CD200–D200 受体在人体血液和淋巴内皮细胞中在调节皮肤组...
CD200–D200 受体在人体血液和淋巴内皮细胞中在调节皮肤组织炎症中的作用CD200 是一种细胞膜糖蛋白，可与其在免疫细胞上表达的结构相关受体 (CD200R) 相互作用。我们表征了人类成人/青少年 (j/a) 和胎儿 (f) 皮肤中的 CD200–CD200R 相互作用，以及通过共培养人类皮肤微血管内皮细胞 (HDMEC) 制备的体内预血管化皮肤替代物 (vascDESS)，其中含有两种血液。 BEC) 和淋巴 (LEC) EC。我们检测到 CD200 在 j/a 和 f 皮肤以及 vascDESS 体内 淋巴毛细血管上的最高表达，而它仅在毛细血管上微弱表达。值得注意的是，在 Podoplanin 表达增强的 LEC 上检测到最高 CD200 水平，而在 Podoplanin 低 LEC 上观察到表达降低。此外，qRT-PCR 分析显示一些趋化因子的表达上调，+ LEC，与 j/aCD200 - LEC 相比。CD200R的表达主要在骨髓细胞如粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、人外周血中的T细胞以及人和大鼠皮肤中检测到。功能性免疫测定表明皮肤来源的 CD200 + HDMEC在体外与骨髓 CD200R +细胞的特异性结合。重要的是，我们证实了体内 vascDESS 中 CD200-CD200R 相互作用的增强。我们得出结论，CD200-CD200R 轴在皮肤伤口愈合过程中调节组织炎症中起关键作用。
一、简介由于先天性疾病或外伤性组织缺陷（例如烧伤）导致的皮肤损失导致其屏障功能的伴随损失。尽管一些具有完整真皮成分的浅表皮肤缺损无需自体移植即可愈合，但深部部分厚度和全层烧伤伤口需要从未受伤部位（供体部位）自体移植健康皮肤并将其放置在原发伤口部位。尽管此类自体移植物是标准的治疗方法，例如对于大面积烧伤，但自体移植物供区通常会导致继发性伤口。此外，这些部位，尤其是原发性伤口，表现出明显的疤痕、挛缩和功能丧失。
生物工程人类真皮-表皮全层皮肤替代物 (DESS)提供了这些自体移植物的替代方案，显示出改善的移植物吸收和减少的收缩、收缩和疤痕。最近，我们小组开发了一种复杂的人类预血管化 DESS (vascDESS)，其中包含成熟的血液和淋巴管网络，通过接种移植后会迅速灌注。通过在三维 (3D) I 型胶原蛋白水凝胶中共培养人原代真皮微血管内皮细胞 (HDMEC) 和人真皮成纤维细胞 (HDF)，在体外自组装器官型毛细血管网络。
在这项研究中，我们对体外和体内 HDMEC 衬里血液和血管 DESS 毛细淋巴管中的 CD200 (OX-2) 表达特别感兴趣。CD200 具有广泛但特定的组织分布，包括某些血管内皮、肾小球、胎盘细胞和神经元。其同源受体 CD200R 主要在骨髓细胞和 B 和 T 细胞的某些亚群上表达。有趣的是，CD200 糖蛋白通过其受体 CD200R 参与巨噬细胞功能的调节以及同种免疫和自身免疫反应的控制。
细胞表面 CD200 分子的存在对于与 CD200R 相互作用以保持组织稳态并避免导致组织损伤的过度免疫反应至关重要。因此，CD200 基因敲除的动物表现出中枢神经系统 (CNS) 的慢性炎症、实验性自身免疫性脑脊髓炎的发作，并且由于损伤对 CD200-CD200R 相互作用的损害而表现出更高的自身免疫反应易感性。在 CNS 之外，发现皮肤中毛囊上皮细胞表达 CD200 会减弱脱发模型中的免疫反应。
此外，CD200 的免疫抑制能力也被证明可以调节中枢和外周神经系统、血管内皮、皮肤和淋巴样细胞 中的组织稳态。先前的研究表明，在体内平衡期间，CD200 维持足够水平的活化 CD200R +巨噬细胞以保持组织完整性，而 CD200 表达减少可减轻巨噬细胞介导的组织损伤。因此，缺乏 CD200 的小鼠表现出活化 CD11b +巨噬细胞和粒细胞数量增加的表型。CD200–CD200R 信号传导抑制细胞因子释放、肥大细胞脱粒和细胞浸润，同时增加 Treg 亚群的吸引或扩增以及 T 细胞效应反应的减少]。此外，有几条证据表明，CD200 的免疫抑制能力也可能通过降低对癌细胞的免疫反应来刺激癌症生长。例如，CD200 在皮肤鳞状细胞癌 (SCC) 、转移性 SCC、慢性淋巴细胞白血病和急性髓性白血病、黑色素瘤、和多发性骨髓瘤。
CD200–CD200R 链接被描述为在调节免疫反应中发挥关键作用，在皮肤伤口愈合过程中也是如此 。因此，CD200–CD200R 链接对于免疫调节和减弱免疫细胞反应至关重要，因此可以减少皮肤伤口的疤痕形成。我们的目的是比较成人和胎儿皮肤的 BEC/LEC，因为妊娠早期妊娠的胎儿伤口可以自发愈合而没有任何疤痕。这是由于免疫细胞反应非常低，并且这些伤口的炎症减少了。我们认为 CD200-CD200R 链接，特别是在 EC 中，可能在该法规中发挥重要作用。
在这里，我们首次报告了人类 CD200 及其同源受体在人类青少年/成人和胎儿皮肤以及生物工程血管中的特征。我们证明 CD200 在体外和体内都在血液和毛细淋巴管上表达，而在外周血来源的单核细胞、粒细胞、NK 和 T 细胞上检测到 CD200R。此外，我们提供的功能分析证实了 CD200-CD200R 相互作用对免疫反应和皮肤伤口愈合的重要性。
2。材料和方法2.1。细胞分离和培养所有实验均根据赫尔辛基原则宣言并经苏黎世州道德委员会许可进行。人皮肤来源的真皮微血管内皮细胞 (HDMEC)、真皮成纤维细胞 (HDF) 和角质形成细胞 (KC) 是从 24 至 26 孕周脊柱裂手术获得的胎儿皮肤中分离和扩增的（苏黎世大学儿童医院，伦理学）批准：BASEC No. PB_2020-00066)，青少年/成人皮肤，包括 18 岁以下儿童的包皮、头皮、手部、腹部、腿部和手臂的皮肤（苏黎世大学儿童医院，BASEC No. 2018-00269）；如前所述 。HUVEC 购自 ScienceCell（订购号 8000，瑞士）并如前所述进行培养。从血沉棕黄层收集血源性免疫细胞。简而言之，通过Ficoll梯度从健康志愿者捐献的血液中分离外周血单个核细胞（PBMC）。根据当地的指导方针，苏黎世献血中心（瑞士红十字会苏黎世输血服务中心，瑞士施利伦；www.zhbsd.ch （2022 年 3 月 18 日访问））的所有献血者都获得了知情的书面同意。伦理委员会。
2.2. 流式细胞术和免疫组织化学流式细胞术：通过流式细胞术分析确定新鲜分离和培养的 HDMEC 和/或 BEC 和 LEC 和免疫细胞的表型。将细胞 (5 × 10 5 ) 在 4 °C 下与一抗和活/死 Zombie Aqua 一起孵育 30 分钟（表 1）。使用同种型匹配的对照抗体进行平行染色（表 1）：
表 1. 流式细胞术中使用的抗体偶联物。
与抗体一起孵育后，用 FACS 缓冲液（0.5% 人血清白蛋白，0.5 mM EDTA 的 PBS 溶液）洗涤细胞两次，然后在 FACS ARIA III 4L（BD Biosciences，Allschwil，Switzerland）上通过流式细胞术进行分析。
免疫组织化学：如前所述（ 表 2）对冷冻切片进行免疫荧光染色。
表 2. 免疫组化染色中使用的抗体。
对于双重免疫荧光，根据制造商的说明（Zenon Mouse IgG Labeling Kit, Molecular Probes, Invitrogen），一些一抗用 Alexa 488、647 或 555 缀合的多克隆山羊 F(ab')2 片段预标记.
