SARS-CoV-2 的神经侵袭性、神经嗜性和神经毒力

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严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 感染已被证明与急性期和急性期后的一系列神经系统并发症有关。
SARS-CoV-2相关中枢神经系统疾病的发病机制复杂多样，不能用单一机制解释。
要了解 SARS-CoV-2 相关 CNS 疾病的发病机制，重要的是要更深入地了解 SARS-CoV-2 的神经侵袭性、神经嗜性和神经毒力。还必须考虑动力学，因为病毒感染不是静态事件。

相关的体内模型可用于研究 SARS-CoV-2 的神经侵袭性、神经嗜性和神经毒力，体外人多能干细胞 (hPSC) 模型可用于研究病毒的神经嗜性和相关的细胞反应。这些模型可进一步用于研究 SARS-CoV-2 变体之间的差异和治疗方法的设计。
严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 感染与急性期和急性期后的多种神经系统并发症有关。这些并发症的发病机制很复杂，取决于许多因素。为了在这个快速发展的研究领域中准确和一致地解释实验数据，必须一致地使用术语。在本文中，我们概述了神经侵袭性、神经嗜性和神经毒力之间的区别。此外，我们讨论了目前对这些独特特征的了解，这些特征是 SARS-CoV-2 相关神经系统并发症发病机制的基础。最后，我们简要讨论了不同实验模型的优点和局限性，以及如何进一步利用这些方法来推进该领域。

研究 SARS-CoV-2 相关中枢神经系统疾病发病机制不同方面的挑战
多种神经系统并发症与人类的 2019 年冠状病毒病 (COVID-19) 相关。这些神经系统并发症的范围尚不完全清楚，但很明显，很大一部分人在急性和/或急性期后会出现神经系统并发症。在急性期，这些并发症包括嗅觉丧失、脑血管事件、精神状态改变、周围神经病和脑病。尽管频率各不相同，但研究表明，多达 80% 的 COVID-19 住院患者在疾病急性期有神经系统表现。急性后阶段的神经系统症状属于与长期 COVID 相关的一系列并发症，不仅在中度至重度，而且在轻度自限性呼吸系统疾病（定义见）。几项研究表明，30-60% 的患者在发病 6 个月后仍会出现症状，包括神经和精神并发症，如颅内出血、帕金森症、认知障碍和睡眠障碍。长期 COVID 的日益流行，尤其是伴有神经系统症状的流行病的影响尚不清楚，但被认为会带来长期后果和重大的社会经济负担。
目前尚缺乏对 SARS-CoV-2 神经系统后遗症发病机制的全面了解，但鉴于这些并发症的范围，可能存在不止一种潜在机制。可能导致 SARS-CoV-2 相关中枢神经系统疾病发病机制的可能机制包括缺氧、免疫介导的损伤、凝血问题和病毒侵入中枢神经系统。。已经对 SARS-CoV-2 进入神经系统的倾向及其在 CNS 细胞中感染和复制的能力进行了广泛研究，有时发现似乎相互矛盾。然而，(i) 病毒感染不是静态事件，因为活跃病毒复制的解剖位置可能会随着时间而演变并最终消失；(ii) 感染的过程和严重程度因人而异；(iii) 中枢神经系统细胞类型高度多样化，包括许多不同的神经元亚群和非神经细胞类型，通常具有不同的细胞内在抗病毒免疫。
