溃疡性结肠炎肠道微生物群的动态变化：动物模型的初步...

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溃疡性结肠炎肠道微生物群的动态变化：动物模型的初步研究背景：
动物模型DSS诱导的UC已广泛应用于基础研究，肠道菌群失调是DSS诱导UC的重要发病机制之一，但其动态变化及与炎症因子的相关性尚不清楚。
方法：
将不同浓度DSS诱导的C57BL/6溃疡性结肠炎小鼠模型的临床体征和组织损伤程度与正常小鼠进行比较，最终确定DSS的最佳浓度。然后我们分析了肠道微生物组和炎症因子的测序结果，以确定肠道微生物组的动态模式及其与炎症因子的相关性。
结果：
2.5%和3.0%浓度的DSS可引起肠道损伤并诱发结肠炎。然而，3.0% DSS 导致更高的死亡率。此外，DSS诱导的UC模型中肠道菌群存在动态变化：肠道菌群的相对丰度在拟杆菌属、副拟杆菌属、Romboutsia、Clostridium_sensu_stricto_1、Lachnospiraceae_NK4A136_group、norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014、Parasutterella，在乳酸杆菌、Muribaculum、norank_f_Muribaculaceae、双歧杆菌、Coriobacteriaceae_UCG-002和Enterorhabdus中先下降后上升前 14 天没有变化，但在第 21 天显着增加。此外，炎性细胞因子与 UC 小鼠肠道菌群失衡密切相关：UC 动物模型肠道中的大多数病原菌与促炎因子与抗炎因子呈负相关，而有益菌则相反。
结论：
肠道微生态在DSS诱导的UC模型中发挥重要作用，肠道菌群相对丰度在溃疡性结肠炎的发生发展过程中发生动态变化。

介绍溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性、非特异性复发性疾病，以黏膜及黏膜下层持续性、弥漫性炎症为特征，以腹泻、间歇性便血或脓液为主要临床表现，并伴有腹痛、乏力、食欲不振、发热等全身症状。病程长，不自愈。UC患者经常反复发作，许多需要终生治疗，这严重降低了生活质量。因此，UC已被世界卫生组织列为现代疑难病。由于饮食改变和压力增加，UC 病例数迅速上升，中国大陆总患病率约为 116/100,000，8同时，发病率也在增加。研究还表明，UC 会显着增加患结直肠癌的风险，这令人不安。风险随着患者 UC 病程的延长而增加。在 UC 病程为 10、20 或 30 年的患者中，结肠癌患者的百分比分别为 1.6%、8.3% 和 18.4%，这是目前主要的公共卫生挑战。一些研究人员认为，UC 是一种复杂的全身性疾病，与多种致病因素密切相关，如肠道菌群不稳定、免疫失衡， 15、16遗传易感性， 17、18和不良生活方式。然而，迄今为止，该病的病因和发病机制尚未完全阐明。因此，需要更多的基础研究来回答上述问题。
选择和建立成熟、稳定、可靠的动物模型是开展UC相关发病机制和药效学的各种基础研究和临床前研究的前提和基础。目前，UC建模方法有很多，可以概括为化学、免疫学、基因修饰和复合。不同建模方法的原理各不相同。没有一种动物模型可以完全涵盖人类UC的所有病因和临床表现，不同的模型具有更多的研究意义和归属。
目前，由于免疫学、基因修饰等建模方法技术性强、操作难度大、成本高、适应性低等问题，很多模型仅用于特定研究，而未广泛应用于基础研究。化学感应建模以其成本低、简单、稳定、可控性高等优点成为研究人员首选的建模方法。化学诱导法主要有葡聚糖硫酸钠（DSS）模型、2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）模型、恶唑酮（OXZ）模型、乙酸模型、牛角叉菜胶模型、二硝基氯苯（DNCB）模型. TNBS 和醋酸型号更接近人类克罗恩病 (CD) 的临床症状，但不能充分模拟人类 UC 的临床症状。DNCB模式是自愈型，使用豚鼠和家兔，饲养成本相对较高。叉胶、OXZ 和 DSS 模型可以更好地展示人类 UC 的病理症状，并且由于成本低、简单、稳定和可靠。其中，DSS 模型由于与人类 UC 的病理和临床表现非常相似，已成为国内外研究 UC 的首选建模方法。
DSS 模型最初是由日本学者 Okayasu 和其他研究人员创建和报告的。 DSS进入肠道作用于结肠上皮，减少粘蛋白量，破坏紧密连接的蛋白质结构，破坏肠道微生态平衡，改变肠道微生物组的组成。该模型可广泛用于研究 UC 发病机制及相关药物疗效，包括 UC 先天免疫、多信号通路相互作用和长期肠炎诱发结肠癌相关机制的研究。该模型还可用于研究 UC 研究中的肠道微生物组。
在梳理和分析现有文献后，我们发现大量研究诱导了2.5%或更高浓度DSS的UC动物模型，并开展了肠道微生物组和免疫炎症的相关基础研究。其他研究发现，DSS 诱导的 UC 模型肠道中一些细菌（拟杆菌属、norank_f_Muribaculaceae、Turicibacter、Romboutsia 、Clostridium_sensu_stricto_1）的相对丰度发生了显着变化。此外，改变的细菌可能引发相关炎症因子水平的变化。然而，目前还没有关于使用 DSS 模型时肠道菌群的动态变化或不同浓度 DSS 对肠道菌群和免疫炎症的影响的报道。大多数研究都没有考虑到这个因素，这可能导致了不同的实验结果。该课题组此前的实验研究发现，高浓度的DSS可以显着增加小鼠的死亡率。因此，在本实验中，我们使用 2.5% 和 3.0% DSS 诱导 UC 模型，通过测量 UC 诱导的小鼠模型中肠道微生物组的动态变化以及血清和局部组织中炎性细胞因子的水平来探索肠道微生物组的动态作用。通过不同浓度的 DSS，目的是提高我们对 UC 病因和发病机制的理解。
材料和方法
试剂和仪器
使用了以下试剂和仪器：DSS（分子量 = 36 kDa 至 50 kDa；MP Biomedical，California，USA）和酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒：白介素-2（IL-2）、白介素-4（ IL-4)、白细胞介素 6 (IL-6)、白细胞介素 10 (IL-10)、白细胞介素 22 (IL-22)、干扰素-γ (IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α) ), 5-羟色胺 (5-HT) (Neobioscience Technology Company, Shanghai, China)。
动物分组和干预
24只无病原体健康雄性C57BL/6N小鼠（6周龄，20±2g）购自北京威通利华实验动物科技有限公司（许可证号：SCXK（北京）2016-0006）并维持山东中医药大学动物实验中心（许可证号：SYXK（Lu）2017-0022，山东，中国）。所有小鼠都保持在特定的无病原体条件下，在恒定温度 (23±1.5°C) 和湿度 (60±10%) 下随意接受标准食物和无菌水，光照/黑暗循环为 12 小时/12 小时. 在研究开始前，让小鼠适应一周。动物按体重（攻击前）随机分为三组：对照组、模型2.5组和模型3.0组；每组包含10只小鼠。模型 2.5 和模型 3 中的小鼠。图 1）。动物护理和所有实验均按照山东中医药大学动物护理与使用委员会 (SDUTCM20210311003) 批准的程序进行。所有方案均严格按照中华人民共和国科学技术部制定的《实验动物护理和使用指导意见》执行，尽一切努力减少动物痛苦和减少受害动物的数量。使用的动物。