2.3. 增殖试验根据制造商的说明 (Cell Counting Kit-8, Sigma, Buchs, Switzerland)，使用比色 Cell Counting Kit-8 试剂盒 (CKK-8) 测定培养的 HDMEC 的增殖能力。简而言之，BEC、CD200 + LEC 或 CD200 -从胎儿和青少年/成人皮肤样品中分离和分选的 LEC（第 1-2 代）以 20,000 个细胞/孔的密度接种在 24 孔板中。为每种细胞类型制备一式三份。随后，细胞在 37°C 下用稀释的 CKK-8 溶液处理 1 小时，然后用酶标仪（BioTek，Winooski，VT，USA）在 450 nm 波长处测量吸光度。该程序每隔一天重复一次，持续 11 天。OD 值反映了活细胞的数量。在每个时间点计算平均吸光度值和 SD。
2.4. 细胞活力测定对于 j/aHDMECs（BEC:LEC 的混合物）的活力测定，同时用 FdA（80 μg/mL；Sigma F7378，Buchs，Switzerland）、PI（200 μg/mL；Sigma P4864，Buchs，Switzerland）对细胞进行染色, 和 Hoechst 33342 (1 μg/mL; Sigma B2261, Buchs, Switzerland)。对于 Ki67/CD31 染色，未处理的细胞在 -20°C 下用丙酮/甲醇（1:1）固定 5 分钟，然后如上所述染色（“免疫组织化学”部分）。每隔一天进行一次活力测定和 Ki67/CD31 染色，持续 11 天。
2.5. 免疫测定分类 CD200 +/-将 BEC 和 LEC 接种到 24 孔板上并培养至汇合。一旦达到汇合，就从新鲜的全人类血液中分离外周血单个核细胞 (PBMC)。为此，用 PBS (1:1) 稀释血沉棕黄层（瑞士红十字会苏黎世输血服务中心，瑞士 Schlieren），然后轻轻涂抹在等体积的 Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare，Opfikon，Switzerland）上，然后然后在没有刹车的情况下以 400 g 离心 30 分钟。离心后，除去 PBMC 部分，转移到新的 Falcon 管中，随后用 PBS 洗涤两次。分离后，立即将 PBMC（FACS ARIA III 4L（BD Biosciences，Wokingham，UK）分选为已显示表达 CD200 受体（CD200R）的不同淋巴细胞亚型。接下来，根据制造商的说明，用 CellTracker Deep Red Dye（Invitrogen，Zug，Switzerland）对粘附的内皮细胞进行染色，并用 CellTracker Red CMTPX Dye（Invitrogen，Switzerland）对分选的淋巴细胞进行染色。然后将染色的细胞在培养箱中于 37°C 共培养 30 分钟。然后将淋巴细胞添加在内皮细胞上并在 37°C 下再放置 30 分钟。在最后一步中，所有细胞都用 Hoechst 33342（Sigma-Aldrich，Buchs，Switzerland）染色，固定在 PFA（4%）中，并在共聚焦显微镜（Leica SP8 inverse CLSM）上进行分析。使用 Fiji (ver. 1.53i, NIH, Bethesda, MA, USA) 通过计算免疫细胞与内皮细胞的数量 (免疫细胞/EC 比率) 进行量化。根据制造商的说明，用 CellTracker Red CMTPX Dye (Invitrogen, Switzerland) 对分选的淋巴细胞进行染色。然后将染色的细胞在培养箱中于 37°C 共培养 30 分钟。然后将淋巴细胞添加在内皮细胞上并在 37°C 下再放置 30 分钟。在最后一步中，所有细胞都用 Hoechst 33342（Sigma-Aldrich，Buchs，Switzerland）染色，固定在 PFA（4%）中，并在共聚焦显微镜（Leica SP8 inverse CLSM）上进行分析。使用 Fiji (ver. 1.53i, NIH, Bethesda, MA, USA) 通过计算免疫细胞与内皮细胞的数量 (免疫细胞/EC 比率) 进行量化。根据制造商的说明，用 CellTracker Red CMTPX Dye (Invitrogen, Switzerland) 对分选的淋巴细胞进行染色。然后将染色的细胞在培养箱中于 37°C 共培养 30 分钟。然后将淋巴细胞添加在内皮细胞上并在 37°C 下再放置 30 分钟。在最后一步中，所有细胞都用 Hoechst 33342（Sigma-Aldrich，Buchs，Switzerland）染色，固定在 PFA（4%）中，并在共聚焦显微镜（Leica SP8 inverse CLSM）上进行分析。使用 Fiji (ver. 1.53i, NIH, Bethesda, MA, USA) 通过计算免疫细胞与内皮细胞的数量 (免疫细胞/EC 比率) 进行量化。然后将淋巴细胞添加在内皮细胞上并在 37°C 下再放置 30 分钟。在最后一步中，所有细胞都用 Hoechst 33342（Sigma-Aldrich，Buchs，Switzerland）染色，固定在 PFA（4%）中，并在共聚焦显微镜（Leica SP8 inverse CLSM）上进行分析。使用 Fiji (ver. 1.53i, NIH, Bethesda, MA, USA) 通过计算免疫细胞与内皮细胞的数量 (免疫细胞/EC 比率) 进行量化。然后将淋巴细胞添加在内皮细胞上并在 37°C 下再放置 30 分钟。在最后一步中，所有细胞都用 Hoechst 33342（Sigma-Aldrich，Buchs，Switzerland）染色，固定在 PFA（4%）中，并在共聚焦显微镜（Leica SP8 inverse CLSM）上进行分析。使用 Fiji (ver. 1.53i, NIH, Bethesda, MA, USA) 通过计算免疫细胞与内皮细胞的数量 (免疫细胞/EC 比率) 进行量化。
2.6. 克隆基因测定为了评估 CD200 -和 CD200 + LEC 在体外形成菌落的潜力，我们进行了克隆形成试验。将分选的 CD200 -和 CD200 + LEC（分别为 200、600 和 1000）接种到 EGM-2MV 培养基（Lonza，Basel，Switzerland）中涂有明胶的 6 孔中。接种后，让细胞增殖 14 天，每 2 天更换一次培养基。在第 14 天，吸出培养基并用 DPBS（Invitrogen，Zug，Switzerland）洗涤细胞一次。接下来，将 3 mL 的 6% 戊二醛和 0.5% 结晶紫溶液（均在水中稀释，所有 Sigma-Aldrich，Buchs，Switzerland）添加到每个孔中 30 分钟，然后小心地取出。用水洗涤细胞并使其干燥。用肉眼计数细胞集落。
2.7. 定量逆转录聚合酶链反应根据制造商的方案（RNeasy，Qiagen，Hombrechtikon，Switzerland），从在培养皿上生长或直接在 FACS 分选后的培养细胞中分离总 RNA，包括去除基因组 DNA 的 DNA 酶处理。每个条件收集三个生物重复。使用 Epoch 分光光度计 (Take3 micro-volume plate, BioTek, Lucerne, Switzerland) 评估 RNA 纯度。只有吸收比为 A 260 /A 280 ~2.0-2.1 和 A 260 /A 230 ~2.1-2.3 的纯 RNA 用于 qRT-PCR。RNA 储存在 -80 °C 直至进一步使用。qRT-PCR 根据已发布的方案进行。首先，按照制造商的说明，使用 GoScript 逆转录酶试剂盒（Promega，Madison，WI，USA）将单链 RNA 转化为 cDNA。使用 SYBR 绿色化学 (PowerTrack SYBR Green Master Mix, Invitrogen, Zug, Switzerland)以技术一式三份 ( n = 3)进行 qRT-PCR 。每个 10 μL 反应含有 5 ng cDNA，扩增步骤在 QuantStudio 7 Pro 实时 PCR 系统（Applied Biosystems，Invitrogen，Zug，Switzerland）上进行。所有数据均标准化为 GAPDH，并使用具有效率校正的 2 -ΔΔCT方法（Pfaffl 方法）进行量化。除 TGF-B1和 CD200外，所有引物均由我们自己设计]（表 3）。
