经口摄入的人乳铁蛋白在回肠造口术女性体内的上消化道...

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经口摄入的人乳铁蛋白在回肠造口术女性体内的上消化道中消化和分泌
摘要

乳铁蛋白 (LF) 是一种存在于牛奶和其他分泌物中的糖蛋白，可提供一种营养成分，用于治疗与高渗透性、氧化应激和炎症相关的肠道疾病。该研究的目的是确定口服重组人乳铁蛋白 (rhLF) 在人体内上消化道 (GI) 和小肠中的存活率。女性回肠造口术患者 [ n= 8; 中位年龄 44 (43–57) y] 摄入含有 5 g rhLF 的测试饮料，并收集全回肠造口术输出 24 小时。使用不透射线的标记监测测试饮料的通过。通过ELISA定量回肠流出物中的完整LF。整个测试饮料在 24 小时回肠流出物收集期间通过小肠。LF 以较低但恒定的速率排出 [0.35 (0.28–0.47) μ g LF/2 h]。测试饮料的胃肠道通过和回肠流出物中随时间的LF排泄不相关。总共，中位数为 4 μg LF 在 24 小时收集期间被排泄，而 5 g rhLF 被摄入。因此，日粮 rhLF 在上消化道被消化，不会到达结肠。回肠造口流出物中出现的完整 LF 可能来自内源性来源。

乳铁蛋白 (LF) 3是转铁蛋白家族的一种蛋白质。它存在于乳汁、唾液、眼泪、胆汁、血浆、粘膜和生殖器分泌物中。LF 能够在两个不同的叶片上以高亲和力结合三价铁 (Fe 3+ )。许多生理效应归因于LF。先前的研究表明 LF 分子具有杀菌 、抗病毒 和抗氧化特性 。

有人提出LF具有抗炎潜力。这种作用似乎部分是通过减弱肿瘤坏死因子 (TNF)-α 反应来介导的 。TNF-α 参与炎症性肠病 (IBD) 的发病机制。因此，从理论的角度来看，LF 有可能被用作治疗 IBD 的抗炎剂。在局部粘膜给药后，如在美氮唑林和受控回肠释放的布地奈德治疗中，预计会产生抗炎作用。

目前尚不清楚成人体内 LF 在胃肠道 (GI) 中的降解程度。消化可能会降低 LF 在肠道中的生物活性。口服 LF 补充剂可以提供一种营养工具来改善肠道健康，尤其是人类的结肠。然而，要在结肠中发挥任何作用，LF 必须在上消化道运输中存活下来。如果它在胃或小肠中被消化，则在研究其在结肠中的作用时，应通过使用回肠释放胶囊或通过灌肠给药来防止 LF 降解。

我们之前表明，LF 在成人体内的胃中仅部分降解。以前没有在成人体内研究过口服摄入的 LF 在小肠中的代谢命运。本研究旨在使用回肠造口模型确定口服重组人乳铁蛋白 (rhLF) 在人体内上消化道和小肠中的存活率，并量化体内进入结肠的 LF 量。

材料和方法研究

1. 乳铁蛋白补充剂科目。

女志愿者（n= 8) 回肠造口术 [中位年龄 44 (43–57) 岁] 参与了研究。在所有女性中，在参与前至少 3 年进行了全结肠切除术，从而在结肠切除术的初始适应阶段后保持稳定状态。患有克罗恩病的女性只有在过去 3 年内处于缓解状态并且在之前的手术中切除了 < 7.5% 的整个回肠，才被允许参加该研究。除了没有结肠外，这些女性都没有服用任何药物或有任何已知的消化系统异常。所有女性都被口头和书面告知了研究的目的和方案，并在参与前签署了书面知情同意书。该研究得到马斯特里赫特大学医院伦理委员会（马斯特里赫特，

饮食限制。

受试者在调查前一天和调查当天不允许食用任何乳制品，以避免饮食中的 LF 摄入。他们每次都必须食用标准化的饮食。在测试前一天 0800 小时的早餐和 1300 小时的午餐期间，他们可以随意食用任何种类的面包卷和非乳制品饮料。1800 小时的晚餐是准备好的一餐，主要由炒面组成（今天的晚餐 2，Bami Goreng，Honig，Koog a/d Zaan，荷兰）。在测试当天，女性在 1000 小时早餐前不允许食用任何食物。随后，饮食与测试前一天描述的相同。

协议。

隔夜禁食后，受试者于 0800 小时进入实验室。他们喝了一种测试饮料，该饮料含有溶解在 0.10 L 软化水中的 5 g rhLF（由Aspergillus awamori，Agennix，Houston，TX 生产）。在摄入测试饮料后立即按照常规方法丢弃造口流出物袋。在接下来的 14 小时内，通过每隔 2 小时更换一次造口袋收集所有造口流出物。每个造口袋分别放在干冰上的小塑料密封盒中。白天每 2 小时收集一次造口流出物，直至 2200 小时。随后，这些妇女在 0300 和 0800 小时收集回肠流出物。

