伊朗女性正常、癌前和恶性宫颈样本中人类疱疹病毒 8 的...

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伊朗女性正常、癌前和恶性宫颈样本中人类疱疹病毒 8 的流行率抽象的
背景

鉴于 HPV 和 HHV-8 的主要传播途径是通过性行为这一事实，推测 HPV 和 HHV-8 的共感染可能在宫颈癌的发展中发挥了重要作用是合理的。本研究的目的是估计宫颈癌患者和健康个体的宫颈样本中 HHV-8 的患病率以及 HPV 和 HHV-8 合并感染的频率。

方法

通过巢式 PCR 研究了来自 61 名宫颈癌患者、124 名患有癌前病变的女性和 179 名健康个体的 364 份样本。

结果

HHV-8在宫颈癌、癌前病变和正常标本中的频率分别为22.9%、17.7%和14.5%（P  =0.308）。HHV-8 和 HPV 共感染的总体流行率为 16.2%。在所有三个研究组中，HHV-8 阳性样本中的 HPV 患病率均高于 HHV-8 阴性样本，并且这种差异达到了统计学显着水平（P  = 0.002）。然而，HHV-8 阳性和 HPV 基因型之间没有显着差异（P  = 0.08）。

结论

我们的结果显示宫颈癌组的HHV-8基因组检测率高于对照组。然而，未来需要进行更大样本量的研究和评估 HHV-8 蛋白的表达。

介绍
宫颈癌被认为是第四大最常见的癌症，2020 年全球估计有 604,000 例新病例和 342,000 例新死亡。据估计，伊朗宫颈癌的年龄标准化发病率和死亡率分别为每 100,000 名女性 3.5 和 1.2 。

人乳头瘤病毒 (HPV) 是最普遍的病毒性性传播感染，是众所周知的宫颈癌病原体。虽然 HPV 感染通常在获得后 6 个月至 2 年内消失，但一小部分感染某些 HPV 类型，被指定为高危 HPV 类型（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51 , 52, 56, 58, 59, 68 和 73)，可以持续存在并因此发展为宫颈癌。在 12 种高危 HPV 类型中，HPV 16 和 18 是导致宫颈癌的主要原因，几乎 73% 的病例归因于这两种类型。虽然 HPV 感染对于宫颈癌的发展是必要的，但这还不够，包括环境（例如终生性伴侣的数量、口服避孕药、吸烟和传染源）和遗传因素在内的几个风险因素与这方面有关。有人认为，某些病毒（如疱疹病毒和人类免疫缺陷病毒）、细菌（如沙眼衣原体） 、真菌和寄生虫感染会增加患宫颈癌的风险。

人类疱疹病毒 8 (HHV-8) 已被证明是卡波西肉瘤和两种淋巴瘤的病原体，包括原发性渗出性淋巴瘤和多中心 Castleman 病。HHV-8 在宿主细胞中建立终生潜伏感染，几种病毒基因的表达有限。HHV-8 可通过口交、阴道性交和肛交传播。结果表明，HHV-8 基因组可以在唾液、精液和女性生殖道中检测到。

鉴于 HPV 和 HHV-8 的主要传播途径是通过性行为这一事实，推测 HPV 和 HHV-8 的共感染可能在宫颈癌的发展中发挥了重要作用是合理的。据我们所知，这是第一份调查伊朗女性正常、癌前和恶性宫颈样本中 HHV-8 患病率的报告。世界上针对宫颈癌患者 HHV-8 患病率的研究也很少。本研究的目的是估计癌前病变和恶性病变患者以及健康个体的宫颈样本中 HHV-8 的患病率以及 HPV 和 HHV-8 共感染的频率。

材料和方法

样品

为了调查 HHV-8 的患病率，设计了一个病例对照研究。出于本研究的目的，纳入了 185 例病例样本（61 名浸润性宫颈癌患者和 124 名患有癌前病变的女性）和 179 名健康个体（阴性巴氏试验结果）。在标本类型方面，61 例浸润性宫颈癌患者样本和 53 例癌前病变女性样本均为福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE），采集自德黑兰 Immam-Khomeini 医院和 Al-Zahra 医院。 2017 年至 2019 年的 West Azarbayzan。2017 年至 2019 年，从德黑兰的三个转诊实验室获得了 71 个癌前病变女性样本和所有 179 个正常样本均为薄准备巴氏试验样本。尽管 114 个 FFPE 标本中 HPV 感染和 HPV 基因型的状态未知，但之前对 250 个薄准备巴氏试验标本进行了表征。患有宫颈癌、癌前病变和正常宫颈的女性的平均年龄 ± SD 分别为 54.1 ± 13.4、36.1 ± 9.4 和 36.6 ± 11.5。所有研究参与者都对经德黑兰医科大学当地研究伦理委员会（批准号：IR.TUMS.SPH.REC.1399.298）批准的研究表示知情同意。