表 3. qRT-PCR 分析中使用的引物。
2.8. vascDESS 和非 vascDESS 的制备如前所述制备 I 型胶原蛋白水凝胶。总共将 1 × 10 5个细胞（EC 和成纤维细胞 1:1）重新悬浮在 1 mL 的胶原凝胶中。将凝胶置于孔径为 3.0 μm 的膜（BD Falcon，Kaiserslauten，Germany）的 6 孔细胞培养插管中，并在 37 °C 下在含有 5% CO 2的加湿培养箱中保持 30 分钟。在聚合期之后，将 EGM-2MV (Lonza, Basel, Switzerland) 添加到孔/插入物的上下室中，并将水凝胶孵育两周。然后，水凝胶被角质形成细胞（7.5 × 10 4 /凝胶）覆盖，再培养一周，然后移植到免疫功能不全的大鼠身上[ 2 ]。
2.9。组织工程皮肤替代物的移植手术方案经当地实验动物研究委员会（苏黎世州兽医办公室，许可号 ZH045/2019）批准。免疫功能不全的雌性 nu/nu 大鼠，8 至 10 周大（Envigo，Horst，荷兰），通过吸入 5% 异氟醚（Baxter，Volketswil，Switzerland）麻醉并通过面罩吸入 2.5% 异氟醚维持。真皮-表皮皮肤替代物被移植到大鼠背部形成的全层皮肤伤口上。
vascDESS 和非 vascDESS（三个独立的 HDMEC 供体，每个条件n = 2 只大鼠（每个条件n = 6：1 和 3 周；总共 12 个 vascDESS 和 12 个非 vascDESS）移植到准备好的全层皮肤缺损处在大鼠的背部。为了防止周围大鼠皮肤的伤口闭合，使用不可吸收的聚酯缝合线（Ethibond ®）将定制的钢环（直径 2.6 厘米）缝合到全层皮肤缺损处。，爱惜康，力登，新泽西州，美国）。然后用硅胶箔（Silon-SES, BMS, New York, NY, USA）、聚氨酯海绵（Ligasano, Ligamed, Innsbruck, Austria）、粘性适形绷带（Sincohaft, Theo Frey AG, Bern,瑞士），以及作为伤口敷料的胶带。每周进行一次换药和摄影记录。使用二氧化碳对动物实施安乐死，并在7天和21天后通过整体切除收获移植的皮肤类似物并进行免疫组织化学分析。
2.10。体内血液和毛细淋巴管上 CD200 和 CD200R 的定量使用 Fiji 图像分析软件 (ver. 1.53i, NIH）。对 10 倍放大倍率下的整个视野区域进行计数（n = 12 vascDESS 和n = 12 非 vascDESS 体内活检）。首先，在正常 j/a 和 f 人体皮肤中对血液 (CD31 + Podo - ) 和淋巴 (CD31+Podo+) 毛细血管进行量化。然后，在正常 j/a 和 f 人类皮肤中的血液和毛细淋巴管上对 CD200 表达进行量化。
对于一些实验，CD31 + CollIV +或 CD31 + Podo +分别被确定为血液或毛细淋巴管。此外，在人类皮肤和血管中的那些血液 CD31 + CollIV +或淋巴 CD31 + Podo +毛细血管上评估了 CD200 表达。此外，在人类皮肤和非 vasc/vascDESS 类似物的人类 CD90 阳性真皮中评估人类 CD200R 表达。
2.11。统计分析所有结果均以平均值±标准差报告。使用 GraphPad Prism 4.0（Graph Pad 软件，La Jolla，CA，USA）进行统计分析。使用双尾非配对学生t检验进行两组之间的比较，并使用具有 Bonferroni 多重比较检验的双向 ANOVA 进行多组之间的比较。
* 表示p值 0.01 到 0.05（显着）
** 表示p值 0.001 到 0.01（非常显着）
*** 表示p < 0.001（极显着）
**** 表示p < 0.0001（极显着）
ns = 不显着 ( p > 0.05)
3. 结果3.1。CD200 在正常人类青少年/成人和胎儿皮肤中表达通过免疫荧光在正常人青少年/成人 (j/a) 皮肤以及胎儿 (f) 皮肤中检查 CD200 配体在毛细血管上的分布（图 1）。为了区分人血和毛细淋巴管，我们分别用人 CD31（红色，图 1a，b）和 podoplanin（白色，图 1a '，b'）抗体对它们进行了特异性染色。
图 1. 正常人类青少年/成人和胎儿皮肤中 CD200 表达的评估。( a – a''' ) 免疫荧光三重染色的青少年/成人 (j/a) 人类皮肤，用针对人类毛细血管 (红色) 的CD31 ( a ) 抗体，描绘人类淋巴管内皮 (白色) 的 podoplanin ( a' )，和 CD200（a''）（绿色）。( a''') 表示合并的共焦 Z 堆栈。毛细血管仅染色 CD31 +（空箭头），而淋巴毛细血管是 CD31 + Podo +（白色箭头）。注意毛细血管的存在（CD31 + Podo -) 主要为 CD200 阴性（空箭头），以及显示 CD200 标记（白色实心箭头）表达的毛细淋巴管 (CD31 + Podo + )。( b – b''' ) 人类胎儿皮肤 (f skin) 针对 CD31 ( b ) 描绘人类毛细血管 (红色)、podoplanin ( b' ) 描绘人类毛细淋巴管 (白色) 和 CD200 ( b' ) 的免疫荧光三重染色'）（绿色）。注意表达 CD200 的血液和毛细淋巴管的存在（分别为空白箭头和实心箭头）。( b''' ) 表示合并的叠加层。( c) j/a 和 f 皮肤中血液和淋巴毛细血管的量化。在 j/a 的真皮中，毛细血管约占 68.8 ± 13%，而淋巴内皮占该皮肤类型中所有血管的 31.0 ± 10.6% (*** p < 0.0001)。在 f 皮肤中，血液内皮占 73.0 ± 19%，而淋巴管占所有毛细血管的 27.0 ± 13% (** p < 0.001)。( d ) j/a 或 f 皮肤血液和毛细淋巴管上 CD200 表达的量化。请注意，与 j/a 毛细血管相比，j/a 毛细淋巴管上 CD200 的表达显着更高（分别为 67.0 ± 16% 和 14.0 ± 2.0%，*** p< 0.0001)，而 CD200 在人类 f 皮肤的血液和毛细淋巴管中的表达相似（分别为 44.0 ± 8.0% 和 64.0 ± 5.0%，p = ns），n = 5 个独立的 j/a 和胎儿皮肤供体每个。细胞核用 Hoechst（蓝色）染色。比例尺 100 μm。
通过对 PROX1 的免疫荧光分析进一步证实了人类 j/a 和 f 皮肤中 podoplanin/CD31 阳性毛细血管的染色，PROX1 是一种核淋巴谱系标记物（补充图 S1a-d）。因此，podoplanin 和 PROX1 可互换用作本研究中各种分析的淋巴标志物。