要了解病毒入侵和相关反应如何促成 SARS-CoV-2 相关中枢神经系统疾病的发病机制，区分神经侵袭性（见术语表）、神经嗜性和神经毒力非常重要. 不幸的是，这些术语在文献中的使用不一致，导致在研究中枢神经系统感染 SARS-CoV-2 的研究中得出的结论不明确。因此，我们强调应该正确使用这些定义，正如神经炎症领域的许多长期文献中所定义的那样，并在词汇表中进行了总结。在此背景下，我们讨论了当前对 SARS-CoV-2 感染发病机制的这些不同方面的了解。对于神经侵袭性和神经毒力，我们专注于人类和实验动物模型的体内发现，因为后者可以为 SARS-CoV-2 感染的时间动力学提供更详细的见解。体外讨论神经嗜性时包括研究。最后，我们讨论了可用于研究 SARS-CoV-2 的神经侵袭性、神经嗜性和神经毒力的不同体内和体外模型。
神经侵袭性神经侵袭性是指病毒进入 PNS 或 CNS 的能力。病毒可以通过周围神经和/或通过血行途径进入中枢神经系统（图 1）。SARS-CoV-2 可能通过支配呼吸道的颅神经 (CN) 的神经末梢进入中枢神经系统，然后将病毒通过轴突（顺行或逆行）运输到中枢神经系统。对于血行传播，病毒需要溢出到循环系统（病毒血症）并随后穿过血脑屏障（BBB）和/或血脑脊液屏障（B-CSFB）。

图 1严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 的可能神经侵袭途​​径。

框 1呼吸道病毒的神经侵袭性
神经系统并发症与许多呼吸道病毒感染有关，包括甲型流感病毒、肠道病毒 D68、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒和人类冠状病毒 [SARS-CoV-1、中东呼吸综合征 (MERS) 和人类冠状病毒 (HCoV) -229E、-OC43、-NL63 和 -HKU1] 。呼吸道病毒可以通过周围神经（包括支配呼吸道的 CN）或通过血行途径进入 CNS。对于冠状病毒（例如，HCoV-OC43 和 -229E，以及 SARS-CoV-1），有证据表明病毒优先通过嗅觉神经进入中枢神经系统。甲型流感病毒可以利用嗅觉神经和其他支配呼吸道的 CNs，例如三叉神经和迷走神经。肠道病毒-D68 被认为通过运动神经元中的跨轴突转运利用周围神经。
传播到中枢神经系统的血源性病毒可以通过不同的机制发生。例如，呼吸道合胞病毒和麻疹病毒可以感染血液白细胞，这些白细胞通过 BBB 进入 CNS（充当“特洛伊木马”）。在冠状病毒的情况下，也可能发生向大脑的血行传播。尽管尚未对此进行广泛研究，但已显示不同的冠状病毒株可感染骨髓细胞，并且已在血液中检测到无细胞病毒（病毒血症）。

人类呼吸道是 SARS-CoV-2 的主要复制位点，由几种 CNs 支配。鼻腔由三叉神经（CN V）和嗅神经（CN I）支配；由面部（CN VII）和舌咽（CN IX）神经组成的上呼吸道；迷走神经 (CN X) 下呼吸道。越来越多的证据表明 SARS-CoV-2 可以利用这些 CNs 进入 CNS。人类和实验动物模型的研究通过检测嗅黏膜中的支持细胞中的病毒 RNA 或病毒蛋白以及在较小程度上在嗅觉感觉神经元 (OSN) 中的病毒 RNA 或病毒蛋白，为病毒沿嗅觉神经入侵提供了证据（图 1） （在“嗜神经性”一节中更详细地讨论）。SARS-CoV-2 是在 OSN 中经轴突转运到中枢神经系统，还是通过沿嗅觉神经的嗅鞘细胞形成的通道扩散到中枢神经系统尚不清楚。在人类中已经提出通过三叉神经侵入中枢神经系统，因为在三叉神经节中检测到病毒 RNA，这表明病毒通过神经末梢传播到感觉神经元的胞体。。通过迷走神经纤维中的免疫组织化学检测 SARS-CoV-2 蛋白，提供了病毒通过迷走神经入侵人类的证据。据我们所知，尚未报道病毒通过舌咽或面神经入侵的证据。
