模拟牙髓坏死变色的拔牙变黑技术

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背景：使用变色牙齿需要测试美白产品，很难鉴于它们的稀缺性，获得它们。
目的：提出一种模拟牙髓坏死变色的拔牙体外变黑技术。
材料和方法：人血中的溶血物 I 和 II 接受或不接受激光照射（442 nm）1 小时。氧合血红蛋白浓度（O 2Hb) 通过紫外/可见光谱进行分析，并立即和 3 天和 40 天后通过透射光谱评估O 2 Hb 向高铁血红蛋白 (MetHb) 的转化。对于变暗评估，牛切牙分为两组（n = 25），它们的牙髓腔充满溶血液 II（HSII）和溶血液 II 溶液 + 激光（HSII+L）。在 37°C 下在人工唾液中储存 40 天后，通过色度计测量颜色变化，并将 ΔE 与 NBS 参数进行比较。使用混合线性模型（α=5%）分析数据。
结果： HSII+L呈现出最低的O 2 Hb和更高的MetHb。O 2的转化HSII+L 中的 Hb 与 MetHb 比 HSII 中高 42%。据国家统计局称，两组都有效地使牙齿变黑。从第 35 天开始变暗稳定。 HSII 促进了显着的色差。
结论：所提出的技术在体外模型中模拟坏死变色的拔牙变暗是有效的。

介绍

提取的人类牙齿已广泛用于世界各地的研究。在许多体外实验模型中，需要使用变色的牙齿来测试美白产品，而且由于它们的稀缺性，无论是从牙科诊所还是从牙库中都很难获得它们。替代方法是去除色素的牙齿并使用替代标本。

在 Freccia 和 Peters (1982) 提出的体外诱导牙齿变黑的经典模型中，将拔出的牙齿浸入含有最少血浆的血液中，用蒸馏水溶血，每天离心 3 天，重复此过程再过3天。这种方法经过了几次修改，例如完全去除血浆、盐溶液、其他溶血过程、离心方案的变化或血液中牙齿孵化的不同时期，从而导致或多或少的有效色素沉着时间。为了使体外方案更接近临床实践，一旦外伤前牙的牙齿变色通常与坏死的牙髓组织和牙髓腔出血有关，Van Der Burgt、Mullaney 和 Plasschaert (1986) 建议牙冠应该变暗从内到外，即将血液成分溶液（由含有 10% 血红蛋白的浓缩溶血液组成）引入牙髓腔。他们得出的结论是，使用这种方法可以在牙冠中产生可测量的颜色变化，但他们没有更具体地评估氧合血红蛋白 (O 2 Hb) 向高铁血红蛋白 (MetHb) 的转化及其在负责牙齿的氧化过程中的变化。变色。

缺乏研究证明哪种溶血溶液对产生 MetHb 最有效，以及能够导致 O 2 Hb 直接转化为 MetHb 的激光照射是否会加速牙齿变色。

本研究的目的是提出一种模拟牙髓坏死变色的拔牙体外变黑技术，评估该技术中使用的最佳溶血物。第一个无效假设是，通过在牙髓腔内应用溶血来使牙齿变黑的提议技术不能使牙齿变黑。第二个无效假设是溶血的血液暴露于激光照射不会在更短的时间内促进牙齿结构更强烈的变黑。

材料和方法用于体外牙齿变黑的血液

在开始研究之前，参与者提供了参与研究的知情书面同意，然后巴西巴拉那州马林加州立大学的人类研究研究伦理委员会的所有协议都获得了伦理批准（CAAE 14382313.9 .0000.0104）。

在对无血红蛋白病 (HbAA) 和无贫血 (Hb 总 12.9 g/dL) 的健康成年女性志愿者进行静脉穿刺后，将全血样本收集在乙二胺四乙酸 (EDTA) 管中。该溶液是用 EDTA 从全血中获得的，离心并去除血浆，然后加入双蒸水以促进溶血（溶血液 I，HSI）并额外离心 20 分钟以确保所有红细胞破裂（溶血液 II，HSII）。