图 1 DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠的实验方案。

生物数据和样本
采集从实验的第一天到最后一天，每天对所有小鼠称重，每天记录它们的体重、一般情况和死亡情况。在实验的第 0、7、14 和 21 天收集粪便样本并储存在 -80°C 下进行 16S 测序，并记录体重、粪便状态和便血状态。根据公式DAI=A+B+C计算疾病活动指数（DAI）评分，其中A、B和C分别为表1中的体重减轻评分、粪便状态评分和便血评分。


表 1 UC 小鼠疾病活动指数 (DAI) 评分标准

安乐死后，首先去眼球采血，3000rpm离心15min，得到血清，-80℃保存用于检测炎性细胞因子。然后，从小鼠解剖脾脏、肝脏、肾脏和结肠并称重，并测量结肠长度。最后，结肠被分成代表近端、中间和远端段的段。近端和远端段固定在含有 4% 多聚甲醛溶液的管中用于组织学评估，中结肠储存在 -80°C 用于检测炎性细胞因子。
组织学评价
结肠的近端和远端部分包埋在石蜡中，切成 5 µm 的部分，并根据标准方案用苏木精和伊红 (H&E) 染色。切片在显微镜下可视化，并使用 Leica Application Suite/Leica DM5000B 以 200 倍的最终放大倍数拍照和观察。
基于四个变量进行组织学评分：炎症细胞浸润、病变深度、隐窝破坏和病变宽度。总病理学评分表示为所有参数的评分之和。病理学评分由两名病理学家根据表2中的结肠组织病理学评分标准以双盲方式独立评估。不一致的结果由第三位经验丰富的病理学家裁定。


