抗癌治疗与儿童癌症幸存者的长期表观基因组变化有关

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抽象的背景
儿童癌症幸存者 (CCS) 表现出显着增加的慢性疾病和过早死亡。DNA甲基化异常与慢性疾病的发展和预期寿命缩短有关。我们研究了抗癌治疗与长期 DNA 甲基化变化相关的假设，这可能是晚期健康不良影响的关键驱动因素。

方法

使用 MethylationEPIC 阵列在来自 32 名儿童癌症患者的配对样本（治疗前/治疗后）中评估全基因组 DNA 甲基化。另外，在来自不同成人 CCS（平均诊断后 22 年）的 32 个样本中测定了甲基化，并与无癌症对照（n  = 284）进行了比较。

结果

在儿童癌症患者的治疗后发现了广泛的 DNA 甲基化变化，包括 146 个差异甲基化区域 (DMR)，这些区域在 32 个治疗后样本中持续改变。对成人 CCS 的分析在 DMR 的 107/146 处确定了匹配的甲基化变化，表明治疗后变化可能长期保留。成年幸存者还表现出表观遗传年龄加速，与 DMR 甲基化无关。此外，DUSP6 DMR 的甲基化改变与早期死亡率显着相关，这表明甲基化改变可能预示着 CCS 中某些晚期不良健康影响。

结论

这些新的甲基化变化可以作为生物标志物，用于评估正在进行的治疗中的正常细胞毒性和预测 CCS 的长期健康结果。


背景

近年来，儿童癌症的治疗有了显着改善，在高收入国家，儿童癌症的总生存率超过 80%。因此，成年儿童癌症幸存者 (CCS) 的人口继续增加，在英国大约 750 名年轻人中就有 1 名 。然而，儿童癌症患者通常会接受积极的多药治疗，并且对 CCS 的广泛随访表明，他们长期不良健康结果的风险增加。CCS 的许多慢性疾病发病率较高，包括 3.6 至 6.4 倍的二次癌症风险增加，以及 3-4 倍的心脏死亡风险增加。反过来，这些与发病率和死亡率的高度升高以及 CCS 的预期寿命显着降低有关。用于预测迟发效应的分子标记物将具有重要的临床效用，既可以为那些最有可能出现严重迟发效应的人提供更有针对性的医疗保健随访，也可以监测新疗法或治疗方案的长期健康影响。

一种可能对癌症幸存者产生长期健康影响的潜在机制是癌症治疗引起的表观遗传变化。DNA甲基化是一种关键的表观遗传修饰，在控制基因表达和抑制重复元件方面具有重要作用。此外，DNA 甲基化的变化对癌症的发展至关重要。此外，DNA 甲基化改变的特定模式与所有常见的人类慢性疾病有关，并且已显示与年龄相关的 DNA 甲基化变化可预测多种慢性疾病的发展和预期寿命缩短。孟德尔随机化研究发现证据表明，其中一些 DNA 甲基化变化是慢性疾病发展的原因。事实上，多项人类和动物模型研究表明，生命早期的暴露（例如，香烟烟雾、饥饿状况和性/身体虐待）可导致 DNA 甲基化的改变，维持到成年期并预测慢性病风险增加。使用候选基因方法，我们先前确定暴露于化学疗法可导致HOXA4基因座的位点特异性 DNA 甲基化水平增加。我们假设儿童癌症患者接触癌症治疗可能会导致正常细胞中的异常 DNA 甲基化，这种甲基化可以终生维持，从而导致慢性病水平增加和 CCS 预期寿命缩短。

为了检验这一假设，我们首先确定了抗癌治疗后儿童癌症患者 DNA 甲基化的全基因组变化（研究 1）。随后，我们检查了不同组儿童癌症成年幸存者在治疗多年后是否存在相同的 DNA 甲基化变化，以及它们预测 CCS 生存的能力（研究 2）。因此，这些发现有可能促进对 CCS 迟发效应潜在机制的理解，并为预防或减少危及生命或改变生命的迟发效应提供信息。