SARS-CoV-2 能够传播到循环系统中，这可能导致随后的病毒通过 BBB 或 B-CSFB 传播到 CNS。在 COVID-19 患者中，SARS-CoV-2 病毒 RNA和病毒颗粒 已在血液或血清中检测到（分别称为 RNA 血症和病毒血症）。BBB 的各种功能之一是保护神经组织免受循环中的病原体的侵害。目前尚无关于 SARS-CoV-2 是否可以穿过 BBB 确凿证据，但在人类和动物研究的小血管内皮细胞中检测到了 SARS-CoV-2 抗原。此外，在小鼠和仓鼠感染 SARS-CoV-2 后，观察到 BBB 基底膜的体内损伤。并且，在体外BBB 模型中，SARS-CoV-2 可以穿过内皮细胞层 。这是否会导致病毒在体内扩散到脑实质中尚不清楚。一些研究表明 SARS-CoV-2 感染脉络丛上皮细胞，随后通过 B-CSFB 侵入中枢神经系统。总而言之，病毒通过 BBB 或 B-CSFB 侵入 CNS 的证据有限，但研究表明这种侵入可能发生，至少在一部分患者中。
病毒进入中枢神经系统的途径可能会影响疾病的表现。例如，一些研究表明与 SARS-CoV-2 感染有关的贝尔麻痹可能是病毒通过面神经侵入的结果; 沿嗅神经感染病毒可导致嗅觉丧失; 并通过病毒血症和/或脑微血管内皮细胞感染扩散到中枢神经系统可能导致脑出血。这些感染途径中的每一个是否与特定的疾病表现直接相关，需要更深入的研究。未来工作的一个主要目标是更深入地了解 SARS-CoV-2 入侵中枢神经系统的频率和途径，以及这些潜在的进入途径如何促成观察到的中枢神经系统表现的多样性。
神经性
嗜神经性是指病毒在神经系统细胞中感染和复制的能力。几份报告调查了 SARS-CoV-2 的细胞嗜性，包括检查其沿嗅觉神经的嗜性的研究。嗅黏膜包括 OSNs、支持细胞、基底细胞和鲍曼腺。在黏膜下层，OSN 的轴突束被嗅鞘细胞（具有雪旺样特性的神经胶质细胞）包裹，这些细胞形成穿过筛板到嗅球的隧道。SARS-CoV-2 抗原或 RNA 经常在 COVID-19 患者死后组织的支持细胞和鲍曼腺中检测到。，以及在实验接种的仓鼠、小鼠和雪貂中（图 1）。一些研究发现了在实验性接种仓鼠接种后早期 OSN 感染 SARS-CoV-2 的证据。或患有慢性嗅觉丧失的 COVID-19 患者 。然而，在其他研究中，未检测到 OSN 中的病毒抗原 。这些不一致是否与感染后时间的差异有关，或反映个体之间的病理生理异质性尚不完全清楚。
一旦进入中枢神经系统，病毒就会暴露于不同的细胞类型，包括各种神经元亚型、神经胶质谱系细胞（少突胶质细胞前体细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和室管膜细胞）、小胶质细胞、脉络丛细胞和神经血管细胞，包括血管内皮细胞和周细胞（图 2）。受体血管紧张素转换酶 2 (ACE-2) 在多个脑部位置表达，包括脉络丛和嗅球。表达 ACE2 的细胞类型包括兴奋性和抑制性神经元，以及一些非神经元细胞，如星形胶质细胞、少突胶质细胞和内皮细胞。在人类中，尸检显示一些患者的脑实质和皮层神经元中存在 SARS-CoV-2 抗原，而在黑质中检测到 SARS-CoV-2 病毒 RNA。此外，动物研究表明，多巴胺能神经元以及较小程度的皮层神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞对 SARS-CoV-2 感染敏感。人类多能干细胞 (hPSC) 衍生的 2D 培养物和 3D 类器官（模型在 ) 已被用于在体外研究 SARS-CoV-2 的细胞趋向性。