希腊首次报告犬星状病毒和沙波病毒，同时寄生无症状和...

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希腊首次报告犬星状病毒和沙波病毒，同时寄生无症状和有肠胃炎症状的狗
摘要

星状病毒、诺如病毒和沙波病毒是全世界人类和动物中广泛分布的病毒。它们经常与疾病有关，主要是肠胃疾病。在狗身上，这些病毒已经在有症状和无症状的动物中检测到，主要是在年轻的时候。
方法

在目前的流行病学研究中，我们基于两种不同的分子方法，调查了来自希腊各地的 201 只家犬的唾液和粪便中是否存在犬星状病毒 (CAstV)、犬诺如病毒 (canine NoV) 和犬沙波病毒 (Canine SaV)，即常规和 SYBR-Green 实时 RT-PCR。样本来自年轻和成年无症状和有症状的动物。分别使用常规 RT-PCR 和 SYBR-Green 实时 RT-PCR 在 15/201 (7.5%) 和 29/201 (15%) 的受检狗中检测到CAstV。

结果

健康犬的病毒流行率较高，两种方法在年龄方面略有差异（67% 的幼犬采用常规 RT-PCR 方法，而成年犬采用 SYBR-PCR 方法为 52%绿色实时 RT-PCR)。仅使用 SYBR-Green 实时 RT-PCR 方法在 52/201 (23%) 只狗（主要是幼犬和无症状）中检测到犬 SaV，而在任何样本中均未检测到犬 NoV。应用了两种方法。CAstV 阳性样品的测序导致获得一个 CAstV 序列。系统发育分析证实了结果，将 CAstV 序列与来自其他国家的同源犬宿主序列聚类。

结论

CAstV 和 Canine SaV 被证明在希腊犬中传播。SYBR-Green 实时 RT-PCR 在检测这些病毒方面表现出更高的灵敏度。此外，我们能够通过系统发育分析确定在希腊流行的 CAstV 菌株。据我们所知，这是首次在希腊犬中对 CAstV 和犬 SaV 进行流行病学研究，也是首次在希腊犬中检测到。

背景

肠道致病病毒星状病毒、诺如病毒和沙波病毒可能是导致各种哺乳动物（包括猪、猫、貂、人类和狗）以及鸟类腹泻发作的原因。由于它们的全球分布和高传播能力，这些病毒，特别是诺如病毒 (NoVs) 和沙波病毒 (SaVs)，被认为是全球人类病毒性胃肠炎最常见的病原体 。

星状病毒是星状病毒科的成员，通常是无包膜、圆形结构和单链 RNA 病毒。它们是小病毒，直径约为 28-30 nm，包含长度为 6.4-7.7 kb 的阳性 ssRNA 基因组。星状病毒科分为两个属，即乳腺病毒属（包括 19 个种）和星状病毒属（包括 3 个种）。乳腺病毒属的成员感染各种哺乳动物，包括人类 、牛、猫 、猪和水貂。

Avastrovirus 属的成员主要感染鸟类，例如鸡、火鸡和鸭 。Mamastrovirus 和 Avastrovirus 基因组包含三个开放阅读框 (ORF)（ORF1a、ORF1b 和ORF2）。传染性病毒 RNA 作为基因组和病毒 mRNA。还值得一提的是，据估计，星状病毒会导致全球大约 10% 的儿童胃肠炎病例 。

犬星状病毒 (CAstVs) 于 1980 年首次在美国腹泻幼犬的粪便中被发现。从那时起，它们已在世界各个国家/地区被确定。CAstV 广泛存在于犬类种群中，其特点是遗传多样性高。CAstV 的这一特性使得诊断或未来的控制策略极具挑战性。据报道，有和无腹泻的狗的粪便中有 CAstV。大多数研究表明，有肠胃炎症状犬的 CAstV 阳性率高于无症状犬。表明在犬腹泻中的潜在作用。然而，关于星状病毒感染与腹泻或其他传染病的临床意义或关联的数据仍然有限。