DNA提取

根据制造商的说明，使用高纯病毒核酸试剂盒（Roche Diagnostics GmbH，Berlin，Germany）从 Thin-Prep Pap 测试样本中提取基因组 DNA。从 FFPE 样本中提取 DNA 是根据之前公布的程序实现的。简而言之，将 10 μm 切片手动切片并收集在无菌管中用于 PCR 分析。为了防止样本之间可能的交叉污染，在切割下一块之前更换了刀片和手套。每个组织活检切片用二甲苯处理两次以去除石蜡，用无水乙醇处理两次以去除有机溶剂。然后用含有 150 μg/ml 蛋白酶 K（56 °C 3 小时）的裂解缓冲液（10 mM Tris–HCl pH 7.6、5 mM EDTA、150 mM NaCl、1% SDS）消化组织样品，然后通过苯酚和苯酚-氯仿-异戊醇 (25:24:1) 在 0.3 M 乙酸钠 (pH 4.6) 中萃取和乙醇沉淀。从 FFPE 样品中提取的 DNA 的完整性通过扩增 268 bp 的 β-珠蛋白基因片段进行评估。在 DNA 质量分析之后，确认所有 114 个 FFPE 样本都适合 HHV-8 检测。

人乳头瘤病毒（HPV）L1基因PCR扩增及基因分型

使用 MY09/MY11 引物对（外引物）和 GP5 + /GP6 + 引物对（内引物）通过巢式 PCR 对所有 FFPE 样品（114 个样品）进行 HPV DNA 检测，获得几乎 150 bp 的 HPV L1 片段基因。PCR 反应在 50 μL 反应混合物中进行，其中包括 100–200 ng DNA 模板、2.5 mM MgCl 2、每种引物 10 pmol、每种 dNTP 50 mM 和 2 U Taq DNA 聚合酶。第一轮和第二轮的 PCR 扩增循环如下：在 95°C 初始变性 3 分钟，然后是 35 个循环，95°C 30 秒，50°C 45 秒，72°C 1 min（第一轮）和 35 个循环，即 95 °C 30 s、52 °C 40 s 和 72 °C 45 s（第二轮），最后在 72 °C 下延伸 5 min。在每次 PCR 运行中都包括缺乏 DNA 模板的反应混合物作为阴性对照。PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶上电泳。

按照 Applied Biosystems 手册 (Foster City, CA) 的规定，使用 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 和 3130 遗传分析仪自动测序仪对 PCR 扩增产物进行测序。核苷酸序列用 Bioedit 软件编辑并转换为 FASTA 格式。将序列与其他 HPV 类型进行比较。

人疱疹病毒8型（HHV-8）ORF26基因的PCR扩增

ORF26 是一个保守基因，用于检测临床样本中的 HHV-8 。使用巢式 PCR 扩增 HHV-8 ORF26 以获得 172 bp 的扩增子大小。本研究使用的引物序列第一轮为 5'-AGCCGAAAGGATTCCACCATT-3' 和 5'-TCCGTGTTGTCTACGTCCAGA-3'，第二轮为 5'-GTGCTCGAATCCAACGGATT-3' 和 5'-ATGACACATTGGTGGTATATAG-3'。。PCR 反应在 50 μl 反应混合物中完成，其中包括 100–200 ng DNA 模板、1.5 mM MgCl 2、每种 dNTP 50 μM、每种引物 10 pmol 和 1.5 U Taq DNA 聚合酶。第一轮和第二轮的PCR扩增循环如下：35个循环95°C 30 s、55°C 40 s和72°C 50 s和35个循环95°C 30 s、52° C 40 s 和 72 °C 45 s，分别。在每次 PCR 运行中都包括缺乏 DNA 模板的反应混合物作为阴性对照。PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶上电泳。

统计分析

通过 EPI Info 7 Statistical Analysis System Software (Atlanta, GA, USA) 使用 X 2检验或 Fisher 精确检验进行统计分析。当 P 值小于 0.05 时，它们被认为具有统计学意义。