总的来说，研究表明，不同的细胞类型，包括多巴胺能神经元、皮质神经元、脑微血管内皮细胞和脉络膜上皮细胞，都容易受到 SARS-CoV-2 感染，但是，在这些不同的细胞类型中，存在着差异。对 SARS-CoV-2 的允许性（即其产生子代病毒的能力）。对脉络丛类器官的研究表明，脉络膜上皮细胞允许感染 SARS-CoV-2。目前，据我们所知，尚无体内或体外证据表明 SARS-CoV-2 可有效感染神经祖细胞，一些研究提供了反对这种可能性的证据

图 2严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 的嗜神经性。
在人类和动物模型中，已在大脑内皮细胞中检测到 SARS-CoV-2 病毒或病毒抗原。来自不同器官的原代内皮细胞产生性感染的证据很少，体外研究表明，SARS-CoV-2 仅在 ACE2 人为过表达时才会感染内皮细胞。原则上，内皮细胞的流产感染（没有后续产生子代病毒的细胞感染） 或周细胞  可能会削弱 BBB，这可能使其更容易受到病毒入侵或导致微血管并发症。
大多数检查 SARS-CoV-2 感染 CNS 细胞类型的研究表明，感染仅限于细胞亚群，并且病毒复制通常效率低下甚至失败。尽管这种低效或无效的复制，感染可能与细胞功能和反应的变化有关。SARS-CoV-2 感染后细胞功能改变的机制之一涉及细胞衰老，这可能会影响受感染细胞和旁观者细胞。。
神经毒力
神经毒力表明病毒感染引起 CNS 病变的能力，独立于病毒侵入或感染 CNS 细胞的能力。有大量证据表明，SARS-CoV-2 感染可在急性期和急性期后引起各种神经病理学和神经精神症状。SARS-CoV-2 的神经毒性潜力不仅限于严重疾病病例，轻度或重度疾病患者可能会出现神经系统并发症。已经假设几种机制有助于 SARS-CoV-2 的神经毒力，包括病毒侵入中枢神经系统、失调的全身炎症反应、缺氧和自身免疫反应（图 3）。

图 3神经毒力。
SARS-CoV-2 的神经毒性潜力已在死后脑组织和体内动物模型中进行了检查，并通过 COVID-19 急性期和急性期后的放射学研究进行了检查。放射学研究提示形态学改变，尤其是嗅球（水肿和微出血），以及海马旁回、眶额外侧皮质和岛叶的灰质丢失 。
嗅觉丧失通常与 SARS-CoV-2 感染有关，至少与病毒的初始变体有关，但其潜在的病理学尚未完全了解。嗅觉功能障碍的潜在机制可能涉及嗅觉粘膜和嗅球中失调的免疫反应以及病毒引起的嗅道损伤的复杂且可能持久的相互作用。在仓鼠和小鼠中，有证据表明嗅黏膜的局灶性破坏与炎症细胞的流入有关。COVID-19 患者的尸检发现，部分患者的嗅黏膜出现局灶性萎缩和浸润 CD45 +白细胞、CD4 + T 细胞、CD8 + T 细胞和活化的巨噬细胞。
几项研究发现了 SARS-CoV-2 感染后中枢神经系统炎症的证据。在人类中，活化的小胶质细胞存在于嗅球、中脑（特别是黑质）、后脑、迷走神经背侧运动核和髓质的前 Bötzinger 复合体中。此外，在老年患者中报告了多灶性小胶质细胞增生症和星形胶质细胞增生症，尽管不能排除这些与宿主因素有关。据报道，在 COVID-19 患者和接种后 6 天鼻内接种小鼠的死后，CD8 +细胞毒性 T 细胞和巨噬细胞出现血管周围和实质浸润。无论 COVID-19 疾病的严重程度如何，死后都在患者大脑的白质和灰质中检测到广泛的炎症反应，例如星形胶质细胞增生、小胶质细胞活化和 T 细胞的血管周围箍缩，这一发现在颅髓质中最为明显oblongata 和嗅球 。此外，在大脑和小脑中观察到急性缺氧损伤的证据，大脑皮层、海马和小脑浦肯野细胞层中的神经元丢失。在呼吸道表达人类 ACE2 的小鼠中，SARS-CoV-2 感染会引发皮层下白质中的小胶质细胞活化和髓鞘减少，并损害海马中的神经发生。在仓鼠中，SARS-CoV-2 感染会触发嗅球中的小胶质细胞和 T 细胞活化。
