弥散张量束成像描绘大鼠胶质瘤皮质脊髓束的价值：相关...

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弥散张量束成像描绘大鼠胶质瘤皮质脊髓束的价值：相关组织学验证
背景

评估白质束损伤的程度对于胶质瘤患者的神经外科计划很重要。本研究的主要目的是使用扩散张量成像 (DTI) 评估胶质瘤大鼠皮质脊髓束 (CST) 的损伤等级。
方法
在肿瘤植入后第 10 天，共有 17 只大鼠接受了 7.0T MRI。获得肿瘤、瘤周和对侧区域的表观扩散系数（ADC）和分数各向异性（FA），以及瘤周的ADC比值（同侧ADC/对侧ADC）和rFA（相对FA=同侧FA/对侧FA）面积进行了测量。CST损伤分为三个等级，并通过弥散张量纤维束重建成像描绘。测量了肿瘤周围区域同侧和对侧 CST 的纤维密度指数 (FDi) 和 rFDi (相对 FDi = 同侧 FDi/对侧 FDi)。处死小鼠后，用苏木精-伊红和Ki67染色观察肿瘤和瘤周区胶质瘤细胞的侵袭情况和增殖细胞的比例。使用Spearman相关分析计算病理结果、CST损伤等级和DTI参数值之间的相关性。进行单因素方差分析，通过 rFA、rFDi 和 ADC 比率值比较不同的 CST 损伤等级。

结果

肿瘤细胞和增殖指数与CST损伤等级呈正相关（r =0.8857、0.9233、P<0.001）。肿瘤细胞与瘤周区rFA和rFDi值呈负相关（r = -0.8571, -0.5588），增殖指数与rFA和rFDi值呈负相关（r = -0.8571, -0.5588） ），而ADC比率与肿瘤细胞或增殖指数无关。CST损伤等级（1级和3级、2级和3级）的rFA值与1级和3级的rFDi值有显着差异（P < 0.05）。

结论

扩散张量成像可用于量化大鼠脑胶质瘤 CST 的损伤程度。我们的数据表明，这些定量参数可用于提高描述纤维束与恶性肿瘤之间关系的效率。

介绍

神经胶质瘤的特征是沿着白质中的纤维束侵入性生长。特别是，涉及纤维束的神经胶质瘤，例如皮质脊髓束 (CST)，可能由于纤维的破坏、移位或变形而导致神经功能缺损 。因此，描绘 CST 中不同的损伤程度应该为更好的神经系统治疗计划提供重要的附加信息。扩散张量成像 (DTI) 已被证明可以对纤维束的损伤进行分类，并用于定量分析 CST 的浸润程度。扩散张量纤维束成像 (DTT) 是一种无创工具，可用于通过将感兴趣区域 (ROI) 设置为纤维路径来可视化三个维度的主要白质束 。最近，纤维密度指数（FDi）值已被用来表示通过单位体积的束内的纤维密度，这可以为评估肿瘤边界区和瘤周区域提供有用的信息。一些作者  已经证明靠近脑肿瘤的白质的分数各向异性 (FA) 降低，而表观扩散系数 (ADC) 在脑肿瘤附近增加肿瘤核心和瘤周区域。显示瘤周区FA值较低，ADC值较高，说明FA和ADC值在瘤周水平受到影响。此外，肿瘤细胞的增殖和侵袭可能导致 CST 的破坏，损伤程度可能反映其生物学行为。

以往的研究表明，DTI可用于评估纤维束的损伤程度，DTI已用于患者的神经系统检查。然而，据我们所知，在 DTI 中被假设为定量参数的 rFA、rFDi 和 ADC 比率是否可用于评估 CST 中的损伤等级或与胶质瘤大鼠的病理结果相关成立。

因此，在本研究中，在瘤周区域白质的 ROI 中测量和评估了 rFA、rFDi 和 ADC 比率。此外，通过 DTT 重建和描绘不同程度的 CST 损伤。重要的是，在患有神经胶质瘤的大鼠中，通过根据肿瘤周围区域肿瘤细胞的侵袭和增殖来描述 DTI 参数，可以解决神经胶质瘤与 CST 损伤之间的相关性。

材料和方法

大鼠和胶质瘤细胞注射

使用经宁夏医科大学总医院动物护理委员会 (#2013-81260373) 批准的方案进行动物研究。本研究共使用了 17 只成年标准偏差 (SD) 大鼠（体重 200-250 克）。大鼠神经胶质瘤细胞 (C6) 在添加了 10% 胎牛血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中培养。在之前涉及大鼠胶质瘤模型的研究中，已经详细报道了用于在大鼠大脑中移植 C6 肿瘤的程序。总共使用了 17 只神经胶质瘤大鼠。对于植入，使用 0.5% 戊巴比妥钠（1 mL/kg，腹膜内）麻醉每只动物，并将 C6 细胞悬浮液（1 μL/min，10 μL）立体定向注射到皮层深度 5 mm 处。手术在无菌条件下进行。