方法研究 1

为了确定抗癌治疗后 DNA 甲基化的全基因组变化，我们检查了治疗前后儿童癌症患者配对样本中正常非癌细胞的 DNA 甲基化。最初收集样本是为了评估暴露于拓扑异构酶 II 抑制剂的影响，作为多药方案的一部分，该方案在特定药物、剂量和治疗方案方面有所不同。患者在 1998-2000 年间被招募。这些患者的治疗细节先前已描述并在补充表 1中进行了总结。患者包括 32 名患有血液系统癌症的儿童（1 至 15 岁）（n  = 25；急性淋巴细胞白血病（ALL，n = 22)、急性髓性白血病 (AML, n  = 2)、淋巴瘤n  = 1) 或实体瘤 ( n  = 7: 5 个神经母细胞瘤、1 个骨肉瘤、1 个肾母细胞瘤) (表 1 )。在称为“治疗前”和“治疗后”的两个时间点采集成对样本（血液或骨髓）组（表 1）。为了确保甲基化模式来自非癌细胞，对于血液系统恶性肿瘤患者，必须在达到缓解后（诊断后 5-20 周）采集“治疗前”样本。然而，这些恶性肿瘤的治疗期为 6 个月至 2-3 年，缓解后不会停止治疗。对于实体瘤，“之前”样本来自诊断时/附近，因为这些患者的血液/骨髓样本含有可忽略不计的肿瘤物质。所有 CCS 的“之后”治疗样本均在“之前”样本后 9-95 周采集（样本对之间平均 43.4 周）（每组配对样本的具体细节见表 1）。使用标准程序提取 DNA。
表 1 儿童患者样本摘要（研究 1，在 1998 年至 2000 年间招募）




研究 2

为了研究这些 DNA 甲基化变化是暂时的还是持续到成年期，我们检查了来自不同儿童/青年癌症幸存者的血液样本中 DNA 的甲基化模式，并与年龄/性别匹配的对照人群进行了比较。成人儿童癌症幸存者 (CCS) ( n  = 32) 选自欧洲癌症与营养前瞻性调查 (EPIC) 队列，这是一项正在进行的多中心前瞻性队列研究，参与中心位于欧洲 10 个国家（有关队列的更多详细信息可在别处可以找到）。选择被诊断为 25 岁以下且在 EPIC 招募前至少 10 年（平均诊断后 22 年）被诊断出的癌症幸存者。计算该样本量以允许评估研究 1 中确定的甲基化变化的保留（> 99% 的能力来确定研究 1 中确定的治疗后特征的保留和> 80% 的能力来确定大多数个体 DMR 的变化(105/146; 72%) 并且没有设计成允许在成人 CCS 中进行全基因组分析。
没有具体的治疗信息，因此分析仅限于所有幸存者都接受过化疗和/或放疗的肿瘤类型。由于样本的可用性，我们专注于恶性淋巴瘤和睾丸癌幸存者（表 2）。虽然幸存者接受的具体治疗尚不清楚，但在化疗被普遍接受治疗该疾病之前，一部分淋巴瘤幸存者 ( n  = 8) 接受了治疗（即 1970 年前诊断出的那些）。32 例可用病例包括：1958 年至 1986 年间诊断的霍奇金淋巴瘤 ( n  = 23)、非霍奇金淋巴瘤 ( n  = 6) 和睾丸癌 ( n  = 3)（表 2）。血液样本是在 EPIC 研究开始时（1992-1999）收集的，来自英国（n  = 13）、德国（n  = 12）、意大利（n  = 2）、挪威（n  = 2）和西班牙（n  = 3)。研究参与者提供了知情同意，EPIC 研究得到了每个中心的相关伦理审查委员会和国际癌症研究机构的批准。

表 2 成人 CCS 特征总结（研究 2）




对于研究 2，从 GEO 数据库中确定了具有公开可用的 Illumina MethylationEPIC 阵列数据的一般人群成人对照数据集。对照人群来自密歇根多溴联苯 (PBB) 研究登记处 ，包括具有甲基化数据 ( n  = 658) 且血清 PBB <1 ppb的人群，这是几项研究中用于对“无暴露”或“低于检测水平”进行分类的阈值 。对照与成人 CCS 病例（来自 EPIC）使用最近邻算法和“MatchIT”R 包按年龄（±2 岁）和性别（对照，n = 288; 成人 CCS，n  = 32）（表 3）。