表 2 UC 小鼠组织病理学评分标准

ELISA分析细胞因子表达
血清中炎性细胞因子 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-22、5-HT 和 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-结肠组织匀浆中的 22, 5-HT, TNF-α, IFN-γ 通过购买于江苏精美生物科技有限公司（中国江苏）的商业 ELISA 试剂盒进行检测。使用酶标记仪器（Labsystems Multiskan，Finland）在 450 nm 处测定吸光度。所有实验均根据制造商的说明进行。
肠道微生物组的 Illumina MiSeq 焦磷酸测序
中肠道微生物组检测的标准程序。使用 EZNA ®从粪便样本中提取微生物 DNA土壤 DNA 试剂盒 (Omega Biotek, Norcross, GA, USA) 根据制造商的方案。通过 NanoDrop 2000 紫外可见分光光度计（Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）测定最终 DNA 浓度和纯化水平，并通过 1% 琼脂糖凝胶电泳检查 DNA 质量。通过热循环仪 PCR 系统 (GeneAmp 9700, ABI, USA) 用引物 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') 和 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 扩增细菌 16S rRNA 基因的 V3-V4 高变区. 使用以下程序进行 PCR：95°C 变性 3 分钟，95°C 30 秒，55°C 退火 30 秒，72°C 延伸 45 秒，共 27 个循环，最后72°C 延伸 10 分钟。PCR 在含有 4 μL 5×FastPfu 缓冲液、2 μL 2 的 20 μL 混合物中一式三份进行。5 mM dNTP、每种引物 0.8 μL (5 μM)、0.4 μL FastPfu 聚合酶和 10 ng 模板 DNA。将所得 PCR 产物从 2% 琼脂糖凝胶中提取，使用 AxyPrep DNA 凝胶提取试剂盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进一步纯化，并根据制造商的方案使用 QuantiFluor™-ST（Promega，USA）进行定量.
根据 Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd（中国上海）的标准方案，将纯化的扩增子以等摩尔量汇集并在 Illumina MiSeq 平台（Illumina，San Diego，USA）上进行配对末端测序（2×300）。
原始 fastq 文件被多路分解，由 Trimmomatic 进行质量过滤，并由 FLASH 合并，具有以下标准：（i）在 50 bp 滑动窗口上接收平均质量分数 <20 的任何站点截断读数。(ii) 引物完全匹配，允许 2 个核苷酸错配，并去除包含不明确碱基的读数。(iii) 重叠长度超过 10 bp 的序列根据重叠序列进行合并。
使用 UPARSE以 97% 的相似性截止值对操作分类单元 (OTU) 进行聚类，并使用 UCHIME 识别和删除嵌合序列。每个 16S rRNA 基因序列的分类通过 RDP 分类器算法  针对 16S SILVA 数据库 (Silva 138, Bremen, Germany) 使用 70% 的置信度阈值进行分析。
统计分析
实验数据由 GraphPad Prism 9.0 分析并表示为平均值±SD。使用单向方差分析测试分析统计差异，并使用 GraphPad Prism 9.0 和 R 统计编程语言绘制图表。*, # p <0.05的p值被认为是统计学上显着的差异，而**, ## p <0.01被认为是非常显着的差异。
结果
不同组动物的一般评估
对照组小鼠精神状态良好，身体敏捷，大便正常，毛发有光泽，整个研究过程中体型良好。与对照组相比，模型组小鼠精神萎靡，活动少、嗜睡、疲倦，尤其是模型3.0组。实验期间4只小鼠死亡，模型2.5组1只，模型3.0组3只，而对照组未观察到死亡（图2A）。死亡事件发生在第11-13天，死亡小鼠的平均体重明显低于同期其他小鼠。


图 2 DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠的一般情况。( A ) 每天监测小鼠存活率。( B ) 每天测量一次小鼠的体重。( C ) DAI评分是通过测量体重变化、大便和大便潜血的临床评分来计算的。图表表示为平均值±SD。*, # p <0.05, **, ## p <0.01。*控制和模型 2.5。#控制和模型 3.0。

如图2B所示，从第4天开始，模型组的小鼠表现出体重减轻。模型2.5组在实验第10天减重最多，而模型3.0组在第11天减重最多。模型组体重曲线在第19天达到平台期，模型组小鼠，尤其是模型组小鼠3.0 组的体重明显低于对照组（在模型 2.5 和 3.0 组中分别减少了初始体重的 2.4% 和 5.3%）。DSS干预后，模型组DAI评分显着升高，且始终显着高于对照组（p <0.05），而两个模型组之间差异无统计学意义（图2C ））。模型组小鼠出现严重腹泻，尤其是3.0模型组，DSS治疗5天后出现粘液脓血便。
这些结果表明，2.5% 和 3.0% 的 DSS 均可减轻小鼠体重、增加 DAI 指数并引起 UC 症状。同时，3.0% DSS诱发的疾病症状更为严重。
组织病理学变化
组织病理学分析是诊断 UC 的金标准方法。结肠组织病理学改变的结果如图3所示。模型小鼠组可见隐窝破坏、杯状细胞丢失和炎性细胞浸润，部分病灶区出现严重水肿、出血、溃疡。此外，模型3.0组疾病病理更为严重。小鼠结肠近端和远端节段的组织病理学评分如图 3 所示。模型组近端和远端结肠组织病理学评分均显着高于对照组（p <0.05），3.0%组更高（p<0.01)。此外，我们发现两个模型组的病理评分也存在统计学差异，其中3.0%组显着高于2.5%组（p <0.05）。