在 COVID-19 住院患者中检测到中枢神经系统血管系统的神经血管损伤和病变。对死于 COVID-19 的患者的中枢神经系统进行尸检分析显示，内皮细胞基底层变薄，血管充血并伴有纤维蛋白原渗漏，提示微出血。对 COVID-19 患者和动物模型（包括仓鼠和 K18-hACE2 小鼠）的研究表明，SARS-CoV-2 感染脑血管内皮可导致内皮细胞死亡并在皮层形成弦状血管。此外，检测到 CD3 +、CD8 + T 细胞和巨噬细胞的血管周围浸润，以及肥大星形胶质细胞和活化小胶质细胞的存在。
SARS-CoV-2 的潜在神经毒性病理是多种多样的，并且似乎没有一种唯一的机制可以触发这些变化。此外，宿主因素，如性别和年龄，或潜在疾病，可能会使与 SARS-CoV-2 感染相关的多种中枢神经系统并发症的情况复杂化（见未决问题）。
研究 SARS-CoV-2 的神经侵袭性、神经嗜性和神经毒力的模型和技术
研究人类样本和人类死后组织的发病机制可以揭示与 SARS-CoV-2 感染相关的神经系统并发症的重要见解，尽管存在局限性。首先，在疾病发作后采集样本；因此，这种方法没有捕捉到感染的早期阶段。其次，顺序采样通常很困难，并且在大多数情况下（死后研究除外），只能从脑脊液或中枢神经系统外采集样本。最后，人类队列存在很大的异质性，包括年龄、性别、合并症和免疫状态的差异。补充人体、体内动物模型和体外研究hPSC 方法可以帮助阐明疾病急性期和急性期后的病理机制，以及病毒-宿主细胞相互作用的各个方面。然而，从动物数据或人类细胞建模数据推断人类临床情况存在局限性，应仔细考虑。
体内模型
已经建立了几种动物模型来研究体内SARS-CoV-2 感染的发病机制，包括小鼠、仓鼠以及在较小程度上的雪貂和非人类灵长类动物 (NHP) 模型。小鼠天生对 SARS-CoV-2 复制不敏感，但人 ACE2 的转基因表达或用腺病毒或表达人 ACE2 的腺相关病毒转导小鼠会使小鼠对 SARS-CoV-2 感染敏感。尽管这些模型中的组织和细胞 ACE2 表达与人类不同，但这些小鼠模型已被用于研究两种病毒复制的影响和炎症引起的变化 在大脑中。尽管这些观察结果不能直接外推到人类身上，但它们为了解可能导致 SARS-CoV-2 感染后出现大量神经系统并发症的不同机制提供了重要的见解。
用 SARS-CoV-2 对雪貂或 NHP 进行实验性接种通常只会导致轻微的呼吸道疾病，而 CNS 入侵的证据有限。然而，这些模型可以揭示轻度 SARS-CoV-2 感染急性期和急性期后中枢神经系统的变化。
仓鼠的实验性接种会导致更严重的呼吸系统疾病，在包括中枢神经系统在内的肺外组织中检测到病毒。对叙利亚仓鼠的研究检测到 CNS 中的病毒 RNA 以及神经血管系统的炎症和变化。尽管叙利亚仓鼠最常用于仓鼠研究，但最近表明，在 Roborovski 侏儒仓鼠、近交仓鼠、表达人 ACE2 的转基因仓鼠和肥胖仓鼠中，SARS-CoV-2 感染导致更严重的疾病和全身传播，包括病毒传播到中枢神经系统 。