表 3 成人 CCS 和对照的描述性特征（研究 2）


全基因组 DNA 甲基化芯片

使用 Zymo EZ-96 DNA 甲基化试剂盒 (Zymo Research) 进行亚硫酸氢盐转化。使用 Infinium MethylationEPIC BeadChip 微阵列对所有样本中的全基因组 DNA 甲基化进行量化，该微阵列评估超过 850,000 个位点的全基因组 CpG 甲基化，并在爱丁堡大学（英国爱丁堡）的 Wellcome Trust 临床研究机构进行。使用 R studio 3.5.3 版中的 minfi Bioconductor 包 1.28.4 版处理来自所有测试和对照样品的 MethylationEPIC 阵列的原始甲基化数据。确认所有样品的样品质量（检查阵列对照探针和性别不一致）。质量控制失败的样品被排除在外（n  = 4 个成人对照样品）。单样本 (ssNoob) 方法用于归一化。使用 Houseman 方法 估计细胞组成。检测p值 >0.01 的探针和交叉反应探针（即，常染色体和性染色体之间交叉杂交的探针） 被移除。处理后，儿童配对样本保留了 820,139 个探针（其中 n  = 820,134 个通过了成人样本的质量控制）。甲基化值转化为β值，范围从 0（0% 甲基化）到 1（100% 甲基化），代表甲基化强度。

CCS中差异甲基化的鉴定

对于研究 1，差异甲基化区域 (DMR) 使用默认设置的 DMRcate R 包进行识别。使用 Limma R 包（lmFit 函数）在晚期和早期缓解中鉴定了差异甲基化位置 (DMP)。根据变化方向（从早期缓解到晚期缓解）总结了差异 DNA 甲基化，并且使用错误发现率校正 (FDR) 对差异甲基化基因座的所有分析进行了多次测试校正。DMR 之间的相关值是使用 Pearson 对每种癌症类型的相关性计算的，并比较平均值。

CpG 位点和 DMR 用它们的基因组位置、最近的基因以及与基因/CpG 岛的关系进行注释。使用 HumanMethylationEPIC 阵列和 UCSC 对基因、基因组区域（即基因体、非翻译区域、转录起始位点 (TSS)、外显子）和岛位置（岛、海岸、公海）的注释对差异甲基化 CpG 基因座进行注释。与 EPIC 阵列上的整体分布相比，已识别基因座的区域富集度使用卡方 ( χ² ) 检验进行评估。

对于研究 2，我们检查了成人 CCS 和对照样本之间的甲基化差异，仅关注研究 1 中确定的 DMR 和 DMP（甲基化绝对变化 > 5%）。成人 CCS 病例和对照个体之间 DNA 甲基化的差异测定 CpG 位点和 DMR。使用t检查统计差异-测试。通过平均所有保留的 DMR 的变化，计算每个幸存者的单个差异甲基化评分。DMR 被定义为在成年幸存者中复制，如果它们与对照人群在统计学上显着不同，表现出与接受治疗后相同的变化方向，并且甲基化的绝对差异至少为 50% 的变化。研究 1 中的后处理样本。 CpG 位点的注释和基因组位置（相对于基因和岛）的分析如上所述，原始 DMR 和保留 DMR 的分布使用卡方 ( χ ²)测试。

线性回归用于确定在针对年龄、性别和白细胞比例调整后的病例和对照（自变量）之间的个体 DMR（因变量）甲基化是否存在差异。使用 FDR 校正调整p值以进行多次测试。在淋巴瘤病例中进行了类似的分层线性回归分析，以区分在引入化疗作为淋巴瘤标准治疗之前或之后诊断的病例之间 DMR 甲基化的任何显着差异（即，在 1970 年之前或之后诊断的患者）。

表观遗传时钟分析

使用皮肤血钟估计表观遗传年龄（以下简称表观遗传年龄），并使用 Horvath 的在线估计器替代 DNA 甲基化生物标志物（研究 2 ）。_ 尽管时钟是使用 450 K 阵列数据开发的，但 EPIC 阵列数据已被证明可以准确估计 DNA 甲基化年龄，而与缺失的 CpG 位点无关 ( n  = 19)。使用配对t检验比较治疗前后的表观遗传年龄（研究 1），并使用两个样本t检验（研究 1）或 ANOVA（研究 2）按癌症部位比较。

在研究 2 中，为了进一步了解 CCS 中晚期效应的标志物，我们检查了已知与慢性疾病相关的替代 DNA 甲基化生物标志物，例如与健康跨度相关的 PhenoAge或与死亡率相关的 GrimAge 。使用 Pearson 相关性检查 DMR 和表观遗传年龄测量值之间的相关性，并 使用针对年龄和性别进行调整的线性回归检查成人 CCS 和对照（自变量）之间的表观遗传年龄加速标记（因变量，在补充表10中列出）的差异。

成人 CCS 的长期健康结果

作为 EPIC 研究的一部分，收集了成人 CCS 的长期随访数据，包括第二原发性癌症的生存和发展（平均随访 16.8 年）。使用分类变量的χ ² 检验和连续变量的双样本t检验比较了活着与已故的人以及患有第二次癌症的人与未患癌症的人之间的基线特征和 DNA 替代标志物。使用针对年龄和性别调整的线性回归检查 DMR 甲基化或替代 DNA 甲基化生物标志物与生命状态/第二癌症之间的关联。