结果
本研究调查了来自 61 名宫颈癌患者、124 名患有癌前病变的女性和 179 名健康个体的 364 份宫颈样本中 HHV-8 的患病率。

患有宫颈癌、癌前病变和正常宫颈的女性的平均年龄 ± SD 分别为 54.1 ± 13.4、36.1 ± 9.4 和 36.6 ± 11.5。

在宫颈癌、癌前病变和正常标本中发现 HHV-8 的频率分别为 22.9%、17.7% 和 14.5%。尽管与癌前病变和正常标本相比，宫颈癌患者中 HHV-8 的患病率较高，但差异无统计学意义（P  = 0.308）（表1）。在患有宫颈癌的女性中，HHV-8 的患病率与癌症类型之间没有显着差异，因为它在 24% 的鳞状细胞癌 (SCC) 和 18.2% 的腺癌 (AD) 病例中发现 ( P  = 0.98)。有趣的是，在 HHV-8 的流行率和样本类型之间没有发现统计学上的显着差异（P = 0.78)，因为分别在 15.8% 和 17.6% 的 FFPE 和 Thin-prep pap 测试样品中检测到 HHV-8（表1）。

表 1 宫颈样本中人类疱疹病毒 8 (HHV-8) 的流行率，按多个因素分层

• P值小于 0.05 以粗体表示
• SCC：鳞状细胞癌和 AD：腺癌；FFPE：福尔马林固定石蜡包埋组织
• 
  

如表1所示，HHV-8 的流行率因 HPV 感染状态而异，因为在 HPV 阳性样本（20.3%）中观察到 HHV-8 感染率高于 HPV 阴性样本（4.0%），并且达到了这种差异具有统计学意义的水平（P  = 0.002）。

如图 1所示，HHV-8 和 HPV 之间的共感染总体流行率为 16.2%。三个研究组的 HPV 流行率因 HHV-8 感染状态而异：宫颈癌女性的 HPV 感染率（23%）高于癌前组和正常组，共感染率分别为 15.3% 和 13.4%，分别（图 1）。在HHV-8阳性样本中，HPV在宫颈癌、癌前病变和正常样本中的发生率分别为92.3%、86.3%和100%（表2）。
图。1



人疱疹病毒 8 (HHV-8) 和人乳头瘤病毒 (HPV) 在恶性组、癌前组和正常组中的频率


表 2 三个研究组人疱疹病毒 8 (HHV-8) 阳性与年龄组、人乳头瘤病毒感染 (HPV) 和 HPV 基因型之间的分析





关于 HPV 基因型，在同时感染 HPV 16/18 和高危非 16/18 HPV 类型（HPV 31、33、35、39、45、51、 52、56、58 和 59）。然而，在 HHV-8 阳性和 HPV 基因型之间没有发现显着差异（P  = 0.08）（表1）。有趣的是，在 HHV-8 阳性样本中，三个研究组的 HPV 基因型存在统计学显着差异（P  = 0.0001），因为宫颈癌样本中 HPV 16/18 的共感染（78.6%）比癌前病变（15.8 %) 和正常 (20.8%) 组（表2）。换言之，与宫颈癌组（21.4%）相比，高危非 16/18 HPV 类型在正常组（79.2%）和癌前病变（84.2%）组中更常见。

如表1所示，虽然50岁以上女性HHV-8的患病率（18.5%）高于其他年龄组，但差异无统计学意义（P  =0.55）。然而，在 HHV-8 阳性的三个研究组中，发现年龄组存在显着差异（P  = 0.015，表2）。如表2所示，大多数正常（69.2％）和癌前（54.5％）样本在<40岁的年龄组中，大多数恶性样本（78.6％）在> 40岁的组中发现。

讨论

很少有研究调查 HPV 和 HHV-8 之间的共感染作用或它们在宫颈癌中的相互作用。在这项研究中，在子宫颈样本中评估了 HHV-8 的患病率和 HPV/HHV-8 合并感染的频率。HHV-8 基因组分别在 22.9%、17.7% 和 14.5% 的宫颈癌、癌前病变和正常标本中检测到。与我们的结果一致，在中国的一项研究中，HHV-8 基因组分别在 4.5% 和 10% 的宫颈上皮内瘤变 (CIN) II-III 和宫颈癌中发现。HHV-8 DNA 也分别在 9.2% 和 14.3% 的正常和 CIN I 样本中检测到。HHV-8 感染率分别在 16% 和 8% 的西班牙性工作者和普通人群中被发现，比值比为 2.2。HHV-8 DNA 也分别在巴西男性和女性生殖器刷牙的 3.2% 和 0% 中发现。然而，在瑞典女性样本的任何正常宫颈分泌物中均未检测到 HHV-8 DNA。这些研究之间的差异可能是由于 HHV-8 仅在受感染的个体中间歇性排出这一事实。