核磁共振协议

所有成像均使用位于中国北京的国家纳米科学与技术中心的水平孔 BRUKER Biospec 70/20 Advance MRI 仪器（Bruker，Karlsruhe，Germany）在 7.0T 下进行。使用的射频线圈是表面线圈。使用 0.5% 戊巴比妥钠（1 mL/kg，腹膜内）麻醉大鼠，然后将其放入带有咬杆和耳杆的头部固定器中以固定头部。使用热水循环浴将体温保持在37.5°C。在细胞植入后 10 天进行 MRI 扫描。

以下 T2 加权成像参数用于获取图像：重复时间 (TR) = 2,000 ms，回波时间 (TE) = 20 ms，视野 (FOV) = 40 × 40 mm 2，切片厚度 = 1.0 mm ，采集矩阵 = 256 × 256，NEX = 2，翻转角 = 90°，切片数 = 20。以下 DTI 参数用于获取图像：TR = 5,000 ms，TE = 27 ms，FOV = 40 mm × 40 mm 2 , 切片厚度 = 1.0 mm, 采集矩阵 = 128 × 128, 翻转角度 = 90°, 切片数 = 20, 梯度数 = 25。图像采集后，将数据传输到 MATLAB 工作站进行分析。

投资回报率测量

FA、ADC 和 FDi 值是从两位有至少 7 年工作经验的经验丰富的神经放射科医生（Wang 博士和 Huang 博士）选择的 ROI 中测量的。在以下 ROI 中计算 FA、ADC 和 FDi 值，这些 ROI 均位于肿瘤的对侧和同侧：肿瘤和瘤周区域。为了提高测量的准确性，ROI 是根据每个区域的五个不同脑点选择的 。对侧和同侧瘤周区的 FA、ADC 和 FDi 值测量用于计算 ADC 比率（同侧 ADC/对侧 ADC）、rFA（相对 FA = 同侧 FA/对侧 FA）和 rFDi（相对 FDi = 同侧 FDi/对侧 FDi)。

CST 损伤等级

CST起源于运动皮层区域，然后穿过内囊后肢进入大脑脚。因此，CST 的 ROI 通常位于中央前回 (Brodmann 4) 和运动前皮层 (Brodmann 6) 区域 (ROI) 的皮层下白质、内囊后肢 (ROI) 或整个大脑花序梗 (ROI)。为了通过 DTT 软件的“与”操作分离 CST 的纤维，通过这些 ROI（两个或三个 ROI）的轨迹被认为是 CST 的组成部分。在 DTT 光纤跟踪期间，使用 TrackVis 软件包对 DTI 数据进行离线处理和分析，FA 值为 0.20。在我们的研究中，运动皮层区域（初始 ROI）和脑脚（目标 ROI）由两位经验丰富的神经放射科医师 (XDW, XYH) 选择。

本研究对 17 只荷胶质瘤大鼠的白质束按照移位、浸润和破坏的标准进行分类如下：（1）1 级：如果束相对于对侧半球的相应束显示出正常的各向异性信号，肿瘤移位和DTT成像描绘的一些瘤周水肿，则移位和水肿（图S1 ））。(2) 2 级：如果束显示出各向异性降低但保持完整无明显中断，则为浸润；(3) 3 级：如果各向异性明显降低，FA 图上无法识别该束，则中断，DTT 成像可观察到白质束中断。

动物试验

动物试验在 MRI 扫描前一天由两名观察者（H 博士和 S 博士）以不知情的方式进行。使用两项测试（由 Garcia 修改）来评估大鼠的运动功能，分数范围从 1（最低）到 6（最高）。 运动缺陷的分级量表（根据 Bederson 修改）分为两个等级（中度：3-6 分，重度：1-2 分）。

自发活动：在长 30 cm 的透明塑料立方体中观察大鼠 2 分钟。攀爬测试：将动物放置并攀爬金属丝网壁。握住大鼠的尾巴，将大鼠拉下，观察大鼠四肢的力量。

组织学和免疫组织化学

完成 MRI 实验后，在植入 10 天后处死大鼠，将大鼠的全脑从颅骨中取出，用苏木精-伊红 (H&E) 和 Ki67 染色。在高倍视野 (HPF) 的 H&E 染色切片中评估肿瘤周围区域细胞总数中胶质瘤侵袭细胞的比例，并根据每个区域的五个不同脑点选择测量区域。使用 Ki67 染色，我们评估了每个肿瘤周围区域的增殖细胞比例，并选择了五个不同的脑点 。分析组织学标本以确定与定量 MRI 测量值相对应的区域。将这些肿瘤细胞与使用 DTI 获得的数据进行比较。用于获得显微细胞计数的图是使用 Image-Pro Plus 软件包得出的。