诺如病毒和沙波病毒属于杯状病毒科。两个属均构成比星状病毒更大的无包膜、单链、正义 RNA 病毒，即大小为 7.3 至 8.5 kb。杯状病毒科根据其基因组结构进一步分为两组。第一组包含诺如病毒、水痘病毒和 Recovirus，在这组中，开放阅读框 1 ( ORF1 )在 3' 端附近与ORF2和ORF3分开，而在 MuNoV 中发现了包含在ORF2中的ORF4，编码毒力因子，即VF1. 第二组包含萨波病毒，由一个较大的ORF1和一个与诺如病毒的ORF3相当的标准ORF2组成。在该组中，建议将ORF3等同于ORF4。根据衣壳基因变异（VP1区），这两个病毒属分为几个基因组和基因型。

关于诺如病毒，它分为十个基因组（GI-GX）和48个基因型。已在人类中检测到其中三个基因组（GI、GII 和 GIV）。沙波病毒差异更大，分为 19 个基因组（GI-GVIII），其中 4 个（GI、GII、GIV 和 GV）已从人类中分离出来，基于完整的 VP1 序列，至少有 52 个基因型。仅在黑猩猩 (GI)、啮齿动物 (GII)、加利福尼亚海狮 (GV) 和猪 (GV 和 GVIII) 。犬沙波病毒 (Canine SaVs) 属于基因组 GXIII，而犬诺如病毒 (Canine NoVs) 属于基因组 GIV 和 GVI 。

在本研究中，我们检查了来自希腊不同地区的 201 只狗的粪便和唾液，这些狗来自两个年龄组，即年轻（< 12 个月）和成人（≥ 12 个月），以发现 CAstV、犬 SaV 和犬十一月。样本来自无症状和有症状的动物，主要有肠胃炎症状。应用了两种不同的方案，第一种基于传统的逆转录 PCR (RT-PCR)，而第二种基于 SYBR-Green 实时 RT-PCR，采用敏感性和特异性比较方法。结果通过测序和系统发育分析得到证实。据我们所知，至少对于星状病毒和沙波病毒而言，这是希腊首次对狗进行的流行病学研究。

材料和方法样品采集在 2017 年至 2018 年期间，从希腊各地的 201 只家犬身上采集了 201 份粪便拭子样本和 201 份唾液样本（图 1）。选择了 33 名兽医进行样本采集，而样本是由兽医从拜访兽医的狗身上采集的。样本来自各种品种的有症状和无症状的狗。有症状的动物主要表现出肠胃炎症状，但有其他症状的狗也包括在研究中。这些狗分为两个年龄组：年轻（< 12 个月大）和成年（≥ 12 个月大）。从每只狗获得两个拭子样本、一个唾液样本和一个粪便样本。取样后，将拭子插入 1.5 ml eppendorf 管中，该管含有 1 ml RNAlater (Sigma Aldrich) 溶液，用于稳定 RNA，并在等温箱中的冰中转移到实验室。到达实验室后，每个样品涡旋 5 分钟，并以 12,000 × g 离心 10 分钟。收集上清液，将 3-5 瓶（置于新的无菌 1.5 ml eppendorf 管中）汇集在一起​​，并储存在 –80 °C 直至进一步处理。总共从最初的 402 个单独样本创建了 92 个池。

图。1



希腊地图展示了样本采集点，以黄点的形式表示

RNA提取按照制造商的建议，使用 RNA 提取试剂盒“Cador 病原体试剂盒”（Qiagen，德国）从 200 μl 体积的混合样本中提取总 RNA。在分光光度计（Eppendorf）中评估提取的 RNA 的质量和数量。提取的 RNA 储存在 – 80 °C 直至进一步分析。