虽然 j/a 和 f 皮肤样本的毛细血管仅 CD31 阳性（空箭头），但毛细淋巴管显示 podoplanin（一种淋巴内皮特异性标志物）的表达，以及微弱的 CD31 共表达（白色箭头）。与毛细淋巴管的数量（CD31 + Podo + ）相比，位于两种皮肤类型真皮中的毛细血管的总体量化显示毛细血管（CD31 + Podo - ）的数量显着增加（图1c）。具体来说，在 j/a 皮肤中，毛细血管占 68.8 ± 13.0%，而毛细淋巴管占该皮肤类型所有毛细血管的 31.0 ± 10.6% ( p< 0.0001)。在胎儿皮肤中，毛细血管占 73.0 ± 19.0%，而毛细淋巴管占所有毛细血管的 27.0 ± 13.0% ( p < 0.001)。
此外，我们在 j/a（图 1a '''）以及 f 皮肤（图1b'''）中检测到 CD31 + Podo -毛细血管和 CD31 + Podo +淋巴毛细血管上的 CD200。与 j/a 皮肤真皮中的毛细血管 (16 ± 97%) 相比，定量显示 CD200 在淋巴管 (68 ± 73%) 上的表达增强 ( p = 0.0004) (图1d)。相比之下，胎儿皮肤淋巴管 (64 ± 5%) 和毛细血管 (44 ± 8%) 的 CD200 表达差异无统计学意义 ( p = ns)。
3.2. CD200 在体外 j/a 和胎儿 HDMEC 人群中的表达不同通过流式细胞术分析来自 j/a 和 f 皮肤的新鲜分离和体外培养 (P1) HDMEC 的 CD200 表达（图 2）。人 CD31 和 podoplanin 抗体用于鉴定人血液和淋巴微血管内皮细胞。此外，详细的门控策略在补充图 S2中进行了描述。
图 2. CD200 在新鲜分离的以及体外培养的青少年/成人和胎儿 HDMEC 上的表达。( a ) 来自 j/a 人皮肤的新鲜分离的 HDMEC 的流式细胞术分析。CD31和podoplanin用于区分血液内皮细胞（BEC，CD31 + Podo -）和淋巴管内皮细胞（LEC，CD31 +Podo +）。从新鲜分离的 j/a 中获得的 HDMEC 含有 60.13 ± 17.35% 的 j/aBEC。请注意，存在两个不同的 LEC 亚群，表达不同水平的 podoplanin，即 LEC Podo High，占 26.8 ± 6.75%，以及 LEC Podo Low，占所有新鲜分离的 j/aHDMEC 的 11.5 ± 2.95%。(d、e ) 新鲜分离的 j/aBEC 和 Podo High和Podo Low LEC中 CD200 表达的流式细胞术分析。虽然只有 12.91 ± 5.86% 的新鲜收获的 j/aBEC 对 CD200 染色呈阳性，但 58.73 ± 16.97% 的所有 j/aLEC 表达了这种标记。请注意，LEC Podo High对 CD200 几乎完全阳性 (98.1 ± 15.6%) ( b , e )，而 LEC Podo Low仅表现出该标记的中度表达 (36.9 ± 5.1%) ( p = 0.0041) ( c , e)。( f -我) 对来自 j/a 皮肤的第 1 代 (P1) 培养的 HDMEC 进行流式细胞术分析。培养的 j/aHDMEC 包含大约 67.5 ± 18.21% 的 BEC 以及 31.8 ± 10.35% 的 LEC ( f )。虽然 11.3 ± 2.0% 的培养 j/aBEC 表现出 CD200 表达 ( g , i )，但培养的 j/aLEC 数量显着增加为 CD200 阳性 (48.7 ± 17.2, p < 0.0001) ( h , i )。( j - m ) (P1) 处培养的 fHDMEC 的流式细胞仪分析，包括 58.4 ± 17.4% 的 fBEC 和 41.6 ± 11.5 的 fLEC。此外，9.06 ± 2.0% 的 fBEC 显示 CD200 (k,m) 的表达，而 51.9 ± 15.7% 的 fLEC 对 CD200 (l,m) 呈阳性 ( p< 0.0001)。ns = 不显着 ( p > 0.05)的双向非配对学生t检验；** 对于p值 0.001 到 0.01（非常显着）；p< 0.001（极显着）的*** 用于统计分析， n = 5 个独立的 j/a 和胎儿皮肤供体。
流式细胞术分析显示在新鲜分离的 j/aHDMEC 中存在 CD31 + Podo -血液内皮细胞 (BEC)，占所有 HDMEC 的 64.13 ± 11%（图2a ）。此外，我们在新鲜分离的 HDMEC 部分中总共检测到 35.9 ± 8% CD31 + Podo +淋巴管内皮细胞 (LEC) (图2a )。
CD200 在新鲜分离的 j/aBEC 上的表达相对较低，占 12.9 ± 5.9%，而在所有 j/aLEC 上检测到 CD200 的比例为 58.73 ± 17% ( p = 0.0004) (图2d)。
此外，我们观察到在新鲜分离的 j/aHDMEC 中存在两个不同的 CD31 + Podo +淋巴管内皮细胞 (LEC) 亚群，其特征在于不同的 podoplanin 表达水平，即 LEC Podo High (25.4 ± 7.2%)以及 LEC Podo Low (10.5 ± 2.4%) (图2a )。进一步分析表明，LEC Podo High对 CD200 几乎完全阳性（98.8 ± 15.6%）（图2b、e），而 LEC Podo Low显示 CD200 表达显着降低（36.9 ± 5.1%）（图2c、e ） ）。
新鲜分离的 j/aHDMEC 在体外进一步培养，并在 HDMEC 第 1 代（P1，第一次传代后的细胞）细胞上重复有关 CD200 表达的流式细胞术分析。因此，我们在培养的 j/a P1 HDMEC 中鉴定了大约 66.7 ± 16.2% 的 BEC 和 33.3 ± 7.5% 的 LEC。此外，我们仅发现 BEC 上 CD200 的表达较弱（11.3 ± 2%），而 LEC 上的 CD200 表达显着增强，占 48.7 ± 17.2%（p < 0.0001）（图 2 i）。LEC Podo Low种群在 P1 时已经在培养的 LEC 中丢失。
由于人类胎儿皮肤活检的体积小，因此总真皮细胞混合物中 HDMEC 的数量很少，因此无法对新鲜分离的胎儿内皮细胞进行流式细胞术分析。对培养的胎儿 P1 HDMEC 的分析显示 fBEC（胎儿 BEC）约占所有内皮细胞的 58.9 ± 12.5%，只有 9.06 ± 2.0% 的 fBEC 显示 CD200 的表达（图 2 j-m）。相比之下，fLEC（胎儿 LEC）约占所有 fHDMEC 的 41.1 ± 9.3%，其中 51.9 ± 15.7% 的细胞表达 CD200 标记（图 2 j-m）。因此，与 fBEC 相比，fLEC 上的 CD200 表达显着增强（p < 0.0001）（图 2 m）。
两个亚群的存在，即 LEC Podo High和 LEC Podo Low，在体外 P1 的培养（体外扩增）j/a 和 fHDMEC 上几乎检测不到，因此，没有进一步分析。
3.3. CD200 + LEC 在体外显示出比 CD200 - LEC 和 BEC更高的增殖率CD200 + LEC 和 CD200 - LEC 以及从 j/a 和 f 皮肤衍生和培养的供体匹配的 BEC 通过荧光激活细胞分选 (FACS) 分离并用于体外比色细胞计数测定 (图 3a )。使用源自 j/a 皮肤样本的细胞的增殖测定显示，与 j/aCD200 - LEC（绿线； d1/d5：p > 0.05 (ns)；d3：p < 0.05) 和 BEC（红线；j/aBEC 与 j/aCD200 + LEC：d1/d3：0.05 (ns)；d5：p< 0.01)。有趣的是，从增殖试验的第 7-11 天开始，与 j/aCD200 - LEC 和 j/aBEC相比， j/aCD200 + LEC 的群体表现出较低的循环率。双向 ANOVA 比较显示以下显着性：d7–d11：p < 0.001 (j/aCD200 + vs. j/aCD200 - LEC) 和 d7–d11：p < 0.001 (j/aBEC vs. j/aCD200 + LEC) .