使用 pH 8.5 的 Buffer tris (Merck, Darmstadt, Germany)和 BC-300 PLUS-Mindray 血液分析仪 (Mindray, Nanshan,深圳），分别。在 37°C 下处理全血以获得 HSI 和 HSII，并将其等分试样 (4 mL) 进行 70 瓦 He-Cd 激光激发 (IK5651 RG, Kimmon Koha CO. LTD, Japan)，波长为 442 nm 1 小时，每 15 分钟进行一次均质化（图 1）。在 HSI 中进行额外的离心可以在没有血浆的情况下获得 HSII，从而产生更浓缩的溶液并使红细胞的裂解更容易。所有样品，即全血、浓缩红细胞、HSI 和 HSII，无论是否使用激光，都在采集后立即进行分析，在采集后 3 天和 40 天进行分析，并在 4°C 的冰川中储存。

图 1人血实验室处理流程图，显示用于实验的样本。

氧合血红蛋白浓度分析

O 2 Hb 相对于 MetHb 的浓度在全血样本、浓缩红细胞、HSI 和 HSII 中测定，有和没有激光应用，在 4°C 下储存，在三个时间点，使用三次重复。所提出的技术基于用 60 mol L-1 磷酸盐缓冲液（Merck，Darmstadt，Germany）稳定血红蛋白，通过分光光度法在两种波长下进行评估，一种用于 MetHb（630 nm），另一种用于 O 2 Hb（540 nm） . 使用两个试管（标记为 A 和 B）进行分析。将 100 µL 待测样品的等分试样放入管 A 中，然后放入 6 mL 60 mol L-1 磷酸盐缓冲液。管 B 接收 300 μL 的管 A 溶液，然后是 3 mL 的 60 mol L-1 磷酸盐缓冲液。使用 SP-2000UV（Biosystems，圣保罗）分光光度计，在 A 管中在 630 nm 处和 B 管中在 540 nm 处进行分光光度计读数。O 2 Hb (%)的浓度由下式得出：

(1)

笔记。[A]：吸光度值；系数 10; 在 B 管中进行稀释（来自 A 管的 300 µL 和 3 mL 磷酸盐缓冲液），以获得 540 nm 氧合血红蛋白分光光度读数的技术灵敏度。

回归模型使用广义最小二乘法估计，允许每个处理中观察值的残差方差不同。图形分析显示残差的随机性和无差异，表明模型的良好拟合/适应性。

成分吸收剂分析

使用 Lambda 1050 UV/Vis/Nir Perkin Elmer 分光光度计（Perkin Elmer，W​​althan，MA，USA）在采集后立即和采集后 40 天的实验室血液处理的所有阶段的样本中分析组分吸收剂（发色团）。将等分的血液样本 (50 µL) 插入两个石英载玻片之间，从而减少穿过样本的光路。由于样品浓度高，采用此程序。所有样品均在室温下同样制备。使用两张空白石英载玻片作为背景，记录从 200 到 800 nm 的透射光谱。

为了分析随时间变化的激光作用，新收集的 HSII 的等分试样也通过相同的技术制备，并经受蓝色激光辐射 (442 nm) 6 小时，每小时进行分光光度分析。

使用 SciDavis 软件分析获得的光谱。O 2 Hb (541 nm 和 577 nm) 和 MetHb (635 nm) 的吸收带被识别和分析为时间的函数。

牙齿的选择、制备和体外变黑

使用了由受监管和认证的屠宰场捐赠的 50 颗上中牛门牙。使用的动物来自同一群，以确保它们的年龄相似并且牙齿钙化的阶段相似。用刮匙清洁牙齿，并使用放大镜（4x，Bio-Art，São Carlos，São Paulo，Brazil）仔细检查牙齿是否有裂纹和断裂，如果存在，将导致样本从样本中排除.

在水冷的切割机（Isomet 1000，Buehler，Lake Bluff，Illinois）中使用金刚石圆盘在牙根的颈部三分之一处进行横截面，不考虑中间三分之一和顶端三分之一，用于插入溶液样品（HSII 和 HSII + 激光，每组 n = 25）直到牙髓腔完全充满并且牙齿被人工变黑。Maxxion R ®玻璃离子水门汀 (FGM, Joinville, Santa Catarina, Brazil) 用于牙釉质接合处的密封，将牙齿浸入单个烧瓶中的人工唾液中，并在 37°C 下保存 40 天，培养基每 24 小时更换一次。