B-actin 检测用于确认样品的完整性为了确认样品的 RNA 完整性，进行了用于检测 b-肌动蛋白的两步 RT-PCR。肌动蛋白是存在于大多数真核细胞中的最丰富的蛋白质。肌动蛋白基因是主要的看家基因，这意味着它是一种管理基因，存在于包括人类在内的所有动物物种中，无论生理状况如何，它都稳定地表达在大部分组织中。为了检测狗中的 b-肌动蛋白，使用了引物 actin2（5'-CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT-3'）和 actin3（5'-GCT CCT CCC TGG AGA AGA GCT A-3'） 在具有以下条件的两步 RT-PCR 中： 使用 PrimeScript™ RT-PCR（TAKARA，日本）在两种混合物中进行逆转录；混合物一含有 1 μl dNTPs (10 mM)、1 μl oligo dtPrimer (2.5 μM)、100–150 ng 模板 RNA 和无 RNAse 水，总体积为 10 μl。将混合物在 65°C 下孵育 5 分钟，然后在 4°C 下储存。然后制备第二个混合物，其中包含 2 μl 5X PrimeScript Buffer、0.25 μl RNase inhibitor (40 U/μl)、0.5 μl PrimeScript RTase、RNase free water（最终体积为 10 μl）和 5 μl 用于变性的反应混合物和从混合物 1 中退火。混合物 2 在热循环仪中进行，程序在 30 °C 下进行 10 分钟，50 °C 在 30 分钟和 95 °C 下进行 5 分钟。以这种方式，创建了逆转录的 cDNA。以下列方式进行用于检测b-肌动蛋白的PCR。Mastermix 含有 3 μl 10X PCR 缓冲液、0.6 μl dNTPs (10 mM)、1.5 μl MgCl2 (50 mM)、0.6 μl 正向引物 (10μM)、0.6 μl 反向引物 (10 μM)、0.3 μl 5 u/μl Taq 聚合酶和 18.4 μl Rnase-free H2 O. 将 4 μl cDNA 加入到 mastermix 中。PCR 的条件如下：初始 PCR 激活步骤在 95°C 2 分钟，然后是 40 个循环，95°C 1 分钟，62°C 1 分钟和 72°C 1 分钟，最后延伸步骤 72 °C 10 分钟。

常规 PCR星状病毒为了使用常规 PCR 检测犬星状病毒，使用了引物 625F (5'-GTACTATACCRCTGATTTAATT-3') 和 626R (5'-AGACCAARGTGTCATAGTTCAG-3')。这些引物产生 294 bp 的扩增子。先前生成的 cDNA 用于常规 PCR。Mastermix 包含 3 μl PCR Buffer、0.6 μl dNTPs、1.2 μl 正向引物、1.2 μl 反向引物、0.36 μl Taq 聚合酶（10 个单位/μl）和 19.64 μl 无 Rnase H 2 O。4 μl将 cDNA 加入到 mastermix 中。PCR 的条件如下：初始 PCR 激活步骤在 94 °C 下 2 分钟，然后是 40 个循环，即 95 °C 下 1 分钟、51 °C 下 1 分钟和 72 °C 下 1 分钟，最后是延伸步骤在 72 °C 下 10 分钟。

诺如病毒和沙波病毒对于犬诺如病毒和沙波病毒的检测，使用了三种不同的引物对。第一个是通用引物对p289-p290（p290：GATTACTCCAAGTGGGACTCCAC-p289：TGACAATGTAATCATCACCATA，它能够同时检测诺如病毒和沙波病毒，分别产生331 bp的萨波病毒和318 bp的诺如病毒扩增子。该引物对靶向杯状病毒RdRp的一个保守区域。第二对引物是用于检测诺如病毒的 HK 引物对 (HIK NORO-F (5'-RHYATTGACCCCTGGATW-3') 和 HK NORO-R (5'-AACGCATTCCCHGCMARKA) -3'，产生一个 203 bp 的扩增子。该引物对靶向 HK 诺如病毒毒株 VP1 蛋白最保守的区域。作为阳性对照，我们使用了 HK Norovirus 株，它是 S. Caddy 从英国赠予我们的，已整合到质粒中。第三对引物是 DogSap1F (5'-ACACACGATCCAAATTCACCAA-3') 和 DogSap1R (5'-TGCCAGACAGACCTCCAATTG-3')，用于检测沙波病毒，其产生 150 bp 的扩增子。