将 20 个不透射线的塑料颗粒（Sitzmarks Ø 2 mm，Konsyl Pharmaceuticals Fort Worth，TX）添加到每位女性的测试饮料中，总共 160 个颗粒。这些惰性颗粒不能从管腔中吸收，因此为测试回肠流出物中的饮料回收率提供了标志。

测量。

收集后，对每个回肠造口流出物样品进行称重，以确定每 2 小时和 24 小时回肠流出物的总产量。对所有样品进行 X 射线检查，以计算每个样品中不透射线的颗粒的数量，这反映了测试饮料的 GI 传输。在回肠造口流出物样品中，完整 LF 的量通过 ELISA (Lactof-EIA, Biotech, Oxisresearch, Portland, OR) 测定。如在加标的回肠流出物样品中测量的，该测定的重复测量的 CV < 6%。该测定的灵敏度为1μg/L。数据表示为 2 小时内的 LF 排泄量。

研究 2. 基础内源性乳铁蛋白水平

在另一项体内试验中，研究了小肠的内源性 LF 排泄物。在另一天，上述 4 名妇女在当晚最后 5 小时收集回肠流出物。对于大多数回肠造口术患者来说，在 0300 小时排空回肠造口术袋是常见的做法。回肠流出物收集发生在~0300 到 0800 小时。在本次收集前一天，受试者食用与第一次体内研究期间相同的饮食。在这些回肠流出物样品的子样品中，LF浓度通过如上所述的ELISA测量。

统计数据。

在 24 小时期间回肠流出物中排泄的完整 LF 量表示为 2 小时间隔内的 LF 排泄量。使用 Wilcoxon 符号秩检验评估差异。P < 0.05 的差异被认为是显着的。计算每个时间点的中位数（第 10-90 个百分位数）回肠流出物产量和 LF 排泄量，并以盒须显示形式呈现。

结果研究 1. 乳铁蛋白补充剂

在与测试饮料一起摄入的总共 160 个不透射线的塑料颗粒中（在所有实验中合并），在 24 小时的收集期间，有 157 个在回肠流出物中排泄。在摄入后的前 2 小时内，没有颗粒排出。在摄入测试饮料后 4 至 10 小时收集的回肠流出物样品中，147 个药丸被倒入造口袋，而在接下来的 9 小时内只有 10 个药丸被排泄到造口袋中。在最后 5 小时的收集期间，没有排出不透射线的颗粒（表 1）。

表格1

回肠流出物中不透射线的颗粒的排泄作为通过女性回肠造口术者的胃肠道后测试饮料恢复的指标1

八名妇女摄入了一种含有 20 粒不透射线的药丸的测试饮料，总共 160 粒药丸。

在任何 2 小时的收集期中，回肠流出物的产生没有差异。24 小时收集期间的总回肠流出物产量中位数为 616 (456–865) g

图1

8 名女性回肠造口术者在摄入 5 g 重组人乳铁蛋白后的回肠流出物（24 小时）。中位数（第 25-75 个百分位数）显示在方框中，第 10-90 个百分位数显示在须线中。在收集期间以恒定速率产生回肠流出物。

回肠流出物样品的 LF 含量在任何样品中均无差异。中位 2 小时 LF 排泄量为 0.35 (0.28–0.47) μg（[url=]图 2[/url]）。总体而言，每位女性在 24 小时内排泄的中位数为 4.01 (2.75–9.97) μg LF（表 2）。LF 的排泄和不透射线颗粒的回收不相关。

图 2

摄入 5 g 重组人乳铁蛋白后，8 名女性回肠造口术者的回肠乳铁蛋白排泄（24 小时）。中位数（第 25-75 个百分位数）显示在方框中，第 10-90 个百分位数显示在须线中。低浓度的重组或天然人乳铁蛋白以恒定速率出现在回肠流出物中。

表 2女性回肠造口术者口服摄入 5 g 重组人乳铁蛋白后回肠流出物中的乳铁蛋白排泄1


1值为中位数（第 25-75 个百分位数），n = 8。

研究 2. 基础内源性乳铁蛋白水平

在没有摄入 LF 的情况下，四名回肠造口术患者的 5 小时回肠流出物含有 33 (24-52) μg LF/L 回肠造口液。在 LF 补充研究中，这些受试者的 5 小时回肠流出物 LF 浓度中位数为 7 (6–9) μg/L。

讨论

口服含 LF 溶液后，回肠造口流出物中出现少量完整 LF。LF 在 24 小时收集期间以恒定速率排出。测试饮料的转运标志物的回收率和回肠流出物中的LF排泄不相关。