建议在 HHV-8 流行为中低的地区，口腔脱落和异性接触是 HHV-8 传播的潜在途径。Kenia 对 HIV-1 血清阳性和血清阴性个体的一项研究表明，HIV-1 血清阳性和血清阴性女性的 HHV-8 从生殖器部位脱落的几率增加了 2.1 倍。他们发现生殖道中的 HHV-8 脱落与 HIV-1 病毒载量和 CD4 计数无关。因此，他们提出 HHV-8 从生殖器粘膜部位脱落的潜在机制可能与通过 CD4 计数测量的细胞免疫无关 。在伊朗之前的一项研究中，13.6% 的静脉注射吸毒者和 3.6% 的普通人群在外周血单个核细胞 (PBMC) 样本中检测到 HHV-8 DNA。有趣的是，在两组中，女性的 HHV-8 频率高于男性，尽管差异无统计学意义。一项研究的结果显示，在妓女和一般人群的宫颈样本中分别检测到了 2% 和 1% 的 HHV-8 基因组。然而，这些女性的所有 PBMC 样本均为阴性 。有人认为 HHV-8 感染在推测为获得性传播疾病的高危行为的女性中较高（即第一次性交和 HPV 宫颈感染）。

由于 HPV 阳性样本中 HHV-8 的患病率显着高于 HPV 阴性样本，因此在 HHV-8 和 HPV 感染的频率之间观察到了统计学上的显着差异。根据我们的数据，西班牙的一项研究表明，HHV-8 在 HPV DNA 阳性女性（优势比 = 2.5）和首次性交年龄较小的女性（优势比 = 2.7）中更常见。然而，来自中国的一项研究发现，HPV 阳性组和 HPV 阴性组中 HHV-8 的频率相似（9.4% vs. 8.0%）。

在这项研究中，HHV-8 阳性和 HPV 基因型之间完全没有显着差异。然而，宫颈癌患者与癌前或正常受试者之间的 HPV 基因型患病率存在​​显着差异，并且这种差异具有统计学意义，因为 HPV 16/18 在宫颈癌标本中更为普遍（78.6%）而不是正常（20.8%）和癌前病变样本 (14.3%)。

HHV-8 感染与 HPV 协同作用可通过多种机制促进宫颈癌的发生。结果表明，HHV-8 在 SiHa 细胞系中的共感染可促进几种炎症因子的表达水平增加，包括白细胞介素 6 (IL-6)、趋化因子 (CXC 基序) 配体 1 (CXCL1)、趋化因子 (C–C 基序) ) 配体 5 (CCL5)、白细胞介素 8 (IL-8)、巨噬细胞迁移抑制因子 (MIF) 和纤溶酶原激活物抑制剂 1 (PAI-1)。事实上，IL-6 已被证明通过血管内皮生长因子 (VEGF) 依赖性血管生成来刺激宫颈肿瘤生长。此外，CXCL1 是宫颈癌发展的主要因素，因为据报道，与癌前和健康对照组相比，宫颈癌患者血清中 CXCL1 的水平升高。鉴于慢性炎症是癌症的标志之一这一事实，人们很容易推测 HHV-8 合并感染可能通过提供慢性炎症在支持宫颈癌发生中发挥重要作用。有趣的是，HHV-8 在裂解阶段编码 v-IL6认为还可以增强和促进宫颈癌的致癌作用。此外，HHV-8 编码的裂解蛋白 RTA（复制和转录激活因子）可以与 HPV 16 基因组中的至少三个位点结合，包括长控制区 (LCR) 中的位置 7522-7333 和 7590-7603 以及长控制区 (LCR) 中的位置 333-344。 E6 编码基因并导致 E7 转录的显着上调。HPV E7 和 E6 病毒癌蛋白在驱动细胞肿瘤发生中起核心作用。这两种蛋白质可以触发癌细胞的所有特征 。HPV/HHV-8 的共同感染可能在宫颈癌的发生中直接和间接地发挥作用。

在 HHV-8 阳性的三个研究组中，发现年龄组存在显着差异（P  = 0.015）。而大多数正常（69.2%）和癌前（54.5%）样本在<40岁的年龄组中，大多数恶性样本（78.6%）在>40岁的组中发现。这些结果是合理的，因为宫颈癌发病率的高峰显示在伊朗 55-65 岁的女性中。关于这些事实，即随着年龄的增长，HHV-8 的再激活可能会发生更多，而经典的卡波西肉瘤更常发生在老年人中，HHV-8 的再激活也可能在患有宫颈癌的女性中更常见，因为与衰老相关免疫抑制。
发现这项研究最重要的局限性是样本量相对较小。

结论我们的结果显示宫颈癌组的 HHV-8 基因组检测率高于癌前组和对照组。此外，我们的发现支持 HHV-8 在伊朗人群中通过性途径传播的可能性。然而，有必要进行更大样本量的未来研究和评估宫颈样本上 HHV-8 蛋白的表达。还建议在所有年龄组的唾液中确定 HHV-8 的脱落频率，以明确 HHV-8 在伊朗的传播途径。