对于引物对 p289-p290 的 PCR 反应，5 μl 10 × PCR Buffer、2 μl dNTPs、1 μl 正向引物、1 μl 反向引物、0.5 μl Taq 聚合酶（10 单位/μl）和 36.5 μl向 4 μl cDNA 中加入 10毫升无 Rnase H 2 O。PCR 的条件如下：94 °C 3 分钟，然后是 40 个循环，94 °C 30 秒，49 °C 1:20 分钟，72 °C 1 分钟，最后一个延伸步骤在 72 °C 10 分钟。

对于使用引物对 HK NORO-F-HK NORO-R 进行 PCR 反应，3 μl 10 × PCR Buffer、0.6 μl dNTPs、1.2 μl 正向引物、1.2 μl 反向引物、0.36 μl Taq 聚合酶（10单位/μl) 和 19.64 μl 无 Rnase H 2 O 被添加到 4 μl cDNA 中。PCR 的条件如下：94 °C 3 min，然后是 94 °C 30 s、60 °C 1 min 和 72 °C 1 min 的 40 个循环，最后延伸步骤 10 min在 72 °C。

最后，对于使用引物对 DogSap1F-DogSap1R 的 PCR 反应，3 μl 10 × PCR Buffer、0.6 μl dNTPs、1.2 μl 正向引物、1.2 μl 反向引物、0.36 μl Taq 聚合酶和 19.64 μl Rnase free H2O加入 4 μl cDNA。PCR 的条件如下：初始激活步骤在 94 °C 下 3 分钟，然后是 40 个循环，在 94 °C 下 30 秒，在 60 °C 下 1 分钟和在 72 °C 下 1 分钟，最后是延伸步骤在 72 °C 下 10 分钟。

SYBR-Green 实时 RT-PCR

星状病毒

使用 Sybr-Green 实时 RT-PCR 方法检测犬星状病毒，使用引物 F2-R2（F2：5'-TTCCCTGCTTCTGATCAG-3' 和 R2：5'-CTCACTTAGTGTAGGGAGAG-3'） . 这些引物靶向犬星状病毒的 Cap 基因并产生 126 bp 的扩增子。Fast Gene IC Green One Step Mix 试剂盒用于 Sybr-Green Real time RT-PCR (Nippon Genetics) 的反应。RT-PCR 条件和熔解曲线分析按照我们之前的工作中的描述进行。

诺如病毒

用 SYBR-Green 实时 RT-PCR 方法检测犬诺如病毒，使用引物 F：GCTGGATGCGGTTCTCTGAC 和 R：TCATTAGACGCCCATCTTCATTCAC与 RT-PCR 试剂和条件，熔解曲线分析与 Stamelou 完全相同等。（2022 年）。目标序列是RdRp 的高度保守区域。

沙波病毒

引物 DogSap1F-DogSap1R 也用于检测犬沙波病毒的 Sybr-Green 实时 RT-PCR。Fast Gene IC Green One Step Mix 试剂盒用于 Sybr-Green Real time RT-PCR (Nippon Genetics) 的反应。试剂的同意和 PCR 的条件与 Stamelou 等人的相同。 用于检测犬诺如病毒。

测序

基于常规 RT-PCR 的阳性星状病毒或杯状病毒样品在 Eurofins Scientific 中进行纯化和双向测序。软件 MEGA-X 用于编辑序列，并应用基本局部比对搜索工具 (BLAST) 对衍生的单倍型与来自 Genbank 数据库的相应单倍型进行序列相似性评估。相同的软件用于构建应用邻接法的系统发育树，并通过 1000 次引导迭代验证。