图 3. 体外幼体/成人 (j/a) 和胎儿 (f) CD200 +/- LEC 和 BEC 的增殖率。( a )从 j/a 皮肤样本中分离的 CD200 +和 CD200 - BEC 和 LEC增殖率的图形表示。以每孔 5 × 10 3 个细胞的浓度（6 孔板）接种细胞，并在接种后 11 天通过比色细胞计数测定确定它们的数量。与 j/aCD200 相比， J/aCD200 + LEC（紫线）在测量的前 5 天显示出更高的增殖率-LEC（绿线）和 j/aBEC（红线）。反过来，从检测期间的第 7 天到第 11 天，j/aBEC 显示出最高的循环率。同时，j/aCD200 + LEC 显示出较低的增殖率作为 j/aCD200 - LEC。这两个细胞群的双向 ANOVA（方差分析）比较显示以下显着性：d1/d5：p > 0.05 (ns)；d3：p < 0.05；d7–d11：p < 0.001)，而 j/aBEC 与 j/aCD200 + LEC 的比较显示以下值：d1/d3：0.05 (ns)；d5：p < 0.01；d7–d11：p < 0.001。( b ) 在检测的第 1-5 天，fCD200 +从胎儿皮肤中分离出的 LEC（紫线）与 fCD200 - LEC（绿线；d1/d5：p > 0.05 (ns)；d3：p< 0.05）相比，增殖速度稍慢，但与之相比它更高到 fBEC (d1–d3: p > 0.05 (ns); d5 p < 0.01)。此外，与 fCD200 - LEC (d5: p > 0.05 (ns); d7–d11: p < 0.001) 和 fBEC (d5: p < 0.01 )相比，从第 5-11 天开始，fCD200 + LEC 群体表现出最高的循环率; d7–d11: p < 0.001)。因此，fBEC 表现出中等增殖率，循环值介于 fCD200 +LEC 和 fCD200 - LEC 在检测的第 5-11 天内。显示了n= 6 (j/a) 和n = 3 (f)的代表性实验（ n = 一式三份进行的不同生物样品）。采用 Bonferroni 多重比较检验的双向 ANOVA，ns = 不显着 ( p > 0.05)；* 对于p值 0.01 到 0.05（显着）；*** p < 0.001（非常显着）用于统计分析（绿色表示 CD200 +LEC/CD200 - LEC 比较；紫色表示 CD200 +与 BEC 比较）。( c) 在含有 BEC/LEC 的初级 j/aHDMEC 中以 2 天的间隔评估生存力的活死测定。数据显示，即使在单层 HDMEC 培养中达到汇合后，细胞存活率也很高。( d ) CD200 +和 CD200 -淋巴管内皮细胞 (LEC) 的克隆形成测定。菌落数量的量化显示 CD31 + Podo + CD200 +形成 32 ± 11.0 和 CD31 + Podo + CD200 - 37.7 ± 2.08 ( p = 0.4351, ns) 淋巴管内皮细胞在细胞接种后 14 天形成相似数量的菌落。n= 每人 3 名独立的皮肤捐赠者。实验一式三份进行。比例尺 100 μm。
从胎儿皮肤分离的 HDMEC 的增殖试验显示，与 fCD200 - LEC（绿线）相比， fCD200 + LEC（紫线）的增殖速度稍慢，而在试验的第 1-5 天，fCD200 + LEC 的增殖速度快于 fBEC （图3b）。相比之下，从第 5-11 天起，fCD200 + LEC 群体与 fCD200 - LEC (d5: p > 0.05; d7-d11: p < 0.001) 和 fBEC (d5: p < 0.001)相比表现出最高的循环率。因此，fBEC 表现出中等增殖率，循环值介于 fCD200 + LEC 和 fCD200 -检测后 5-11 天内的 LEC。
在包含 BEC 和 LEC 群体的原代 j/aHDMEC 上进行的细胞活力染色在 11 天的培养期间显示出高细胞活力（图3c）。此外，Ki67 染色表明 Ki67+ 细胞的分数在第 9 天最高，之后增殖细胞的数量再次减少（图3c）。因此，代谢活动是细胞分裂之前增殖的主要指标。
此外，Wakabayashi 等人。将 CD200 +鉴定为具有增强的克隆扩增潜力的小鼠组织驻留血管内皮干细胞的标志物之一。为了研究本研究中使用的人类 j/a CD200 +和 CD200 - LEC 的这些特征，我们进行了菌落形成测定（图3d）。量化显示 j/aCD200 + LEC 在胶原蛋白 I 包被的培养皿上形成 32 ± 11.0 个菌落和 j/aCD200 - LEC 37.7 ± 2.08 个菌落。因此，两个 j/aCD200 + /CD200 - LEC 部分都表现出相似的集落形成能力 ( p = 0.4351)。
3.4. 特定的粘附分子、淋巴标志物和趋化因子在不同的 HDMEC 人群中的体外表达不同为了确定不同 j/aHDMEC 群体中的基因表达，细胞被收获、培养、在 P0 分离成 CD200 - /CD200 + LEC 和 CD200 - BEC 级分，并用于 qRT-PCR 分析。将基因表达水平标准化为 GAPDH，并相对于 CD200-BEC 群体计算每个样品的表达水平。我们根本没有使用成纤维细胞进行任何类型的标准化或一般在此分析中（图 4）。
图 4. 不同 LEC 和 BEC 级分中的基因表达分析。从 j/a 皮肤收获 HDMEC，培养，在 P0 分离为 CD200 - /CD200 + LEC 和 CD200 - BEC 级分，并直接用于 qRT-PCR。将相对基因表达水平标准化为 GAPDH 管家基因，并相对于 CD200 - BEC 样品显示。( a - c ) 粘附分子分析证实，与 j/aCD200 - LEC (2.88 ± 0.6; p < 0.0001) 和 j/aCD200 -相比，j /aCD200 + LEC (31.70 ± 0.67)中 CD200 mRNA 上调 11 倍BEC (1 ± 0.41; p < 0.0001) (一）。与 j/aCD200 - LEC (2.68 ± 0.54; p = 0.0107) 和 j/aCD200 -BEC (1 ± 0.5; p = 0.0003 ) 相比，另一种粘附分子 CD157 也富含 j/aCD200 + LEC (4.44 ± 0.48) ) ( b )。与 j/aCD200 - LEC(0.43 ± 0.35; p = 0.5773, ns) 和 j/aCD200 - BEC (1.0 ± 0.25; p = 0.0186) ( c )。( d , e ) 评估淋巴标志物的 mRNA 表达。J/aCD200 +与 j/aCD200 - LEC (PROX1: 43.55 ± 0.78, podoplanin: 55.13 ± 0.76; p < 0.0001) 和 j/aCD200 - BEC相比，LEC 显示 PROX1 (66.34 ± 0.74) 和 podoplanin (76.93 ± 0.77) 的表达上调（PROX1：1 ± 0.41，podoplanin：1 ± 0.09；均p < 0.0001）。( f , g ) 趋化因子 CCL27 和 CCL21 表现出不同的 mRNA 表达，而在 j/aCD200 + LEC (2.32 ± 0.11) 中 CCL27 mRNA 下调，在 j/aCD200 - LEC 中 CCL27 mRNA 上调 (9.96 ± 0.30; p < 0.0001)与 j/aCD200 - BEC 表达相比 (1 ± 0.33; p= 0.0018)。相比之下，CCL21 在 j/aCD200 + LEC (19.86 ± 0.41) 中显着上调，而 CCL27 在 j/aCD200 - LEC中的 mRNA 水平降低(11.17 ± 0.66; p < 0.0001)。每个条形代表n = 3 个生物样品的平均值 ± SD。使用土耳其的多重比较检验使用单向方差分析对实验组进行比较。星号表示重要性如下：* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001；和 **** p < 0.0001。