图3近端和远端结肠切片结肠组织H&E染色，通过光学显微镜获得组织学图像。测量炎症细胞浸润、病变深度、隐窝破坏、病变宽度和隐窝损伤的组织病理学评分。图表表示为平均值±SD。* p <0.05，# p <0.01。*控制和模型 2.5。#控制和模型 3.0。
综上所述，DSS明显对近端和远端结肠组织造成严重损伤，且3.0% DSS造成的损伤程度比2.5% DSS更差。换言之，DSS-UC模型局部组织的病理损伤程度与DSS浓度呈正相关。

ELISA的结果如图4所示。与对照组相比，两个模型组血清中IL-4、5-HT和结肠中TNF-α、IFN-γ、5-HT的表达水平显着升高（p<0.05），而结肠IL-2、IL-6、IL-10和血清IL-6的表达水平似乎发生了变化，但变化无统计学意义。模型3.0组小鼠血清IL-10、IL-22、结肠IL-22表达降低，血清IL-2表达升高（p <0.05），而模型2.5组变化不显着不同的。在这里，我们发现了一个有趣的现象，即模型 2.5 和 3.0 组血清中 IL-4 含量的表达明显高于对照组（p<0.05)，而在结肠中观察到不同的情况，只有模型3.0组的IL-4浓度显着降低( p<0.05)。


图 4在 DSS 诱导的溃疡性结肠炎中通过 ELISA 测量炎性细胞因子的水平。( A ) 小鼠血清中炎症细胞因子如 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-22 或 5-HT 的水平。( B )小鼠结肠炎性细胞因子如IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-22、TNF-α、IFN-γ或5-HT的水平。图表表示为平均值±SD。* p <0.05，** p <0.01 和 *** p <0.001。

在上述结果中，我们发现DSS增加了血清中IL-2、IL-4、5-HT和结肠组织中TNF-α和IFN-γ的水平，降低了血清和结肠中IL-22的水平。 . 同时，不同浓度的DSS对上述炎性细胞因子的作用也不同。
肠道微生物组组成的变化
对 16S rRNA 基因中 V3 和 V4 区域的 Illumina 测序产生了每个 OTU 中的序列数量，这些序列被计数以获得不同时期存活小鼠的所有粪便样本的 OTU 分类信息，相似度为 97%。对所有 80 个微生物组样本进行二次采样，得到 2,162,480 个序列读数，以进行 OTU 多样性分析。这些读数包括 686 个 OTU，属于 10 个门、15 个纲、35 个目、59 个科、126 个属和 215 个种。所有样本的稀疏曲线均出现平坦化（图5A），说明测序数据量足够大，足以反映各个样本中细菌多样性的真实水平，测序数据量合理（图5B ））。共有 181 个 OTU，被分配到 68 个属，由所有组共享。模型 2.5 和 3.0 组的 OTU 数量分别在实验的第 7 天和第 14 天有不同程度的下降，而在第 21 天出现了一定程度的恢复（图 5C）。


图 5 DSS 改变了 UC 模型小鼠肠道微生物组的结构。( A ) Rarefaction/Shannon 曲线表明测序数据量大到足以反映细菌多样性的真实水平。( B ) 泛核分析表明测序数据量合理。( C )维恩图(OTU和属)分析说明DSS可以降低细菌群落的丰富度。( D) β-多样性分析说明不同组的肠道微生物组组成在不同时间点不同。