结果

B-肌动蛋白基因在所有样品中成功扩增，确保了它们的完整性。使用常规 RT-PCR 在 7.5% (15/201) 的狗中检测到犬星状病毒，使用 SYBR-Green 实时 RT-PCR 结合熔解曲线分析在 15% (29/201) 的狗中检测到犬星状病毒（图.  2）。犬星状病毒和犬沙波病毒的 Tm 值分别为 86.5°C 和 81.5°C。常规 RT-PCR 检测呈阳性的狗中有 67% (67%) 是年轻且健康的，而 33% 是成年且有症状的。用SYBR-Green实时RT-PCR方法对病毒的年龄分布进行分析，48%的阳性犬为幼犬，52%为成年犬。检测到病毒的狗中有 59% 没有症状，而其中 41% 有症状（主要有胃肠道症状）。相反，无论是使用常规 RT-PCR 还是 SYBR-Green 实时 RT-PCR 检测的任何样本，都未检测到犬诺如病毒。使用 SYBR-Green 实时 RT-PCR 和熔解曲线分析在 23% (52/201) 的狗中检测到犬沙波病毒（图 1）。 然而，当应用传统的 RT-PCR 时，在任何样品中都没有检测到它。关于年龄分布，52% 的阳性犬是幼犬，而 48% 是成年犬。56%的阳性犬无症状，44%有症状，主要表现肠胃炎症状。

图 2

对犬星状病毒呈阳性的检查的犬样本的熔解曲线图。每个峰表示每个分析的扩增子

图 3





对犬沙波病毒呈阳性的检测犬样本的熔解曲线图。每个峰表示每个分析的扩增子

在常规 RT-PCR 中对犬星状病毒呈阳性的样本被送去测序。获得了一个犬星状病毒序列，并以登录号 OK067314 保存在 GenBank 数据库中。构建了系统发育树（图 4）；结果表明，该序列与相应的犬星状病毒序列具有 95% 的相似性。

图 4

对本研究中检测到的犬星状病毒株（用红色三角形表示）的 Cap 基因（294-bp 片段）的核苷酸序列与 10 个犬星状病毒参考序列进行邻接系统发育分析。GenBank 登录号和原产国显示在树的分支上

讨论病毒是动物肠胃炎的主要病原体，尤其是幼犬（< 1 岁）。犬星状病毒、犬诺如病毒和犬沙波病毒是相对较新描述的病毒，它们与犬的胃肠炎症状有关，但疾病的确切机制仍不清楚。

在本研究中，7.5% (30/402) 的样本采用常规 RT-PCR 方法检出犬星状病毒，15% (60/402) 的样本采用 SYBR-Green Real time 方法检出。 RT-PCR，提示第二种具有更高的灵敏度。根据常规 RT-PCR 结果，病毒主要在年轻、健康的狗中检测到（67%），而根据 SYBR-Green RT-PCR 结果，病毒主要在成年、健康的狗中检测到。这种差异可能是因为更多的狗用 SYBR-Green 实时 RT-PCR 方法检测呈阳性，导致这种变化，这进一步归因于每种技术的性质，实时 PCR 是就更高的灵敏度而言，能够检测到较少量的病毒RNA。 2 )。我们的研究结果与王等人的结果一致。关于 SYBR-Green 实时 RT-PCR 中样品的解链温度。就样本的性质而言，在粪便和唾液样本中检测到病毒的比例大致相同。将阳性样本送去测序，结果只获得了一种犬星状病毒单倍型，表明遗传同质性很高。创建的系统发育树，包括从 GenBank 中检索到的各种犬星状病毒单倍型，与我们的序列显示超过 98% 的遗传相似性（图 4），证实了该病毒在检查样本中的存在。如图 4所示，在本研究中获得的犬星状病毒序列与来自巴西、中国和意大利的犬星状病毒序列在遗传上高度相似，其中巴西的序列表现出最大的相似性。这种遗传相似性可以通过几个原因来解释，例如在这些国家旅行。狗主人通常带着他们的宠物旅行。因此，该病毒有可能通过在这三个国家之一旅行的狗直接传播到希腊，或者通过在干预国家寄养狗间接传播。我们获得的犬星状病毒序列检测呈阳性的狗属于 Pressa Canario 品种。这个品种的原产国是西班牙。病毒传播的另一种可能解释是许多国家经常组织的狗表演和狗的敏捷课程。由于这只狗是纯种狗，因此不能排除在这种情况下将星状病毒传染给他。此外，这只狗有可能是由国外的饲养员购买的，从而提供了病毒传播的另一种可能性。在任何情况下，系统发育分析揭示了一种不存在距离遗传隔离的模式，这通常与犬种的广泛贸易运输一致，主要是纯种犬种。从而提供了病毒传播的另一种可能性。在任何情况下，系统发育分析揭示了一种不存在距离遗传隔离的模式，这通常与犬种的广泛贸易运输一致，主要是纯种犬种。从而提供了病毒传播的另一种可能性。在任何情况下，系统发育分析揭示了一种不存在距离遗传隔离的模式，这通常与犬种的广泛贸易运输一致，主要是纯种犬种。