颜色评估

VITA Easyshade ® Advance 分光光度计（VITA Zahnfabrik H. Rauter GmbH & Co. KG, Bad Sackingen, Baden-Wuerttemberg, Germany）用于体外变黑牙齿的颜色读数，由 CIELab 系统测量 – L *（亮度） 、a *（红-绿轴）和 b *（黄-蓝轴），由国际照明委员会中央局推荐（1986 年）。从人工唾液中取出牙齿，用吸水纸轻轻擦干，然后放置在单独的硅胶导板上（图 2）。该指南在表冠的中间三分之一处有一个孔，可以完美地安装在设备上，从而实现读取区域的标准化，并防止可能的光反射和干扰颜色读取。颜色读数一式三份，每 5 天至 40 天一次，并使用平均值。ΔE 颜色变化由 Hunter 的公式确定，并根据国家标准局 (NBS) ΔE * ab 分布和类别分析产生的颜色变化，如下所示：

图 2用于在颜色测量期间标准化分光光度计点位置的单个硅导板。（一）硅导用于标准测色局部。( B ) 标准化待读取样品（位于硅基体内部）和分光光度计之间位置的组件。

1 0.0 到 0.5 – 非常轻微的变化；

2 0.5 到 1.5 – 轻微变化；

3 1.5 到 3.0 – 显着变化；

4 3.0 到 6.0 – 显着变化；

5 6.0 到 12.0 – 非常显着的变化；和

6 12.0 或更高——更改为另一种颜色。

颜色评价的统计分析

样本量是使用 R 软件的 sjstats 库中的 samples_mixed 函数估计的，考虑到 85% 的检验功效、5% 的显着性水平和由广义 eta 平方 ges = 0.409。

考虑到本研究的主要目标是验证组和时间之间的响应变量是否存在差异，因此采用混合线性模型，结合观察之间的依赖性，即每个观察单位固有的可变性的影响（齿），产生更健壮和高效的模型。

该方法试图考虑对我们习惯于在线性模型中找到的响应变量的固定影响，它还通过随机效应对协方差结构进行建模，在这种情况下，每颗牙齿的固有变异性对测量值的依赖性时间。因此，该方法考虑了实验单元内/之间的可变性。

所有模型都在 R 应用程序中使用 lme4 命令进行了调整。

结果

表 1显示了在实验室处理血液样本的每个阶段（使用和不使用激光）在不同时间点通过 UV/VIS 光谱法测得的 O 2 Hb 浓度。结果表明 T3 (p = 0.001) 和 T40 (p = 0.002) 与 T0 不同，因为浓缩红细胞和全血处理不同于对照 - HSII + 激光 (p = 0.001)。全血 (p < 0.001) 和浓缩红细胞 (p < 0.001) 治疗之间随时间的相互作用也很显着，即这些治疗导致的 O 2 Hb 浓度随时间的变化与其他治疗不同。例如，在 T40，O 2与其他治疗不同（线性回归、广义最小二乘法），全血中 Hb 浓度显着增加，而浓缩红细胞浓度降低。

表 1不同实验室处理阶段的血样中 O 2 Hb 浓度的UV/VIS 光谱评估，有和没有激光照射 1 小时，在不同时期

图 3A显示了 HSII 溶液在暴露于激光辐照的不同时期通过透射光谱获得的吸收光谱。在没有激光照射的样品的代表性光谱中，条带中心位于 577 nm、541 nm、415 nm、348 nm 和 278 nm，分别代表 β-O 2 Hb、α-O 2 Hb 、Soret 带、珠蛋白-血红素相互作用和血液的氨基酸/生色团。 Soret 带是光谱学中常用的术语，指的是血红蛋白 (Hb) 的血红素基团的吸收。随着暴露于激光的时间增加，Soret 带从 ~415 nm 位移到 ~407 nm，O 2的强度降低Hb 带和 MetHb 带的存在集中在 ~498 nm 和 ~630 nm。图 3B显示了在暴露于激光期间 O 2 Hb 向 MetHb 的转化，并且在 2 小时后观察到最高转化率。在较长时期内，转化趋于稳定。图 3C显示了 40 天后，在有和没有激光照射的情况下，HSII 溶液中存在 MetHb。激光辐照样品中 MetHb 谱带的曲线下面积比未辐照样品高 42%。

图 3 ( A ) 溶血液 II 溶液样品在不同激光照射时间的吸收光谱。虚线箭头表示 Soret 带的位移，其他箭头表示与氧合血红蛋白 (O 2 Hb) 和高铁血红蛋白 (MetHb) 相关的带的中心。( B ) O 2 Hb (541 nm 和 577 nm) 和 MetHb (635 nm) 的吸收带强度与激光曝光时间的关系。实线是视觉指南，t=0 表示样品在激光曝光之前的结果。( C ) 采集后立即 1 小时和 40 天后溶血液 II 溶液中 MetHb 的吸收光谱，有和没有激光应用。