统计分析

使用 GraphPad Prism 5 软件包和统计软件包 SPSS（第 21 版，SPSS）进行统计计算。如图所示，FA、ADC 和 FDi 数据表示为平均值 ± SD。采用配对样本t检验分析肿瘤与瘤周区、对侧正常区与瘤区、对侧正常区与瘤周区参数差异的显着性。一个 值小于 0.05 被认为表明存在显着差异。使用 Spearman 相关分析计算 CST 损伤等级与肿瘤细胞中 rFA 和 rFDi 之间的相关性。采用单因素方差分析比较不同CST损伤程度组的rFA和rFDi值。结果17只大鼠定量参数和CST损伤等级总结在肿瘤和瘤周区域以及对侧半球组织中测量 FA、ADC 和 FDi 的平均值 ± SD（表 S1和S3；图 1A - 1C）。瘤周区域的DTI分析和组织学结果见表S2。




图 1： FA、ADC 和 FDi 值的比较。不同脑区FA（A）、ADC（B）和FDi（C）值的比较以及DTI定量参数（rFA、rFDi和ADC比率）与瘤周组织学结果的相关性。（D，E），瘤周区肿瘤细胞、增殖指数与rFA、rFDi值呈负相关，ADC比值与肿瘤细胞、增殖指数无相关性。肿瘤细胞 (%) = 每个高倍视野中存在于肿瘤周围区域的神经胶质瘤侵袭细胞的密度；增殖指数（%）=每个瘤周区增殖细胞的比例；TA，肿瘤区域；PA，瘤周区域；反对，对侧。值是平均值±SD。n = 17。* P < 0.05，** P < 0.01 和 *** P< 0.001。肿瘤细胞和增殖指数与CST损伤等级呈正相关（r =0.8857、0.9233、P<0.001）。

肿瘤细胞与瘤周区rFA和rFDi值呈负相关（分别为r = -0.8571，-0.5588），增殖指数与rFA和rFDi值呈负相关（r = -0.8698， -0.5856），而 ADC 比率与肿瘤细胞或增殖指数无关（图 1D和1E）。

扩散张量成像分析和 CST 损伤等级

rFA 值在 CST 损伤等级（1 和 3、2 和 3）之间存在显着差异（P < 0.05）（图 2A）；rFDi值在等级（1和3）之间存在显着差异（P <0.05）（图2B），而其余CST损伤等级组的ADC比率（图2C）和rFA和rFDi值没有显着差异。



图 2： rFA、rFDi 和 ADC 比率的比较。瘤周区不同CST损伤等级的rFA(A)、rFDi(B)和ADC比值(C)比较。1级（黑色）、2级（红色）、3级（蓝色）；rFA = 同侧 FA/对侧 FA；rFDi = 同侧 FDi/对侧 FDi；ADC比=同侧ADC/对侧ADC；n = 17。* P < 0.05，并且 *** P < 0.001。

肿瘤周围区域的组织学和免疫组织化学

在 H&E 染色切片中评估肿瘤周围区域的肿瘤细胞，并在 17 只大鼠的不同 CST 损伤等级组之间进行比较。1 级（图 3A）在 40 倍放大镜下每个 HPF 的中值为 39%；2 级（图 3B）的中位数为 48%/HPF，3 级（图 3C）的中位数为 57%/HPF。CST 损伤等级组（1 和 2、1 和 3、2 和 3）之间的肿瘤细胞显着不同（图 3D）。



图 3：三个 CST 损伤等级在肿瘤周围区域显示出不同的浸润程度和生长速率。（A-C）H&E 切片用于评估肿瘤细胞在 40 倍放大倍率下每个高倍视野细胞总数中的百分比。(A) 1 级样本的中位肿瘤细胞分数为 39%。(B) 2 级样本的中位肿瘤细胞分数为 48%。(C) 3 级样本的中位肿瘤细胞分数为 57%。(D) 肿瘤周围不同 CST 损伤等级的肿瘤细胞比较。（E-G）Ki67 免疫组织化学染色在 40 倍放大下记录肿瘤周围区域的阳性分数。(E) 1 级样本的 Ki67 阳性细胞分数中位数为 16%。(F) 2 级样本的 Ki67 阳性细胞分数中位数为 24%。(G) 3 级样本的 Ki67 阳性细胞分数中位数为 44%。(H) 瘤周区不同CST损伤等级间增殖指数比较。（D，n = 17。* P < 0.05，** P < 0.01 和 *** P < 0.001。