值得注意的是，与 j/aCD200 - LEC (2.88 ± 0.6; p < 0.0001) 和 j/aCD200 - BEC (1 ± 0.41；p < 0.0001）（图 4 a）。与 j/aCD200 -LEC (2.68 ± 0.54; p = 0.0107) 和 j/aCD200 - BEC (1 ± 0.5; p = 0.0003 ) 相比，另一种粘附分子 CD157 也富含 j/aCD200 + LEC (4.44 ± 0.48) ) (图 4 b)。然而，j/aCD200 +中 CD62P 选择素 mRNA 的表达降低LEC (0.22 ± 0.09)，而在 j/aCD200 - LEC (0.43 ± 0.35; p = 0.5773, ns) 中增强并归一化为 j/aCD200 - BEC (1.0 ± 0.25; p = 0.0186) (图 4 c) . 其他黏附分子如 CD54、细胞间黏附分子 2（ICAM2；CD102）、血管细胞黏附分子 1（VCAM-1；CD106）和连接黏附分子 A（CD321；F11R）的表达在不同细胞间没有显着差异。内皮细胞群（数据未显示）。
此外，对 PROX1 和 podoplanin 的 mRNA 表达的评估揭示了 j/aCD200 + LEC 中两种标志物的上调（分别为 66.34 ± 0.74 和 76.93 ± 0.77）（图 4 d，e）。相比之下，在 j/aCD200 - LEC中 PROX1 (43.55 ± 0.78; p < 0.0001) 和 podoplanin (55.13 ± 0.76; p < 0.0001) mRNA 显着降低，在 j/aCD200 - BEC (PROX1: 1 ± 0.41；p < 0.0001，podoplanin：1 ± 0.09；p < 0.0001）。
此外，我们研究了趋化因子如 CCL21 和 CCL27 在 mRNA 水平上的表达（图 4 f，g）。虽然 CCL21 在 j/aCD200 + LEC (19.86 ± 0.41)中显着上调，但在 j/aCD200 - LEC (11.17 ± 0.66; p < 0.0001) 和 j/aCD200 - BEC (1 ± 0.25; p < 0.0001) (图 4 f)。相反，相对于 j/aCD200 - BEC 1 ± ，在 j/aCD200 + LEC (2.32 ± 0.11) 中 CCL27 mRNA 表达下调，而在 j/aCD200 - LEC (9.96 ± 0.30; p < 0.0001)中 CCL27 基因表达上调0.33 ( p= 0.0018) (图 4 g)。
3.5. CD200R 在人和大鼠免疫细胞的不同亚群上表达由于 CD200R 参与皮肤炎症期间的免疫抑制活性，并被证明可以提高移植物的取用率和存活率，因此我们试图确定 CD200R 在人和大鼠免疫细胞的不同亚群中的表达。
首先通过 FACS 验证从人外周血 (PBMC) 分离的免疫细胞上的 CD200R 表达，然后分选各个细胞（补充图 S4）。因此，粒细胞首先通过侧向散射进行门控，然后评估 CD11b（整合素 α M）、CD15 和 CD200R 标志物的表达，以分离 CD11b + CD15 + CD200 +粒细胞群。该粒细胞部分对泛粒细胞标志物 HIS48 也呈阳性（数据未显示）。分析显示，70% ± 15.7 的人血粒细胞表现出 CD200R +表达（n = 3 名献血者）（补充图 S4a，a''）。
此外，使用在 T 细胞发育的所有阶段都存在的低前向/侧向散射和 CD3 标记，我们确定了人类血液 PBMC [ 43 ]中的 CD3 + T 细胞群（补充图 S4b，b''）。T 细胞表现出 CD200R 的高表达，占该子集的 95% ± 22.5。该子集还包含以 CD3 + CD56 +共表达为特征的人类自然杀伤 T 细胞 (NKT) 。
此外，在人血 PBMC 中鉴定了也在低前向/侧向散射和 CD14 标记上门控的人单核细胞亚群（补充图 S4c，c'）。详细地，我们检测到两个 CD14 +血细胞群：经典 CD14 + CD16 -和表达 CD200R的非经典 CD14 + CD16 +单核细胞。CD200R 在经典 CD14 + CD16 -单核细胞（75% ± 19.2）（补充图 S4c''）和非经典 CD14 + CD16 +单核细胞（70% ± 15.5）上的平均表达相似。
此外，在大鼠淋巴结中的免疫细胞上评估了 CD200R 的分布。我们使用大鼠特异性泛骨髓抗体检测了大鼠骨髓细胞上的 CD200R 表达（补充图 S9a-c）。此外，HIS48 阳性大鼠粒细胞和表达 CD68 的单核细胞/巨噬细胞在天然大鼠淋巴结中也对 CD200R 呈阳性（分别为补充图 S9d-i）。
3.6. CD200 和 CD200R 在体外内皮-免疫细胞-细胞相互作用中的作用使用细胞粘附测定法进一步研究了 CD200 配体与表达 CD200R 的免疫细胞的相互作用（图 5）。不同的 EC 群体，如 j/aCD200 +和 CD200 - LEC 和 HUVEC 与人类血液来源的粒细胞和/或 T 细胞共培养，并使用共聚焦显微镜观察。我们证实 HUVEC 是 CD31 +但完全缺乏 podoplanin 的表达（补充图 S6a，a'），类似于真皮 BEC 部分的表达模式。此外，HUVEC 缺乏 CD200 的表达，因此被用作细胞粘附测定的阴性对照（补充图 S5b，b'）。
图 5. 人类免疫细胞对不同内皮细胞 (EC) 群体的细胞粘附试验。( a - c ) HUVEC (CD200 - ) ( a )、j/aCD200 - ( b ) 和 j/aCD200 + LEC ( c )（均预先标记为红色）与分离的人血源性粒细胞和T 细胞（全部预先标记为绿色）。( d ) 细胞粘附试验显示，粘附于 CD200 -细胞：HUVEC ( a ) 和 j/aLEC ( b )的预标记人粒细胞和 T 细胞数量减少) 与两种免疫细胞类型在体外与 j/aCD200+ LEC ( c )的高度结合相比。( d ) 免疫细胞与 EC 比率的量化证实，人类血液来源的粒细胞和 T 细胞表现出对 j/aCD200 + LEC 的特异性粘附，而这些免疫细胞没有表现出对 CD200 - EC 的粘附。因此，评估的 CD200R +粒细胞 (9.77 ± 2.58) 和 T 细胞 (4.27 ± 1.59; p = 0.99 (ns)) 与 HUVEC 的粘附率较低，与 j/aCD200 - LEC (11.11 ± 3.19 和 11.84 ± 0.93；p = 0.99 和p= 0.99 (ns)，分别）。此外，数据显示，对于 j/aCD200 + LEC ，两种免疫细胞类型的粘附率均显着提高（分别为 91.27 ± 31.71 和 115.22 ± 29.69；p = 0.0005 和p < 0.0001）。结果表示为来自n = 6 个 EC 群体生物样品和n = 3 个粒细胞和 T 细胞的 PBMC 供体的平均值 ± SD。星号表示重要性如下（未配对t检验）：*** p < 0.001。使用非配对t检验。细胞核用 Hoechst（蓝色）染色。比例尺：100 μm。