主成分分析 (PCA)、主坐标分析 (PCoA) 和非度量多维标度 (NMDS) 图分析显示样本按组聚类。聚类结果如图5D所示表明所有 12 个单独的组都清楚地聚集成簇。事实上，我们发现结果表明，没有 DSS 干预的样本（对照组在 0、7、14 和 21 天，模型 2.5 和 3.0 组在 0 天）聚集成一个簇。同时，模型 2.5 和 3.0 组的样本在实验的第 7 天聚集成一个簇，在一个单独的象限中与其他组相距甚远。此外，仅在 PCoA 和 NMDS 分析中，模型 2.5 和 3.0 组的样本分别在实验的第 14 天和第 21 天收集。14 天的样本集群也被隔离在一个象限中，远离其他组。21 天样本集群接近没有 DSS 干预的组，但有明显的界限。
通过以上实验结果，然后，我们在四个不同时间点对所有组的样本中每个属和门的平均相对丰度进行了深入分析。在实验之前（第 0 天），在属和门水平上没有观察到相对丰度的显着差异。与对照组相比，DSS处理后（实验第7天）模型2.5和3.0组在门和属水平上的许多分类群的相对丰度变化趋势相同且变化显着。在门水平（图6A），厚壁菌门（p<0.01）、变形菌门（p <0.05）显着增加；然而，拟杆菌门 ( p <0.01) 和 Patescibacteria ( p<0.05) 显着降低。在属水平上，10个属的丰度发生显着变化（图6B）：拟杆菌属（p <0.05）、毛螺菌科_NK4A136_group（p <0.01）、Turicibacter（p <0.01）、Clostridium_sensu_stricto_1（p <0.01）、Eubacterium_fissicatena_group（p <0.05 ） )、大肠菌群( p <0.05)、副杆菌属( p <0.05)和副杆菌属( p <0.05)显着增加；然而，norank_f_Muribaculaceae ( p <0.01)，乳酸杆菌（p <0.01）和Muribaculum（p <0.01）大大减少。否则，蓝藻（p<0.05）、未分类的_f_毛螺菌科（ p <0.05）和大肠杆菌-志贺氏菌（p <0.05）的丰度变化仅在模型3.0组中显着增加。同时，norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014 ( p <0.05) 和Romboutsia ( p <0.01) 仅在模型 2.5 组中显着增加。


图 6差异肠道微生物组结果。( A和B ) 分析小鼠肠道菌群在不同时间点在门( A )和属( B )水平上的差异属。图表表示为平均值±SD。*, # p <0.05, **, ## p <0.01。*控制和模型 2.5。#控制和模型 3.0。