不同的体内模型能够研究 SARS-CoV-2 在感染过程中的神经侵袭性、神经嗜性和神经毒力，包括疾病发作前和急性后期。我们认为，这些模型提供了一个独特的机会，可以以可控的方式研究病毒剂量、性别、年龄、肥胖以及其他风险因素和合并症对急性和急性后期发病机制的影响，这在人类。然而，体内模型之间的疾病进程存在差异，因此，为特定研究问题选择最合适的模型非常重要。
体外模型
基于 hPSC 的模型是研究 SARS-CoV-2 与 CNS 和 PNS 细胞之间相互作用的理想工具。这些模型，无论是 2D 还是 3D，都允许研究来自不同 CNS 区域的神经和非神经细胞，这些区域已知在其基因表达谱、功能和免疫状态方面表现出广泛的异质性。此外，hPSC 衍生的感觉神经元可用于解决以下问题：是否以及哪些感觉神经元亚型易受 SARS-Co-2 感染，以及它们是否促进跨轴突运输。由于其可扩展性，基于 hPSC 的模型特别适用于大规模化合物筛选和全基因组筛选，以剖析病毒与宿主的相互作用。
方法上的考虑
在研究不同细胞和/或组织中的 SARS-CoV-2 感染时，区分易感性或许可性很重要。易感性可以通过检测病毒抗原（使用免疫荧光或免疫组织化学）或检测病毒 RNA（使用原位杂交、qPCR 或 RNA-seq）来显示。当对来自体内模型的组织切片进行这些分析时，病毒抗原的位置可以直接与组织学病变相关联。尽管如此，这些化验需要使用适当的控制，例如同种型和遗漏阴性控制，并优先包含两种方法以确保真正检测到感染。理想情况下，许可是在体外确定的通过确定组织培养感染剂量 (TCID) 或噬菌斑形成单位 (PFU) 来检测感染性病毒随时间的增加。或者，体内病毒抗原或 RNA 的检测，以及组织学病变的位置和存在，通过电子显微镜检测病毒颗粒，或分离出传染性病毒，也提示病毒复制活跃。
结束语
目前可用的数据表明，SARS-CoV-2 具有神经侵袭潜力，它的神经嗜性是有限的，并且至少对一部分患者具有神经毒性。这与临床观察结果一致，SARS-CoV-2 相关中枢神经系统并发症的影响在急性期似乎有限，但在急性期后更为突出。存在急性期严重疾病（如脑炎）的报告，但与感染人数相比，这些情况很少见。然而，在急性后阶段患有 SARS-CoV-2 相关 CNS 损伤的患者比例可高达 30-60%，这是与长期 COVID 相关的广泛并发症的一部分。
在 SARS-CoV-2 感染的急性期和急性期后观察到的中枢神经系统并发症是多种多样的，这可能至少部分与宿主因素、合并症、宿主的免疫状态、病毒变异或其他变量有关。影响从 COVID-19 发展为严重疾病风险的宿主因素或合并症包括年龄、性别、代谢状态或先前存在的神经系统疾病。这些因素中的每一个是否影响中枢神经系统疾病的发展，如果是，如何影响，尚不完全清楚。此外，SARS-CoV-2 变体在神经侵袭性、神经嗜性或神经毒力方面的潜在差异仍有待进一步研究，尽管已经表明 SARS-CoV-2 变体在呼吸道疾病的发病机制上存在差异。未来可能出现的变体可能会增加问题的复杂性。此外，感染 SARS-CoV-2 后发生 CNS 疾病的风险可能在接种疫苗后或感染 SARS-CoV-2 之前发生变化。已经表明，接种疫苗可以部分预防长期 COVID 的发展 。其他可能影响 CNS 疾病发展的变量包括，例如，病毒的感染剂量和主要复制位点 。
随着 COVID-19 的急性和急性后疾病负担继续增加，迫切需要更好地了解影响疾病进程的所有因素的贡献以及它们如何导致 CNS 并发症（见未决问题）。关于导致 SARS-CoV-2 诱导的神经病理学的潜在机制仍有许多需要了解。体外和体内模型以及对患者的分析，可以揭示不同环境环境和宿主因素中 SARS-CoV-2 变体的神经侵袭性、神经嗜性和神经毒力的重要见解。