最初，不同的内皮细胞部分：j/aCD200+ 和 CD200-LEC 和 HUVEC，使用红细胞跟踪器（红色）标记并与人血来源的粒细胞或用绿色细胞跟踪器标记的 T 细胞共培养并共培养（图 5 a-c）。免疫细胞与内皮细胞比率的量化表明，只有少数 CD200R+ 粒细胞 (9.77 ± 2.5) 和 T 细胞 (4.27 ± 1.59; p = 0.99 (ns) 在共培养试验中粘附于 HUVEC (图 5 ) a). 同样，只有少数粒细胞 (11.11 ± 3.19; p = 0.99) 和 T 细胞 (11.84 ± 0.93; p = 0.99) 粘附在 j/aCD200 - LEC 上（图 5b) 与 HUVEC 相比。相反，与 j 相比，大量表达 CD200R 的粒细胞 (91.27 ± 31.71; p = 0.0005) 和 T 细胞 (115.22 ± 29.69; p < 0.0001) 特异性粘附于 j/aCD200 + LEC (图 5 c) /aCD200 - LEC。结果表明，表达 CD200R 的免疫细胞仅对表达 CD200 配体的内皮细胞单层表现出特异性粘附，而使用 CD200 -内皮细胞几乎没有检测到结合。此外，粒细胞和 T 细胞对不同 EC 级分的粘附之间没有显着差异。
通过将原代 HDMEC 与抗 CD200 抗体预孵育以阻断 CD200 表位，进一步研究了内皮 CD200 参与免疫细胞（血源性 T 细胞）和内皮细胞之间的细胞间相互作用（补充图 S6）。IgG1 处理和未处理的 HDMEC 用作阴性对照。CD200 抗体处理显示血液 T 细胞在 HDMEC 单层上的粘附几乎完全被抗体与内皮细胞预孵育 (9.4% ± 3.4) 阻断，而 IgG 处理 (110.8% ± 27.6) 和未处理 ( 119.7% ± 14.2) 显示出显着更高的免疫细胞结合。使用先前用未缀合的 CD200 阻断并随后用相同克隆的缀合的 CD200 染色的粘附 HDMEC 的免疫荧光染色来验证 CD200 的阻断效率（补充图 S7）。
3.7. CD200 在体外 3D 水凝胶中的培养毛细血管上表达为了分析 CD200 在体外培养的毛细血管上的表达，我们使用了基于 3D 胶原蛋白 I 水凝胶的系统（图 6 a-d）。J/a 人真皮微血管内皮细胞 (HDMEC) 与真皮成纤维细胞共培养在体外自发发展成 3D 血管网络。值得注意的是，我们能够在体外重现约 70:30% 的淋巴与毛细血管的生理比例，如 CD31 和 Prox1 或 LYVE1 标记所证明的，使用 3D 水凝胶的免疫荧光整体染色（图 6 a，b）。此外，我们检测到血液 (CD31 + PROX1 - ) 和淋巴 (CD31 + PROX1 + ) 毛细血管上的 CD200 表达（图 6c，分别）。然而，与 j/a 人皮肤相似，与毛细血管相比，CD200 在淋巴管上的表达增强。
图 6. CD200 在 3D 胶原蛋白中体外培养的血液和毛细淋巴管上的表达。( a ) 基于 I 型胶原蛋白的水凝胶，对内皮特异性标志物 CD31（红色）和淋巴谱系标志物 PROX1（绿色）染色（n = 5）。双阳性 CD31 + PROX1 +毛细血管代表淋巴管，单阳性 CD31 + PROX1 -显示毛细血管。较低的插图显示了淋巴毛细血管中单核 PROX1 染色的更高放大倍数（箭头）。( b ) 合并的共聚焦免疫荧光显示 CD31 +毛细血管（红色）和毛细淋巴管 CD31 +阳性（红色）和 LYVE1（绿色），这是一种淋巴特异性标志物。插图显示了单染 LYVE1 毛细淋巴管的放大图。( c ) PROX1 +（绿色）CD200 +（白色）CD31 +（红色）共染色的人毛细血管网络的三重染色图像。因此，PROX1 + CD200 + CD31 +三阳性毛细血管代表表达 CD200 标记的淋巴管（实心箭头），而双阳性 PROX1 - CD200 + CD31 +染色表明毛细血管对 CD200 呈阳性（空箭头）。( d ) LYVE1 +（绿色）CD200的三重共染色+（白色）CD31 +（红色）。虽然大多数毛细淋巴管 (CD31 + LYVE1 + ) 对 CD200 呈阳性（实心箭头），但只有少数毛细血管 (CD31 + LYVE1 - ) 表达 CD200（空箭头）。结果代表了n = 3 个 EC 种群的生物样本。细胞核用 Hoechst（蓝色）染色。比例尺：（a - d）：50 μm。
使用另一种淋巴标记物LYVE1（图6b，d）证实了这些发现。LYVE1、CD200 和 CD31 的三重共染色表明大多数毛细淋巴管 (CD31 + LYVE1 + ) 对 CD200 呈阳性，而只有少数毛细血管 (CD31 + LYVE1 - ) 表达 CD200。
3.8. CD200 在体内人血管前化 DESS 的毛细血管上表达正如在人体皮肤的微脉管系统中所证明的那样，CD200 在淋巴而不是毛细血管上特异性表达（图 1和补充图 S8）。由于 podoplanin (Podo) 表达仅限于淋巴管（图 1），我们使用 podoplanin 来专门描绘毛细淋巴管（图 7a和补充图 S8b）和 IV（Coll IV）以仅检测人类 j/a 皮肤的毛细血管和体内 DESS（图7b 和补充图 S7c）。与淋巴管内皮细胞相比，毛细血管表现出表达 Coll IV 的连续基底膜（图7b 和补充图S7c）。
图 7. 移植 vascDESS 中 CD200 表达的量化。( a , b ) j/a 人体皮肤对 huCD200（绿色）和 huPodoplanin ( a ) 或胶原蛋白 IV ( b ) 的免疫荧光共染色。Podoplanin 描绘了人类淋巴内皮，而胶原蛋白 IV 仅在人类毛细血管周围表达。放大插图中的白色箭头表示双阳性微血管结构。( c , d ) vascDESS 对 huCD200（绿色）和 huPodoplanin（红色）的免疫荧光共染色，可视化人类毛细淋巴管 ( c ) 和 huCollagen IV（红色），描绘人类血液内皮 ( d )。(e ) 量化显示，vascDESS 所含的血液数量（66.59 ± 20.95）明显高于毛细淋巴管（32 ± 8.34；** p = 0.009）。呈现的值是每 10× 高倍视野计数的人类 CD31 +或 podoplanin +血管总数的平均值 (±SD)，每组n = 6 个生物样本。放大插图中的白色箭头表示双阳性微血管结构。( f ) vascDESS 中血液和淋巴管上 CD200 表达的量化。请注意，CD200 主要在淋巴管上表达 (41.67 ± 5.89)，而血管仅表现出该标志物的少量表达 (8.63 ± 2.95; **** p< 0.0001)。结果表示为来自 3 只独立动物移植（总共 6 只动物）的n = 3 名生物供体的平均值 ± SD。细胞核用 Hoechst（蓝色）染色。比例尺 50 μm。
