蛋白酶溶液进行分离。在短暂的孵育期（37 °C，5 分钟）后，将细胞溶解在新鲜的完全 RPMI-1640 缓冲液中，并使用 Neubauer 计数室进行计数。提取剩余两个烧瓶中的细胞（一个13 C 标记，一个未标记）以检查是否存在13C标记的底物和其他代谢物。在加入甲醇-水混合物 (1:1) 之前，用 PBS 缓冲液洗涤细胞两次。使用刮刀分离细胞并收集细胞提取物。将细胞提取物置于冰上之前剧烈摇动。随后，将细胞提取物离心（3,750 rpm，2 °C，10 分钟）以去除水不溶性部分。收集上清液并使用 Savant SpeedVac 浓缩器去除甲醇。然后在冻干前将样品冷冻过夜。

核磁共振光谱。

将冻干样品溶解在 500 µL D 2 O 中，将 pH 值调节至 7.4，然后在 Bruker Avance 和 Avance III 500 MHz 光谱仪上进行分析。水抑制的1 H NMR 光谱记录了培养基样品的 256 至 320 次扫描和细胞提取物样品的 640 次扫描。使用 WALTZ64 1 H 去耦，通过 5,000 到 21,000 次扫描记录13 C NMR 光谱。柠檬酸盐共振的分配通过在初始测量后加标样品来确认。此外，对所有标记实验进行了 2D 1 H- 13 C HSQC 和 HMBC 相关实验，以确认共振分配并检查柠檬酸盐和其他13C标记的代谢物。在添加了 [5- 13 C] 谷氨酰胺的样品上进行了1 H- 13 C HMBC 实验，以分离重叠共振，另外还对添加了柠檬酸盐作为谷氨酰胺实验参考的新鲜培养基样品进行了比较峰强度与标记的实验。此外，在补充有[1,6- 13 C 2 ]葡萄糖的LNCaP培养基中测量1 H- 13 C相关性以确定其他13 C标记的代谢物的存在。

柠檬酸盐产量和锌补充剂的估计。

LNCaP 和 VCaP 细胞的六个烧瓶在 RPMI-1640 + 2 mM Gln + S/P 无血清 (LNCaP) 或有 2% 碳剥离血清 (VCaP；这些细胞在无血清的情况下从烧瓶中分离) 中孵育并生长至完全融合。如上所述，培养基更换为新鲜培养基；对于每个细胞系的三个烧瓶，这含有 50 µM Zn 2+，从 ZnCl 2溶液中添加，三个烧瓶接受不添加 Zn(II) 的培养基。48小时后收集培养基并收获细胞并计数。在加入 TSP 后将 4 mL 培养基的等分试样冻干并溶解在 D 2 O 中进行1 H NMR。1 _柠檬酸盐、乳酸和丙氨酸的 H 峰积分和作为参考的 TSP 用于估计它们在 48 小时内的平均产量。进行独立的双样本t检验以确定向培养基中添加 Zn 2+是否显着改变了柠檬酸盐、乳酸或丙氨酸的产生。

补充 [1,6- 13 C 2 ]葡萄糖后的13 C 葡萄糖池富集。

由于当未标记的培养基被补充有 [1,6- 13 C 2 ]葡萄糖的培养基代替时，细胞内葡萄糖仍然存在，我们通过计算12 C-乳酸和假设13 C-标记的葡萄糖和未标记的葡萄糖的乳酸产生速率相同，则 48 小时后生长培养基的1 H NMR 光谱中的13 C-乳酸。为了估计 48 小时内源自13 C-标记的葡萄糖的乳酸和柠檬酸的相对产量， 13 C-乳酸和13 C-柠檬酸信号在13整合培养介质的 C NMR 光谱以计算它们的比率。

在 [1,6- 13 C 2 ] 葡萄糖补充剂后拟合13 C 标记的柠檬酸盐信号。

使用 AMARES 在软件程序j MRUI中拟合13 C 标记的柠檬酸盐信号，其中 C2 和 C4 的单峰为 46.5 ppm，C2-C3 的双峰。我们假设洛伦兹线形和线宽限制在 4 到 20 Hz 之间。我们假设所有峰的相位相同，并在 δ( 13 C2)+19 Hz 和 δ( 13 C2)−19 Hz处拟合 C2 区域中的两个较小的 J 耦合峰（假设1 J C2C3 = 38 Hz）。C2 和 C4 之间的 J 耦合小于13 C 线宽，因此在拟合中被忽略。在 76.2 ppm 的 C3 区域中，四个外部峰的化学位移设置为 δ(13 C3)−38 Hz、δ( 13 C3)−19Hz、δ( 13 C3)+19 Hz 和 δ( 13 C3)+38 Hz 相对于中心 C3 峰值。

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