结果接触癌症治疗会导致正常细胞中出现异常的全基因组 DNA 甲基化模式

为了研究抗癌治疗与正常组织中 DNA 甲基化改变相关的可能性，我们在一组接受多药化疗的 32 名儿童癌症患者中评估了配对血液/骨髓样本中的全基因组甲基化模式。配对样本之间的平均时间为 43.5 周（表 1）。接受癌症治疗前后的细胞类型分布相似，尽管在血液肿瘤患者和实体肿瘤患者中观察到 B 淋巴细胞显着下降（补充表 2 ）。全基因组甲基化分析确定了 146 个差异甲基化区域 (DMR)，这些区域在整个研究人群的治疗后样本中一直发生变化。其中绝大多数（140 DMRS）表现出甲基化增加（图 1A中的示例，补充表3中的全部细节 ）。

图 1：在儿童癌症患者的晚期缓解样本中发现的差异甲基化区域 (DMR) ( n  = 32)。




A在 32 个配对样本集中，在四个已识别的 DMR（DMR 和最近的基因，如图所示）中，早期和进食缓解样本之间甲基化改变的例子。DMR ( n  = 146) 相对于B基因和C CpG 岛的位置总结。D样本集中 DMR 甲基化（β 值）的平均变化（全部，n  = 32），特别是血液肿瘤（Haem，n  = 25）和实体瘤（实体，n  = 7）。误差线代表 SEM。E已识别的 DMR 中 CpG 位点的位置（n = 1045）在完整的 DMR 集（所有 DMR）和成人 CCS 中保留的 DMR 子集（保留的 DMR）相对于 EPIC 阵列中 CpG 的分布。18 个 DMR 没有相关基因，因此没有代表。


鉴定的 DMR 在所有分析的肿瘤类型中表现出相似的 DNA 甲基化改变模式。所有 146 个 DMR 在实体和血液恶性肿瘤中都表现出改变的甲基化，其中 99.3% (145/146) 表现出相同方向的甲基化变化（补充表 4和5）。 尽管样本量很小，但肿瘤类型之间的差异没有统计学意义（表 4，ANOVA p = 0.11）。实体瘤患者的甲基化变化略高（6.2% vs. 4.2%，图 1D)，大多数 DMR (74.0%, 108/146 DMR) 在该组中表现出更大的绝对甲基化变化。这可能是来自实体瘤患者的初始样本是真正预治疗的结果，而对于血液癌症，第一个样本在治疗数周后处于初始缓解状态（表 1）。

表 4 儿童癌症患者中按癌症类型划分的治疗后平均 DMR 甲基化变化 (n = 146)



DMR相对于基因位置和CpG岛的基因组位置如图 1所示。已鉴定的 DMR 内 50.5% 的 CpG 位点位于或接近基因启动子区域（即 TSS（转录起始位点）和第一个外显子，图 1B），其余 DMR 在整个基因的多个位置鉴定。一个子集与任何表达的序列没有明确的关联（n  = 18）。与整个 EPIC 阵列上的位点相比，TSS200 内的位点（TSS 上游 200 bp）和第一个外显子富集了 DMR（图 1E，χ² p < 0.001 ，补充 表 6），并且也更有可能在岛屿和南北海岸，（χ² p  < 0.001，补充表 7，海岸定义为 CpG 岛前后的 2 Kb）。DMR 分布在整个基因组中（图 2），在 1 号染色体上有两个明显的簇（p36.33-p36.32；10 个 DMR 的簇（n  = 47 个 CpG 位点，2.4 Mb 区域），其中有 6 个作图PRDM16基因）和 6 号染色体（p21.33-32；一组映射到 HLA 区域的八个 DMR（n =  128 个 CpG 位点，3.1 Mb 区域））。
图 2：儿童癌症患者后期缓解样本中发现的 DMR 的染色体位置（n  = 32）。




1-22 号染色体上 DMR 的基因组位置用红色垂直线表示。发现 DMR 分布在所有 22 条常染色体上，但在 1 号和 6 号染色体上有两个明显的簇。未显示 X/Y 性染色体，因为它们被排除在差异甲基化分析之外。插图中更详细地显示了 1 号和 6 号染色体上的 DMR 簇。特定基因的位置显示在染色体簇面板上。染色体条带的大小以兆碱基 (Mb) 为单位。N/A 表示没有相关基因。Chr 染色体，Mb 兆碱基。