到第 14 天，模型 2.5 和 3.0 组中以下微生物类群的丰度发生了显着变化：在门水平（图 6A），Patescibacteria（p <0.05）和蓝细菌（p <0.05）显着减少。或者，变形菌门（p <0.05）仅在模型3.0组显着增加，而拟杆菌门（p <0.01）仅在模型2.5组显着减少。此外，在属水平（图 6B），Romboutsia ( p <0.05) 增加，而 norank_f_Muribaculaceae ( p <0.01)、norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014 ( p <0.05) 和Alistipes ( p <0.05) 和Colidextribacter ( p <0.05) 下降。此外，仅在模型3.0组中，拟杆菌属( p <0.01)、大肠杆菌( p<0.05)和副拟杆菌属(p<0.05)显着增加，而Muribaculum(p < 0.05 )显着减少。
到第21天，模型组中只有3个细菌类群与对照组有显着差异（图6）：放线菌门（p <0.01）和巴氏杆菌门（p <0.05）在门水平上分别增加和减少；除此之外，在属水平双歧杆菌（p <0.01）有所增加。除此之外，norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014 ( p <0.05)、Prevotellaceae_UCG-001 ( p <0.01)的丰度变化显着降低，而Romboutsia ( p <0.05)、Clostridium_sensu_stricto_1 ( p<0.05)、 Coriobacteriaceae_UCG-002 ( p<0.01) 和 Rikenellaceae_RC9_gut_group ( p <0.05) 仅在模型 3.0 组中增加。同时，Enterorhabdus ( p <0.05) 和 Eubacterium_fissicatena_group ( p <0.01) 显着增加，而Alloprevotella ( p <0.05) 仅在模型2.5组减少。
通过分析各组各物种在不同时期的相对丰度，结果表明，在不同浓度的DSS干预后7、14、21天，对照组部分物种的相对丰度存在统计学差异，无论是在门属水平。但在不同的干预日，细菌种类也存在差异，具有统计学差异。
此外，我们还对不同时间点不同组样本中微生物类群在属和门水平的平均相对丰度进行了分析（图 S1）。我们发现，两个模型组，在门级和22个菌群（norank_f_Muribaculaceae，三个菌群（Actinobacteriota，Patescibacteria和蓝藻）的相对丰度乳杆菌，类杆菌，Lachnospiraceae_NK4A136_group，norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014，Parasutterella，Clostridium_sensu_stricto_1，Muribaculum，Enterorhabdus， Eubacterium_fissicatena_group和大肠杆菌) 在属水平上随时间发生显着变化。同时，门水平的两个菌群（Firmicutes和Bacteroidota）和属水平的五个菌群（Prevotellaceae_UCG-001、双歧杆菌、Romboutsia、Alloprevotella和Parabacteroides）仅在模型2.5组中发生显着变化。同时，门水平的变形菌和属水平的两个菌群（大肠杆菌-志贺氏菌和大肠杆菌_UCG-002）仅在模型3.0组中发生显着变化。
通过分析不同组别在不同DSS干预时期的相对丰度，结果表明DSS干预和药物浓度均对小鼠肠道菌群丰度有较大影响。此外，与 3.0% DSS 相比，2.5% DSS 对肠道微生物组丰度的影响更大。
属与细胞因子的相关性分析
为进一步探讨小鼠肠道微生物组丰度与炎症因子的关系，采用Spearman秩相关检验分析上述不同细菌与炎症因子的相关性（图7及补充表1）。根据分析结果，我们发现UC小鼠中显着的炎症因子与丰富的物种有关。例如，在血清水平上，IL-2与拟杆菌属正相关（r = 0.47，p=0.034），IL-4与拟杆菌属（r=0.65，p =0.002）、Clostridium_sensu_stricto_1（r =0.73，p =0.0002)、Parasutterella ( r=0.46, p =0.04) 和Romboutsia ( r =0.67, p =0.001)，与Alloprevotella ( r =−0.47, p =0.037)、Muribaculum ( r =−0.54, p=0.013) 和 norank_f__Muribaculaceae ( r =−0.49, p =0.028)。此外，IL-10 与Colidextribacter ( r =0.53, p =0.017) 和 norank_f__Muribaculaceae ( r =0.46, p=0.04）并且与Romboutsia负相关（r =-0.51，p =0.023）。此外，IL-22与Prevotellaceae_UCG-001呈正相关（r =0.53，p =0.016），与双歧杆菌负相关（r =-0.51，p =0.02），Clostridium_sensu_stricto_1（r =-0.48，p =0.031）， Coriobacteriaceae_UCG-002 ( r =−0.61, p =0.005), Enterorhabdus( r =−0.57, p =0.009), Parasutterella ( r =−0.56, p=0.0098) 和Romboutsia ( r =−0.53, p =0.017)。5-HT与Coriobacteriaceae_UCG-002 ( r =0.51, p =0.021)、肠杆菌属( r =0.52, p =0.018)、Parasutterella ( r =0.63, p =0.003)和Romboutsia ( r =0.55, p = 0.012)，与Alloprevotella ( r =−0.58, p =0.008), norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014 ( r=−0.64, p=0.003) 和普雷沃菌科_UCG-001 ( r =−0.51, p =0.023)。有趣的是，在结肠水平，IL-4 与 Clostridium_sensu_stricto_1 ( r =-0.50, p =0.026) 和 Coriobacteriaceae_UCG-002 ( r =-0.45, p =0.045) 呈负相关，IL-6 与 Lachnospiraceae_NK4A136_group ( r =0.59，p =0.006）并且与乳酸菌呈负相关（r =-0.48，p =0.032）。IL-22 与 Lachnospiraceae_NK4A136_group ( r =0.52, p =0.018)、norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014 (r =0.49, p =0.027) 和 Prevotellaceae_UCG-001 ( r =0.53, p =0.015)，而与Parasutterella ( r =-0.50, p =0.025) 和Romboutsia ( r =-0.58, p=0.008) 呈负相关。或者，5-HT 与双歧杆菌( r =0.64, p =0.002)、Clostridium_sensu_stricto_1 ( r =0.57, p =0.009)、Coriobacteriaceae_UCG-002 ( r =0.57, p =0.009)、肠杆菌属( r =0.48,p =0.031)、Parasutterella ( r =0.45, p =0.048) 和Romboutsia ( r =0.48, p =0.03)，并且与 Prevotellaceae_UCG-001 呈负相关 ( r =−0.53, p =0.017)。TNF-α与双歧杆菌（r=0.48，p =0.033）、Clostridium_sensu_stricto_1（r =0.48，p =0.033）、Coriobacteriaceae_UCG-002（r =0.51，p=0.021）、Parasutterella（r =0.58，p = 0.007) 和Romboutsia ( r =0.53, p =0.017)，与 norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014 ( r =-0.55, p =0.012) 和 Prevotellaceae_UCG-001 ( r =-0.50, p =0.024) 呈负相关。此外，IFN-γ 与拟杆菌属( r =0.82, p =0.00001)、Clostridium_sensu_stricto_1 ( r =0.60, p =0.005)、Coriobacteriaceae_UCG-002 ( r =0.49, p =0.028)、Eubacterium_fissicatena_group ( r =0.51, p =0.023),副拟杆菌属( r=0.58, p =0.008)、Parasutterella ( r =0.53, p =0.016)、Rikenellaceae_RC9_gut_group ( r =0.53, p =0.016) 和Romboutsia ( r =0.69, p =0.001)，与Alloprevotella ( r =− 0.57, p =0.009), norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014 ( r=−0.52, p =0.018) 和普雷沃菌科_UCG-001 ( r =−0.57, p=0.008）。总之，这些结果表明炎症细胞因子与 UC 小鼠肠道微生物组的失衡密切相关。