另一方面，使用 SYBR-Green 实时 RT-PCR 方法，在 23% (52/201) 的检查狗中检测到了沙波病毒。在使用常规 RT-PCR 方法检查的任何样品中均未检测到 p289-p290 引物对或 DogSap1F-DogSap1R 引物对。在针对萨波病毒检测的研究中必须考虑到这种方法学上的分歧，建议同时使用这两种方法以获得更精确的诊断结果。该结果表明，在这种情况下，SYBR-Green Real-time RT-PCR 与传统 RT-PCR 方法相比具有更高的灵敏度。犬沙波病毒检测在年轻、健康的狗中略高（检测呈阳性的狗中有 52% 是年轻的，其中 56% 是健康的）。我们看到这两种病毒（犬星状病毒和犬沙波病毒）主要在无症状的狗中检测到。这一发现与其他研究的结果一致，例如 Martella 等人。[5 ]，在有症状和无症状的狗中都检测到星状病毒。在张等人。犬星状病毒也在有症状（有腹泻症状）和无症状的狗中检测到。

使用常规 RT-PCR 或 SYBR-Green 实时 RT-PCR 的方法，在任何检查的样本中均未检测到诺如病毒，尽管 3 对不同的引物（p289-p290，HK NORO-F-HK NORO-R , FR) 用于病毒的检测。我们的结果与 Caddy 等人的结果一致。是否使用引物 p289-p290 进行了 SYBR-Green 实时 RT-PCR，并使用 HK-NORO-F-HKNORO-R 引物进行了另一次基于 SYBR 的 qPCR，以检测 HK 诺如病毒（同一株为在我们的 PCR 中也用作阳性对照）。在 Caddy 等人中未检测到犬诺如病毒阳性样本。使用任一引物对进行研究，尽管在检查的样本中检测到显着水平的犬诺如病毒抗体。对此的一个可能解释可能是犬诺如病毒的高遗传变异性，这可能导致引物无法扩增病毒。此外，病毒感染可能是非常短期的，因此使分子检测非常困难。

结论在本研究中，我们证明了犬星状病毒和沙波病毒在整个希腊的狗中的传播。这两种病毒在有症状和无症状动物中都被发现，因此它们在疾病中的作用仍不确定。幼犬似乎主要受这两种病毒的影响。我们能够表征一种犬星状病毒序列并观察其与来自 GenBank 的其他犬星状病毒序列的系统发育关系。本研究未检测到犬诺如病毒。最后，据我们所知，这是希腊首次报道犬星状病毒和沙波病毒，也是希腊首次对这些病毒进行流行病学研究。