改变的 DNA 甲基化在成年幸存者中复制

在研究 1 中确定的 146 个 DMR 的甲基化模式在成年 CCS 中相对于年龄匹配的对照人群（研究 2）进行了评估，以确定治疗后确定的甲基化差异是否在成年幸存者中复制. 如果相同区域在成年幸存者和对照组之间表现出显着差异，具有相同的变化方向并且绝对差异至少为研究 1 中看到的大小的 50%，则认为 DMR 是重复的。通过关注 146 DMRs，分析的力量得到了增强，假阳性的识别减少了（与使用这个样本数量的全基因组分析相比）。成年幸存者队列中癌症诊断和 DNA 采样之间的平均持续时间为 22.3 年（表 2）。很可能，明显改变的甲基化的复制可能继发于研究 1 中治疗后观察到的减少的 B 淋巴细胞部分的保留。然而，与对照组相比，成人 CCS 没有显示出 B 淋巴细胞分数的任何减少（补充表 2）。在成人 CCS 中观察到 CD4+ T 细胞有少量但具有统计学意义的减少（0.12 对 0.14，p  = 0.01），因此所有后续分析都针对细胞类型分布的差异（除了年龄和性别）进行了调整。大多数 DMR 在该样本集中被复制（73% (107/146)，成人 CCS 与非 CCS 对照相比在甲基化方面表现出统计学上的显着差异（图 3A中的示例，表中的前 20 个 DMR） 5，补充表 3和补充图 1中的全部细节）。此外，成人 CCS（与成人对照）中 107 个重复 DMR 的甲基化水平密切反映了在治疗后（晚期缓解）儿童癌症患者中观察到的甲基化改变程度（即，它们聚集在蓝色虚线周围）代表图3B中两组的相同甲基化变化 )，这意味着在治疗后的儿童癌症患者中发现的改变的 DNA 甲基化可能在很大程度上是稳定的，并且在治疗停止多年后仍保持不变。DMR 中特定 CpG 位点的差异甲基化水平在成年幸存者（与对照）中也相似，正如在研究 1 中治疗后样品中所见（补充图 2）。与非复制的 DMR 相比，复制的 DMR 中 CpG 的基因组或岛位置没有显着差异（补充表 6和7）。与 DMR 处的频繁差异甲基化相反，相对于对照，只有 47.7% 的非 DMR 相关 DMP 在 CCS 中发生差异甲基化（补充表 8）。
图 3：DMR 保留在成人 CCS 中并与过早死亡有关。





显示了四个代表性 DMR的Beta 值，以说明儿童癌症患者 ( n  = 32) 与成人对照 ( n  = 284) 和成人 CCS ( n = 32)。箱线图显示了各个组中特定 DMR 处甲基化的相对分布，点说明了各个样品中的特定值。前两个面板（HOXA4 和 ITGA2B 基因座的 DMR）在两个对照样品组中显示相似水平的甲基化，在晚期缓解样品和成人 CCS 中甲基化增加相似。底部两个面板（CCER2 和 MAMDC2 基因座处的 DMRS）显示了两个对照样品组中甲基化时间依赖性增加的示例，但在晚期缓解样品和成人 CCS 中与它们各自的对照相比具有相似大小的增加。B 儿童癌症患者（早期与晚期缓解，n = 32）和 成人 CCS （n = 32; 与成人对照相比，n  = 284）。每个点都显示了与每个 DMR 最接近的基因。三角形表示 DMR 没有相关基因。与最初在治疗后儿童癌症患者中发现的变化相比，虚线上方的 DMR 增加了成人 CCS 中的 DNA 甲基化，而虚线下方的那些在 CCS 中甲基化较低。DMR90（ DUSP6基因座）的C DNA 甲基化与成人 CCS 的死亡率相关（n  = 32：活着的n  = 25，已故的n  = 7）。如图所示，成人 CCS ( n  = 32) 和成人对照 ( n  = 284)在 DMR90 处的平均 β 甲基化显示。调整后的线性回归p- 显示了所有成人病例和对照 (a) 以及活着的成人 CCS 与已故的成人 CCS (b) 之间的差异值。

表 5 CCS 和对照组之间绝对差异最大的 20 个保留的 DMR。



一部分淋巴瘤幸存者 ( n  = 8) 几乎肯定会主要接受放射治疗（因为他们在 1970 年前被诊断出来，然后才开始接受这种疾病的化疗）。它们在 DMR 中表现出类似的甲基化改变。这些个体中甲基化改变的程度通常较低，尽管这种差异没有统计学意义（补充表 9）。