图 7 UC 小鼠肠道菌群与炎性细胞因子相关性分析的热图。Spearman 等级相关系数使用颜色梯度表示：红色表示正相关；绿色表示负相关，* p <0.05，** p <0.01。

讨论
肠道微生物组和炎性细胞因子在 DSS 诱导的小鼠 UC 进展中起关键作用。DSS结肠炎模型由于其快速、简单、重现性和可控性优于其他各种化学诱导实验模型，已广泛应用于诱导性溃疡性结肠炎模型的基础研究。文献研究表明，DSS 诱导的 UC 小鼠肠道微生态失衡，肠道微生物多样性和结构异常，炎症因子水平发生改变。但鲜有研究探讨DSS-UC模型中肠道菌群的动态变化，菌群在疾病发生发展中的变化趋势和机制尚不清楚。因此，我们的研究分析了小鼠不同时间点肠道微生物组的丰度，以及炎症因子与肠道菌群的相关性，以探索DSS-UC的发病机制。
通过分析实验小鼠体重减轻、腹泻、死亡率、DAI指数变化、组织病理学分级、炎症因子水平和肠道微生物相对丰度，我们发现，在我们的实验环境中，DSS诱导的溃疡性结肠炎可能是通过干预肠道微生态平衡和小鼠体内的炎症因子，引起肠道损伤。同时，随着时间的推移，实验14天后小鼠的症状逐渐缓解，说明DSS-UC小鼠模型具有一定的自愈能力。这一结果与另一项研究一致。此外，实验结果表明，2.5%和3.0% DSS浓度诱发的UC严重程度不同。
DSS-UC小鼠的临床表现与浓度高度相关：较高的浓度通常导致更严重的临床疾病表现。与模型2.5组相比，3.0组小鼠临床表现严重，诊断时表现更严重，死亡率更高。因此，考虑到动物伦理和实验成本，我们更喜欢在与我们相同的实验条件下使用 2.5% DSS 进行诱导建模。
文献检索表明肠道菌群在溃疡性结肠炎的发病机制中起主要作用。然而，肠道微生物组如何在 DSS 诱导的小鼠 UC 中动态变化仍不清楚。通过本实验发现，小鼠UC模型建立后，拟杆菌属、副拟杆菌属、Romboutsia、梭菌属_sensu_stricto_1、毛螺菌科_NK4A136_group、norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014、Parasutterella的肠道菌群相对丰度先增加后减少，然后再增加。此外，在乳酸杆菌、Muribaculum、norank_f_Muribaculaceae双歧杆菌、 Coriobacteriaceae_UCG-002 和Enterorhabdus在前 14 天没有变化，但在第 21 天显着增加。
以前的研究人员表明，UC中乳酸杆菌的丰度降低，这与我们的研究结果一致。乳酸杆菌是一种厌氧益生菌，可在肠道内合成氨基酸和维生素。可通过诱导调节性T细胞（Treg）分化改善肠黏膜屏障完整性，降低促炎细胞因子水平，抑制病原菌繁殖，抑制内毒素产生，恢复肠道免疫系统平衡，缓解溃疡性结肠炎的发作。因此，我们推测乳酸杆菌的相对丰度第14天恢复到正常水平，这可能是由于DSS炎症反馈型诱导的乳酸杆菌增加所致。此外，研究发现乳酸杆菌与促炎因子 IL-6 呈负相关，可在炎症早期引发炎症风暴，然后逐渐减少，这也解释了促炎因子之间没有显着差异的原因。实验第21天的IL-6和对照组。
此外，第7天拟杆菌属的相对丰度显着高于对照组，随后下降，但仍高于对照组。拟杆菌属是哺乳动物肠道内共生的革兰氏阴性专有厌氧菌，具有调节机体免疫和维持内环境稳态的作用。它在急性和慢性 UC 动物模型中的相对丰度可显着增加，以改善 Th1/Th2 免疫失衡，从而保护肠道组织。然而，其他研究发现拟杆菌属可加重 UC 中的肠道损伤，但目前还没有确定的结论，需要进一步研究。
双歧杆菌是一种常见的革兰氏阳性厌氧有益菌，其相对丰度的稳定性对于维持正常的肠道功能和身体健康至关重要。研究表明，UC 中双歧杆菌数量减少，肠道中双歧杆菌数量增加可缓解 UC。然而，本研究表明双歧杆菌的相对丰度在 14 天内没有变化，但在 21 天内显着增加。Yang 等认为双歧杆菌仅存在于对照组小鼠的肠道中。因此，我们可以合理地推断动物模型的肠道损伤在实验21天后已经明显恢复，说明DSS诱导的UC模型具有一定的自愈能力，与文献一致。这一结果也解释了微生物群落的相对丰度在后来的实验中部分恢复了。如Clostridium_sensu_stricto_1、Lachnospiraceae_NK4A136_group、norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014和Parasutterella呈先增加后减少的变化趋势，而Lactobacillus、Muribaculum和norank_f_Muribaculaceae则呈先减少后增加的趋势，21天对照组间差异无统计学意义。