表 2显示了 CIELab 系统在使用和不使用激光曝光的情况下使用 HSII 变黑的牙齿与其初始颜色相比的平均值和标准偏差。根据 NBS 分类，与牙齿的自然颜色相比，还显示了由此产生的颜色差异 (ΔEab)。

表 2使用 CIELab 系统使用溶血液 II 溶液和不使用激光照射 1 小时评估自然和变黑的牙齿颜色 (n = 25)，以及根据 NBS 参数获得的色差

使用混合线性模型对变量“天”和“组”的分析显示，第 35 天和第 40 天之间牙齿变黑没有统计学上的显着差异，也就是说，变黑似乎从第 35 天开始稳定下来，与组无关（图 4）。然而，当我们使用 NBS 作为参考分析变暗时，我们观察到，从第 10 天开始，两组都达到了极其显着的颜色变化 (NBS 5) 或颜色变化 (NBS 6) -表 2。

图 4使用和未使用激光应用的溶血液 II 溶液使牙齿变黑的 ΔEab 表示。

在混合线性模型中，组*天交互不显着（p > 0.05），即结果表明两种测试技术（HSII和HSII+L）在牙齿变黑方面没有显着差异。然而，随着时间的推移，变暗有显着差异（p < 0.001），即存在时间效应，但在 HSII 和 HSII+L 组之间没有差异。

讨论

第一个无效假设被拒绝，因为提出的通过在牙髓腔内应用溶血来使牙齿变黑的技术促进了牙齿变黑。

选择 HSII 用于牙齿变黑并被证明优于 HSI，一旦实验室血液处理阶段证明该溶血溶液具有较高的 O 2 Hb 浓度，这表明正在形成大量 MetHb 并转化为血红素和 Fe+++ ，按比例增加O 2 Hb 的浓度。实验数据支持 HSII 的选择，并允许提出一种作用机制。使用分光光度计和颜色变化计算的定量分析证明了所获得的颜色变化的有效性。

在 HSII+L 组中通过 UV/VIS 分光光度法测量的 O 2 Hb 显示该溶液与未裂解样品之间的百分比在统计学上显着降低（表 1）。由于 O 2 Hb 和 MetHb之间存在反比关系，  HSII+L 组中的 MetHb 浓度会更高。众所周知，MetHb 浓度的增加会使血液的颜色从红色变为棕色，并最终降解红细胞内的 MetHb。MetHb 的积累可导致半色素的形成，这些在变性时可释放血红素部分和 Fe +3原子。这种金属可以作为芬顿和哈伯-韦斯反应中生物分子氧化反应的催化剂，产生高反应性羟基 (OH - ) 自由基，负责蛋白质变性和脂质过氧化。

进行了长达 6 小时的激光暴露时间变化实验（图 3A），以验证其对没有牙齿的 HSII 样品的直接影响，考虑到极端条件，即最小样品体积和最大入射面积，因此将大部分样品暴露于入射辐射。在没有激光曝光的情况下获得的吸收光谱与之前描述的相似。可以观察到对应于珠蛋白-血红素相互作用、血液氨基酸/生色团以及 O 2 Hb、α-O 2 Hb 和 β-O 2 Hb 的血红素基团的条带。激光照射引起O 2的直接转化Hb 到 MetHb，如 Tomoda、Tsuji、Yoneyama 所述，他们引用了使用氧化剂进行这种转化的中间过程，并指出了一些与本研究中获得的光谱变化不同的光谱变化。激光通过分解分子、促进氧化和促进自由基的产生来加速生物过程，并且由于它们对流变因素的影响，自由基可以与 O 2 Hb 相互作用并产生 MetHb。

在存在 MetHb 的情况下，O 2 Hb 到 MetHb 的最大转化率发生在激光入射 2 小时后，此后趋于稳定（图 3B）。因此，考虑到该过程已经开始，因此应用了激光照射一小时。这通过在激光照射和不照射激光 40 天后的 HSII 光谱分析得到证实（图 3C），这表明激光照射后 MetHb 波段的曲线下面积比未照射样品的大 42%。在这个过程中，没有观察到半色素的形成，其特征在于以 540 nm 和 575 nm 为中心的带从 α-O 2 Hb 和 β-O 2位移Hb 分别为 535 nm 和 565 nm。