成年儿童癌症幸存者的表观遗传衰老加速

为了研究暴露于癌症治疗是否与加速表观遗传衰老相关，我们使用皮肤-血液甲基化时钟评估了上述样本集。在接受治疗的儿童癌症患者（研究 1）中，没有加速衰老的证据，事实上，治疗结束时的样本表现出表观遗传年龄的减少（平均减少衰老 1.1 岁，配对t检验p  = 0.003 , 表 1 )。相比之下，与对照组相比，成年幸存者人群表现出明显的年龄加速（平均年龄加速 +5.5 岁（95% CI 4.32, 6.61, p FDR  < 0.001，补充表 10）。个体成人 CCS 的年龄加速和平均 DMR 变化之间没有显着相关性（r  = 0.31，p  = 0.09，表 2），并且 DMR 内的 CpG 位点与对照人群的年龄没有显着相关性（补充图 2）  3），表明这两种表观遗传变化的测量在很大程度上是独立的。
与皮肤-血液时钟相比，GrimAge 甲基化时钟（专门设计用于预测死亡风险）没有显示出任何显着的年龄加速。在成人 CCS 群体中观察到替代 DNA 甲基化生物标志物的显着差异（包括：更高的 ADM、B2M、胱抑素 C、瘦素、PAI1、TIMP1 和减少的端粒长度，补充表 10），并且在每种情况下，这些都在方向上改变以前与慢性病发展的可能性更高有关。

差异 DNA 甲基化和晚年健康结果

成人 CCS 表现出更高的二次癌症发病率和早期死亡率。与此一致，本研究中三分之一的成人 CCS 发展为第二原发性恶性肿瘤（10/32；31%），五分之一的人（7/32；22%）在相对年轻的年龄（中位年龄 48 岁，范围 23-63 岁，中位随访 15.8 年）。经历第二次恶性肿瘤或已经死亡的 CCS 在人口统计学上与其他幸存者没有差异（补充表 11）。第二种癌症与 DMR 甲基化或表观遗传年龄加速无关。然而，随访中死亡的参与者的平均 DMR 甲基化有更高的趋势（6.9% 对 5.1%），对单个 DMR 的分析确定了 DMR90（DUSP6）与死亡率显着相关，即使在多次测试校正后（p FDR < 0.001，图 3C和补充表 12）。此外，CCS 组的已故成员与幸存成员之间存在显着的年龄加速（8.8 岁，p  < 0.001），特别是对于 GrimAge 时钟（补充表 13）。这提供了初步的潜在证据，表明改变的 DNA 甲基化可以预测 CCS 人群中某些重要的健康结果。

讨论

儿童癌症患者在以后的生活中表现出不良健康后果的风险大大增加 。我们假设 DNA 甲基化的变化可能导致 CCS 中慢性疾病水平的增加。在这里，我们展示了抗癌治疗后儿童癌症患者的全基因组 DNA 甲基化显着改变。大多数 DMR 在诊断后 10-38 年的成人 CCS 中也很明显。这些变化在不同癌症类型和可能接受不同治疗（不同化疗方案和/或放疗）的患者中是一致的。虽然对样本用于研究 1 的患者的治疗存在一些重叠（例如，所有患者的治疗方案都包含拓扑异构酶抑制剂），与给予研究 2 中患者的治疗几乎没有重叠，其中包括可能仅接受放射治疗的患者子集。因此，已确定的 DMR 甲基化改变可能在很大程度上与治疗类型无关。然而，由于该研究的设计（或动力）并未确定与特定药物治疗相关的变化，因此不能排除这种治疗特异性甲基化变化的可能性。