采用Ki67免疫组化染色评估和比较不同CST损伤等级组的瘤周增殖指数。1级（图3E），40倍放大下Ki67阳性细胞比例为16%；2 级（图 3F）中位数为 24%，3 级（图 3G）中位数为 44%。增殖指数在各年级（1、3、2、3）之间存在显着差异（P <0.05），而其余组（1、2）无显着差异（图3H）。皮质脊髓纤维移位在 17 只荷有胶质瘤的大鼠中进行了 T2WI 和 DTI 扫描。在常规 T2WI 上，肿瘤在涉及右侧运动皮层的区域显示出不规则的混合信号（图 4A）。在 FA 图上，相对于对侧区域，在右半球观察到正常扩散各向异性信号（图 4B和4C）。在DTT中，起始点是运动皮层区，大脑脚是种子点。此外，3D 重建图显示，与左侧纤维相比，右侧 CST 因肿块病变向前外侧移位（图 4D）。



图 4：皮质脊髓束 (CST) 移位与 CST 损伤 2 级。（一种）。T2W 图像显示右侧运动皮层附近有混合信号的肿瘤。(B 和 C) 代表 FA 彩色成像和 FA 成像。与对侧半球相比，各向异性信号降低。绿色，前/后；蓝色，劣质/优质；和红色，右/左。(D) 具有代表性的 3D 重建 DTT 成像；与左侧纤维相比，右侧 CST 因占位病变（浅蓝色不规则实心形状）前外侧移位；右侧运动皮层（红色实心球），左侧正常解剖运动皮层（深蓝色球），右侧大脑脚（黄色球），左侧大脑脚（绿色球）；R = 右侧。

皮质脊髓纤维的破坏

如图5所示，使用3D重建DTT成像，相应的纤维束被肿瘤破坏。传统的 MRI 扫描在 T2W 成像上显示了一个大的低信号病变，涉及右侧运动区和皮层下区域（图 5A）。在FA彩色图上，与左半球相比，同侧半球的各向异性显着降低，因此无法追踪纤维（图5B）。图 5C在上视图中显示了没有目标和初始 ROI 的 DTT 重建的复杂纤维。与对侧半球相比，右侧的纤维受到肿瘤的破坏和影响（浅黄色区域）。绿色，前/后；蓝色，劣质/优质；和红色，右/左。DTT 图像的重建显示，与左半球的对侧纤维相比，右侧 CST 不再存在（图 5D）。



图 5：皮质脊髓束 (CST) 破坏与 CST 损伤 3 级。(A) T2W 图像显示右半球坏死的大肿瘤。(B) 具有代表性的 FA 彩色成像。各向异性显着降低。(C) 在上视图中没有目标和初始感兴趣区域 (ROI) 的代表性 DTT 重建复合纤维。绿色，前/后；蓝色，劣质/优质；和红色，右/左。(D) 具有代表性的 3D DTT 成像；在涉及肿瘤的右侧运动区域（浅黄色区域）内，相应的 CST 纤维不再存在于其正常解剖位置；右侧运动皮层（红色不规则区域），左侧运动皮层（浅蓝色区域），右侧大脑脚（黄色球体），左侧大脑脚（橙色球体）。R = 右侧。

讨论

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表征 CST 损伤等级和描绘纤维束的不同成分的目的是提供更准确的信息来描述恶性肿瘤和正常组织之间的空间关系。在我们的研究中，我们表明可以通过 DTT 重建成像来执行、可视化和区分 CST 的跟踪。DTT 可用于通过使用解剖结构在纤维路径上设置 ROI 来可视化主要白质束。在我们的研究中，我们验证了使用初始和目标 ROI 来描绘涉及大鼠弥漫性浸润性胶质瘤的 CST 的协议的有效性。更好地描述 CST 损伤等级可以为肿瘤切除评估提供重要的附加信息。尽管我们通过与组织学相比的 DTI 参数评估了纤维束，但我们建议进行实验以使用额外的染色来描绘白质。我们研究结果的进一步发展可以将这些应用的范围扩大到运动领域的限制之外，并增加动物模型的数量。结论总之，我们的结果表明，DTI 可以定量评估涉及大鼠脑胶质瘤的纤维束的损伤程度。我们的数据表明，这些定量参数可用于提高描述纤维束与肿瘤之间关系的效率。

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