在牙髓腔内使用 HSII，提供由内而外的变黑是合理的，因为众所周知，临床上对牙齿变黑的需求主要是由于创伤，其中血管破裂导致牙髓出血腔室伴随着红细胞的扩散，随后发生溶血。释放的 Hb 与腐烂的牙髓组织和细菌产生的硫酸氢盐结合，产生硫化亚铁 (FeS)，这是一种负责色素沉着的黑色化合物，它会渗透到牙本质小管中。

与 Van Der Burgt、Mullaney 和 Plasschaert 在他们的研究中所做的相反，在本研究中，牙髓没有通过进入口根除以遵循尽可能接近临床实际的方案。牙髓组织的存在可能导致牙齿进一步变色。

第二个无效假设被接受，因为溶血的血液暴露于激光照射并没有在更短的时间内促进牙齿结构更强烈的变黑。

混合线性模型表明两组（HSII 和 HSII+L）在牙齿变黑或比较随时间变化时没有显着差异（p < 0.001）。然而，观察到牙齿变黑的显着差异（p < 0.001），即存在时间效应，但在 HSII 和 HSII+L 组之间没有差异。因此，仅评估变量“天数”的混合线性模型使我们能够观察到第 35 天和第 40 天之间牙齿变黑没有统计学上的显着差异，也就是说，变黑从第 35 天开始稳定，与组无关。然而，当使用 NBS 作为参考分析变暗时，从第 10 天开始，两组都达到了极其显着的颜色变化 (NBS 5) 或颜色变化 (NBS 6)。

体外牙齿变黑的经典模型建议将拔出的牙齿浸入含有最少血浆的血液中，通过蒸馏水溶血和每日离心制成。此程序仅分解红细胞。在本研究中，按照 Van Der Burgt Mullaney 和 Plasschaert 的建议，将溶血液注入牙髓腔。其他研究建议进行修改，包括完全去除血浆、在将牙齿浸入血液之前向牙齿添加硫化铁、添加其他溶液的其他溶血过程、与天数相关的离心方案的变化或不同牙齿浸入血液的时间，但这些方法都没有接近临床现实（坏死）。文献中没有研究描述接近由坏死引起的变色的牙齿变黑方法，这是本研究中提出的方法的创新要素。

提出的用于使拔出的牙齿变黑的技术包括将 HSII 放置在牙髓腔中。该溶液是用EDTA从全血中获得的，离心，去除血浆，然后加入双蒸水以促进溶血，再离心20分钟以确保所有红细胞均已破裂。进入髓腔的通道用玻璃离子水门汀密封，牙齿应在 37°C 下浸入人工唾液中 35 天，每 24 小时更换一次培养基。

然而，在本研究中，暴露于激光照射一小时的 HSII 具有最低的 O 2 Hb 浓度，因此，最高的 MetHb 浓度，它并没有促进吸收光谱的显着变化，表明 HSII 的特性得以保持。O 2 Hb 向 MetHb 的转化在激光应用后 1 小时内开始，在 2 小时达到最大速率，此后趋于稳定。然而，根据 NBS 参数，考虑到两种溶血剂都有效，激光应用并没有促进牙齿结构更快变黑，这可以从另一种颜色的变化中得到证明。

这项研究的一个限制是使用牛牙来测试变黑技术。获得声音提取的人类门牙非常困难，无论是在牙科诊所还是在牙库中，因为它们的发生率很低。

尽管 Wang et al 2021 最近的一项研究观察到，鉴于牙釉质微结构的接近，牛牙可以用作牙科研究中人类牙齿的绝佳替代品，但这些牙齿的尺寸远大于人类门牙的尺寸，因此，他们需要更多的溶血来填充牙髓腔，这可能会影响牙齿变黑的时间。

由于所提出方法的牙齿色素沉着具有自然类似于牙​​齿坏死的潜力，因此该方法可用于未来的研究，以与体外漂白治疗进行比较。

结论

溶血血液的激光应用不会促进牙齿结构更快变黑。经证实，无论是否使用激光，冠状动脉内牙齿变黑对体外牙齿变黑都是有效的，从第 35 天开始模拟牙髓坏死引起的变色。