与早期样本相比，儿童癌症患者（研究 1）在晚期没有显示出年龄加速的证据，但是，在成人 CCS 人群中年龄加速明显明显（研究 2）。由于 DMR 甲基化仅与加速的表观遗传衰老微弱相关，这表明 CCS 可能表现出两种不同的表观遗传异常。大量差异甲基化基因与治疗密切相关，然后长期保留（至少几十年），以及导致治疗后幸存者加速表观遗传衰老的 DNA 甲基化改变。我们目前的研究提供了初步证据，表明这些甲基化变化可能与随后的患者结果相关，但更大，最好是纵向的，暴露于不同疗法后 DNA 甲基化持续变化的一个潜在解释是，这些反映了对正常细胞亚群的选择，这些亚群更能在暴露于细胞毒性治疗/细胞应激下存活。与我们鉴定的 DMR 相关的一些基因先前已被描述为在暴露于化学疗法后甲基化发生改变。例如，我们之前已经确定，在成人和儿童 ALL 的缓解样本中，暴露于化学疗法会导致HOXA4基因座 DNA 甲基化水平升高，这里复制了一个发现。此外，我们已经证明，治疗慢性淋巴细胞白血病患者会导致选择白血病细胞中许多基因的甲基化改变，包括HOXA4的高甲基化。HOXA4 表达的恢复使 CLL 细胞对多种治疗剂重新敏感，从而确定了 HOXA4 在控制对具有不同作用机制的化学治疗剂的敏感性方面的直接作用。类似地，将正常细胞暴露于抗癌剂可能会选择出具有甲基化模式的细胞亚群，这些细胞亚群与对细胞损伤/应激的抵抗力增加相关，从而导致对不同细胞毒剂的响应相似的甲基化变化。

我们确定了一组在治疗后表现出一致变化的 DMR，尽管患者之间甲基化变化的绝对幅度不同。这项研究无法确定这种变异的根本原因，这可能反映了个体间的差异、不同的疗法或不同的肿瘤类型。在实体瘤与血液癌症中观察到甲基化改变的较大差异。然而，实体瘤也因首次采集样本的时间而异（实体瘤通常接近诊断，但血液系统恶性肿瘤缓解后）。此外，当分析被限制，事后，仅限于所有样本时，确定了初始样本的时间与甲基化变化的总体水平之间的相关性（数据未显示），这表明初始样本的时间可能是 DMR 处甲基化变化绝对大小的重要决定因素。但是，无论初始样本的时间如何，都可以看到同一组 DMR 的变化。

我们确定了与癌症相关的基因的差异甲基化，例如淋巴瘤（WNT6、TP73和CD37 ） 、白血病（MEIS1、HOXA4和HOXA5 ） 或神经母细胞瘤（TP73 ），以及与心血管疾病相关的基因（UCN、PRDM16、TCAP、ALOX5）。这可能表明治疗诱导的这些基因座内的 DNA 甲基化可能直接导致 CCS 中一些关键的危及生命的晚期健康影响，例如继发性恶性肿瘤或心血管疾病。未来的研究将需要直接评估已鉴定的甲基化变化对连锁基因表达的影响。由于甲基化变化在 2-13% 的范围内，单细胞水平的微调分析可能比检查对大块组织中基因表达的影响更有洞察力。此外，有必要对可能参与晚期健康影响的候选基因进行功能分析，以检查 DNA 甲基化改变与 CCS 疾病之间的潜在因果关系。

Lyon 等人首先提出了癌症治疗引起的甲基化变化可能影响长期健康的假设。然而，随后对该假设的实验测试受到限制。这是第一项检查化疗后甲基化急性变化的研究，以及同一位点的甲基化是否在成年癌症幸存者中也存在差异。少数先前的研究专门研究了幸存者群体中的 DNA 甲基化。这些主要集中在表观遗传衰老上，并且与本研究一致，已确定癌症幸存者的加速衰老 。Song 等人最近的一项研究。还进行了一项表观基因组关联研究 (EWAS)，以确定在给予特定治疗或治疗组合的患者中表现出差异甲基化的特定 CpG 位点。他们确定了 935 个与个体治疗相关的 CpG 位点和 224 个与药物组合暴露相关的 CpG 位点。两组位点都与本研究中确定的 CpG 位点表现出高度显着的重叠，尤其是与药物组合相关的那些位点（36/224, 16.1% 重叠，p  < 1 × 10 -50（Fisher 精确检验），所有差异在匹配的 CpG 位点朝同一方向改变），进一步表明这些甲基化变化是暴露于剧毒抗癌疗法的一致后果。

特别令人感兴趣的是在PRDM16基因中鉴定的 DMR 簇。除了与心血管疾病有关外，PRDM16 缺乏还与纤维化的发展有关，而纤维化与多种与年龄相关的慢性疾病有关，而PRDM16甲基化与肥胖有关。此外，PRDM16 已被确定为造血干细胞 (HSC) 的关键控制器，其作用是抑制 HSC 增殖。因此，该基因甲基化的改变可能与在接受治疗后需要重新填充造血区室有关，这需要下调 PRMD16 的表达。潜在地，与 PRDM16 表达下调相关的甲基化变化可能导致 PRDM16 表达降低的稳定和随之而来的长期组织功能障碍。