大多数（如果不是全部）胆汁和肠道分泌物中存在的 LF 源自活化的中性粒细胞的特定颗粒。血浆 LF 通过胆汁分泌到肠道。在健康成人中，胆汁 LF 为 ∼1 mg/L，而在 IBD 患者中为 ∼3 mg/L。此外，粪便 LF 被用作 IBD 患者免疫系统激活和疾病活动的诊断标志物。在具有完整胃肠道的健康志愿者的粪便中，LF 排泄量为 210 μg/d，而非活动性溃疡性结肠炎或非活动性克罗恩病患者的排泄量约为 5-6 mg/d。在本研究中，我们发现回肠造口术者的 LF 产量中位数为 4 μg/d。这些观察结果之间的差异可以通过以下假设来解释：胃肠道中 LF 的主要部分源自结肠中的白细胞。这似乎是一个合理的结论，因为白细胞是 LF 的主要来源。我们认为回肠流出物中排泄的 LF 可能来自内源性来源，而不是来自饮食。

第二个体内研究证实了这一点，在该研究中女性没有摄入 LF，但回肠流出物样品的 LF 浓度与在 LF 补充研究期间同一时间段收集的样品相比具有相同或更高的 LF 浓度。两项研究中的流出物 LF 浓度没有显着差异。虽然只有四名受试者参与了第二项研究，但我们得出结论，在两项研究中在回肠流出物中检测到的 LF 均来自内源性来源。

口服摄入的 LF 无法通过小肠存活的观察结果证实了大鼠小肠中 LF 分解研究的结果。在该研究中，表明在牛 LF 的 GI 消化过程中，形成了对真菌和细菌发挥生物活性的较小片段。这意味着尽管 LF 在上消化道和小肠中被完全消化，但口服 LF 可能通过 LF 片段的作用在胃肠道的任何部位发挥作用。由于在复杂的回肠流出物基质中定量分析 LF 碎片的技术限制，我们无法研究这些碎片在回肠流出物中的出现。此外，本研究不排除降解前上消化道中完整 LF 的任何生物活性。

不透射线的颗粒排泄率清楚地表明测试饮料在 24 小时回肠流出物收集期内从小肠排空。正如我们在本研究中所做的那样，这证实了回肠造口模型在研究营养物质的 GI 存活方面的有效性。在两次观察到标志物的不完全恢复。一名志愿者的回肠流出物中两个标记物的遗漏和另一名志愿者的一个标记物的遗漏可能是由暂时保留在肠皱襞中的固体颗粒引起的。我们得出结论，测试饮料在 24 小时收集期间完全从小肠中排空。

使用回肠造口术模型是因为它提供了在测试饮料完全通过上消化道后收集完整回肠流出物的独特机会。因此，可以评估从饮食到结肠的任何营养素的生物利用度。由于参与本研究的回肠造口术患者具有完整的上消化系统，因此这是一种广为接受的方法，用于研究营养物质的消化并将研究结果外推至具有完整胃肠道的受试者。

在回肠造口术中研究 LF 在胃肠道中消化的技术的先决条件是 LF 在排空到回肠造口袋后离体的稳定性。LF 最多可在袋子中停留 2 小时。消化可能会在袋子里继续。因此，我们研究了回肠流出物中的离体 LF 降解。在 37°C 的新鲜回肠流出物中孵育 2 小时期间，我们没有观察到任何 LF 降解（数据未显示）。这与之前的报告一致，在该报告中，健康志愿者的粪便在 37°C 孵育 2 小时期间未观察到 LF 降解。

我们研究了泡盛曲霉生产的重组人 LF 的消化。从三维结构比较显示，这种类型的 rhLF 具有与存在于人类母乳中的天然人类 LF 相同的三维结构。重组和天然人 LF 的动态特性也相似。两种 LF 形式之间的唯一区别是附着在分子上的聚糖的组成，这是由于产生 rhLF 的真菌系统所致。用于定量回肠流出物中存在的完整LF的ELISA方法检测到天然人和rhLF。

先前显示铁结合会影响LF分子的稳定性。铁饱和的 LF (holoLF) 比无铁的 LF (apoLF)更能抵抗降解。本研究中研究的 rhLF 不含铁。这与在自然状态下使用动物源性 apoLF 的研究形成对比，后者的铁饱和度为 15-20%。因此，本研究中使用的 rhLF 可能比动物来源的 LF 更容易受到 GI 降解的影响。

我们发现 rhLF 在通过人类体内的胃和小肠期间完全降解。进入结肠的完整 LF 不太可能源自 LF 的外源性饮食来源。该 LF 可能源自上消化道中活化的中性粒细胞颗粒。因此，如果口服 LF 确实在结肠中发挥作用，则应将 LF 包裹起来以供回肠释放，以防止其在进入结肠之前在 GI 中降解。