Clostridium_sensu_stricto_1 在 UC 的发展中发挥了重要作用。目前的结果与之前的研究结果一致，即 Clostridium_sensu_stricto_1 的相对丰度在动物模型中显着增加。此外，我们还发现 Clostridium_sensu_stricto_1 与血清中的 IL-4、结肠中的 5-HT、TNF-α 和 IFN-γ 呈正相关。研究表明，UC中的IL-4可诱导单核细胞和嗜酸性粒细胞参与炎症反应，刺激肥大细胞增殖，从而促进炎症反应，加重UC的程度。外周血 5-HT 是一种促炎因子，可调节细胞免疫功能，促进 IFN-γ 等炎症因子的释放，并加重 UC 的炎症反应，与 UC 的严重程度呈正相关，综合起来，DSS 可以增加 Clostridium_sensu_stricto_1 相关促炎因子的丰度，促进 IL-4、5-HT、TNF-α 和 IFN-γ 的释放，从而促进肠道炎症，导致溃疡性结肠炎。
肠道微生物群对难消化的碳水化合物进行降解发酵产生的短链脂肪酸（SCFAs）可以增加肠蠕动和肠黏膜含氧量，促进上皮细胞增殖和腺体发育。SCFAs 是免疫细胞的重要能量来源，是肠上皮正常功能、调节免疫反应和炎症的重要底物，表明 SCFAs 与 UC 密切相关UC中可产生SCFAs的细菌相对水平也发生显着变化，可缓解临床症状，促进肠道微生态平衡，对UC的恢复起到积极作用。我们的研究发现，DSS 可能导致细菌的相对水平发生显着变化，例如 Lachnospiraceae_NK4A136_group 和Muribaculum，这可能在肠道中产生 SCFAs，但在 DSS 干预后趋势不同。我们推测原因可能是毛螺菌科_NK4A136_group是一种有益菌，当炎症早期毛螺菌科_NK4A136_group水平升高时，会产生SCFAs来对抗炎症反应。炎症反应减少后，其丰度下降。然而，Muribaculum在早期受到显着抑制，因此其丰度降低，然后增加以产生SCFAs来对抗炎症。综上所述，肠道菌群在UC发生发展的全过程中发挥抗炎作用，但不同细菌在不同时期具有抗炎作用。
为研究炎性细胞因子与肠道菌群在 UC 发病中的作用机制，我们进行了相关性分析，发现 UC 动物模型肠道中的大部分病原菌与促炎因子呈正相关，与抗炎因子呈负相关，而有益细菌则相反。例如，致病菌（Clostridium_sensu_stricto_1、Coriobacteriaceae_UCG-002、Parasutterella和Romboutsia）的相对丰度与促炎因子（IL-4、TNF-α、IFN-γ、5-HT）的水平呈正相关，但与抗炎因子（IL-10、IL-22）呈负相关。这一结果与以往的研究一致。这些发现表明，DSS 可能影响小鼠肠道微生物的相对丰度和炎症因子的水平，破坏肠道免疫平衡，引起组织损伤并诱发 UC。
结论
我们的研究发现，2.5%的DSS通过降低某些益生菌的丰度、增加病原菌的丰度来降低抗炎因子水平和增加促炎因子，从而对UC造成结肠组织损伤。此外，UC不同阶段的细菌相对丰度存在显着差异，其中大多数在第21天趋于正常。我们的研究以及之前的研究表明，肠道微生态在DSS诱导的UC中起重要作用模型，肠道微生物组的相对丰度在溃疡性结肠炎的发生和发展过程中发生动态变化。
缩写
UC，溃疡性结肠炎；DSS，葡聚糖硫酸钠；TNBS，2,4,6-三硝基苯磺酸；OXZ，恶唑酮；DNCB，二硝基氯苯；CD，克罗恩病；ELISA，酶联免疫吸附试验；IL-2，白细胞介素-2；IL-4，白细胞介素 4；IL-6，白细胞介素-6；IL-10，白细胞介素 10；IL-22，白细胞介素 22；干扰素-γ，干扰素-γ；TNF-α，肿瘤坏死因子-α；5-HT，5-羟色胺；DAI，疾病活动指数；H&E、苏木精和伊红；OTU，操作分类单位；PCA，主成分分析；PCoA，主坐标分析；NMDS，非度量多维缩放；Treg，调节性 T 细胞；SCFA，短链脂肪酸。