尽管该研究无法评估 DNA 甲基化变化与临床结果之间的关联，但结果提供了一些初步证据，表明甲基化改变的程度可能作为关键临床终点的标志物。平均 DMR 甲基化与寿命相关，并且在一个特定 DMR（在DUSP6基因座）处的甲基化具有统计学意义，即使在多次测试校正后也是如此。需要更大规模的研究来正确评估改变的 DNA 甲基化与 CCS 中增加的特定慢性疾病之间的联系。

这项研究的一个优势是多层方法，它利用了两个 CCS 数据集和表观遗传数据，还包括成人 CCS 的长期随访数据，以及生存和临床结果。与所有观察性流行病学研究一样，生活方式等无法测量的因素可能会造成残余混杂。检查儿童癌症等罕见疾病时的一个限制是样本量小。在这项研究中，研究 2 中包含的成人 CCS 的数量能够证实甲基化变化的复制，这非常清楚地检测到，但不足以评估 CCS 群体中改变的 DNA 甲基化与特定慢性健康状况。

本研究的局限性包括研究 1 中初始样本的异质性（肿瘤类型和疗法）和相对较小的样本量。该研究的目的不是确定以药物特异性方式诱导的甲基化变化，但是这些变化可能会在未来的研究中以更大的统计能力进行区分。由于儿童癌症患者通常采用复杂的多药剂方法进行治疗，我们现在正在研究使用小鼠模型来更直接地评估药物特异性甲基化变化。这也将有助于确定疾病本身是否会引起任何甲基化变化，而与治疗无关。同样，研究 2 和研究 1 中包含的癌症类型之间也没有重叠，用于治疗研究 2 参与者的原始癌症的特定抗癌疗法尚不清楚。虽然两项不同研究中重叠的甲基化差异强调了复制基因座的普遍适用性，但仍有可能一些未复制的 DMR 可能对研究 1 中的癌症治疗更具特异性。更大系列的未来研究将是有价值的识别与特定治疗方案和特定癌症类型相关的甲基化变化。这项研究的结果也可能受到其他可能影响表观基因组的环境因素的影响[ 一些未复制的 DMR 可能对研究 1 中的癌症治疗更具特异性。未来更大系列的研究对于确定与特定治疗方案和特定癌症类型相关的甲基化变化将是有价值的。这项研究的结果也可能受到其他可能影响表观基因组的环境因素的影响[ 一些未复制的 DMR 可能对研究 1 中的癌症治疗更具特异性。未来更大系列的研究对于确定与特定治疗方案和特定癌症类型相关的甲基化变化将是有价值的。这项研究的结果也可能受到其他可能影响表观基因组的环境因素的影响。然而，与癌症幸存者队列的非定向 EWAS 研究相比，在研究 1 中使用患者体内设计，然后专注于在研究 2 中复制这些特定的甲基化变化，将显着降低这种风险。我们还发现与特定环境因素（例如，衰老甲基化（补充图 3）或吸烟相关的甲基化变化之间没有显着重叠，其中我们发现本研究中确定的 DMR 与元数据中确定的 CpG 位点之间没有统计学上显着的重叠。 Joubert 等人的分析. 然而，我们不能完全忽视其他未测量的环境因素的影响。

这项研究的结果可能具有潜在的临床效用。一个关键发现是儿童癌症患者/幸存者之间甲基化变化的相似性，无论癌症类型、他们接受什么治疗或何时接受治疗。这表明在暴露于细胞毒剂后，许多儿童癌症患者可能存在一组共同的甲基化变化。因此，这些将广泛适用于评估儿童癌症患者的正常细胞毒性和潜在的长期健康影响。鉴于所有特定类型的儿童癌症都很罕见，这种对多种癌症类型的潜在适用性将是这些甲基化变化作为前瞻性临床标志物的显着优势。例如，如果确定的甲基化变化被证明可以预测特定的晚期健康影响，那么这些可以用于精准医学方法来识别高风险个体并指导后续护理。此外，由于可以在治疗期间测量 DMR 处甲基化的增加，这可能用于评估正在进行的儿童癌症患者试验，以评估新的治疗方案或剂量降级研究是否会导致较低水平的表观遗传损伤。

总体而言，这些研究结果表明，儿童癌症患者的抗癌治疗可能会引起一组一致的 DNA 甲基化变化，这些变化在很大程度上与肿瘤类型或特定治疗无关，这些变化保留在成人 CCS 中，并可能与不良健康结果相关。这些发现为在开发 CCS 风险预测工具时利用多种甲基化标记（DMR，组合或单独，以及表观遗传年龄加速）提供了重要的空间。