此外，使用这些标记，我们在体内评估了 CD200 在人淋巴和血管毛细血管上的表达（图 7 c-d，f）。人类 vascDESS 表现出人类 CD200 的异质分布模式，其仅限于真皮中的毛细血管，类似于在正常人类皮肤中观察到的模式（图 7 a-d）。移植后三周进行的量化显示，CD200 在人类足部阳性毛细血管上高表达 (41.67 ± 5.89)，而在人类 Coll IV 阳性毛细血管上几乎没有检测到 (8.63 ± 2.95; p < 0.0001) (图 7c-d，f)。因此，与在人类皮肤中一样，CD200 在淋巴管中的表达比 vascDESS 中的毛细血管高 4 倍。
3.9. CD200 与其认知受体、人类皮肤中的 CD200R 和体内皮肤替代物结合迄今为止，尚未在人体皮肤中研究人内皮 CD200 参与内皮细胞和 CD200R +免疫细胞之间的细胞间相互作用。
因此，我们试图确定移植后 1 周和 3 周在正常人皮肤、非血管化 DESS（对照）和血管化 DESS（vascDESS）中表达 CD200R 的细胞与 CD200 之间的时空相互作用（图 8）。此外，我们已经证实大鼠 CD200R +细胞是骨髓来源的，因此在大鼠组织中共表达骨髓、粒细胞和单核细胞/巨噬细胞特异性标志物（补充图 S4）。
图 8. CD200R 在人类 j/a 皮肤以及非 vascDESS 和 vascDESS 中的表达。( a , a' ) j/a 皮肤对 CD31（红色）和 CD200R（绿色）染色的免疫荧光照片。请注意，CD200R +免疫细胞 (9.65 ± 3.56) 与 CD31 +毛细血管密切相关。( b , c ) CD200R 在 1 周 (4 ± 1.55, p = 0.1551 vs. 正常皮肤) ( b ) 和 3 周 (2.67 ± 1.55, p = 0.0565 vs. 正常皮肤) ( c ) 移植后。再一次，表达 CD200R 的细胞靠近 CD31 +毛细血管。( d , e ) CD200R 在 vascDESS 一周 (26.5 ± 7.71, p < 0.0001 vs. non-vascDESS 1w, **** p < 0.0001 vs. human skin) ( d ) 和三周 (21.31 ± 5.4)的表达, p < 0.0001 vs. non-vascDESS 1w, p < 0.0001 vs. 人类皮肤) ( e ) 移植后。整个真皮层可见大量CD200R +细胞，主要粘附在CD200 +内皮上。( f) 在体内 1 周和 3 周后，在 j/a 人皮肤的真皮隔室以及非血管和 vascDESS 中的 CD200R 表达细胞的量化。请注意，与天然皮肤或非 vascDESS 相比，vascDESS 真皮中CD200R +细胞的数量显着增加。相比之下，含有人血和毛细淋巴管的人 vascDESS 显示大鼠 CD200R 阳性细胞密度增加（26.5 ± 7.71，p < 0.0001 vs. non-vascDESS 一周，**** p < 0.0001 vs. 人皮肤）和三周（21.31 ± 5.4，**** p < 0.0001 vs. non-vascDESS 1w，p< 0.0001 vs. 人体皮肤）周（d，e）。放大插图中的白色箭头表示 CD200-CD200R 相互作用。( g ) 在体内，与不与 CD200 +内皮细胞相关的 CD200R +细胞相比，移植后 1周与大鼠 CD200R +免疫细胞相关的 CD200 +内皮细胞显着增加(**** p < 0.0001)。这种差异在体内 3 w 后消失（ns，p > 0.05）。结果表示为来自 3 只独立动物移植（总共 6 只动物）的n = 3 名生物供体的平均值 ± SD。细胞核用 Hoechst（蓝色）染色。比例尺 100 μm 和 50 μm（放大插图）。
虽然在正常人 j/a 皮肤中仅检测到少数 CD200R 阳性细胞 9.65 ± 3.56（图 8 a、a'、f），但大多数表达 CD200R 的细胞位于毛细血管附近，如共染色所示对于人类 CD31（图 8 a、a'、箭头）。
类似的，非血管前化（非血管）DESS在一周（4 ± 1.55，p = 0.1551 与正常皮肤）和三周（2.67 ± 1.55 , p = 0.0565 vs. 正常皮肤）移植后（图 8 b-d）。
相比之下，含有人血和毛细淋巴管的人 vascDESS 在 1 周（26.5 ± 7.71，p < 0.0001 与非 vascDESS 1w，p < 0.0001 与人皮肤）和三周时表现出大鼠 CD200R 阳性细胞的密度增加（ 21.31 ± 5.4, p < 0.0001 vs. non-vascDESS 1w, p < 0.0001 vs. 人体皮肤) (图 8d,e)。尽管 CD200R 阳性的真皮细胞分布在整个真皮层（图 8 d），但这些细胞的主要亚群粘附于 CD200 阳性内皮细胞（图 8d,e; 箭头），显示移植后 1 周和 3 周时 vascDESS 中有一个活跃的 CD200-CD200R 轴。特别是，在 1w 的体内培养时间后，与不靠近的细胞相比，显着更多的 CD200R +细胞与 CD200 +内皮细胞相关（18.8 ± 3.4 对 11.4 ± 2.1， p < 0.0001）。这种差异消失了，并且发现相似数量的 CD200R + T 细胞与 CD200 阳性内皮细胞相关（13.3 ± 2.0）和非相关（11.9 ± 2.3，p = 0.2064）。
4。讨论直到今天，内皮 CD200 的分布及其与 CD200R 的相互作用尚未在人体皮肤和组织工程真皮-表皮皮肤替代品中得到报道。特别是，我们已经证明：(i) CD200 在血液和毛细淋巴管中表达不同，(ii) CD200R 主要由骨髓和 T 细胞表达，(iii) 骨髓细胞上的 CD200R 与其在其上表达的同源 CD200 配体相互作用体外和体内的内皮细胞。总体而言，我们的研究表明，活性 CD200-CD200R 轴在体内皮肤替代物的伤口愈合过程中起着至关重要的作用。该研究的某些方面值得更仔细地考虑。
我们发现 CD200 在正常人体皮肤的小毛细血管和体内生物工程人体血管中大量表达，特别是在人体皮肤和脂肪组织的淋巴而不是毛细血管上。这与 Ko 等人的研究形成鲜明对比。该研究检查了内皮 CD200 在不同类型血管中的分布，包括除皮肤以外的不同大鼠器官中的小毛细血管和大直径血管。尽管作者描述了小毛细血管中明显的 CD200 免疫反应性，并且在小动脉和动脉中几乎没有信号，但 CD200 和 podoplanin 的双重标记在淋巴内皮细胞中显示出相当微弱或无法检测到的表达。有趣的是，在我们的研究中，与毛细血管相比，我们检测到人类皮肤和血管内淋巴管内皮细胞上 CD200 的表达增加。因此，我们的研究结果可能表明 CD200 表达在人类淋巴管中具有某些特定功能。虽然发现 CD200 在胎儿皮肤淋巴毛细血管上的相对表达与 j/a 皮肤中发现的水平相当，但胎儿毛细血管的 CD200 表达明显高于其 j/a 对应物。在新鲜分离的 j/aHDMEC 上使用 FACS，我们能够在单细胞水平上确认 j/aBEC 和 j/aLEC 中的相对 CD200 表达水平。在短培养时间（1 代）后重新分析以前未分类的 HDMEC 显示 j/aLEC 和 fLEC 上的相对 CD200 表达略有下降。相比之下，
此外，Ko 等人。报道了 CD200 蛋白在大鼠体内静脉和小静脉内皮细胞中的分布，在骨髓和脾脏中，而在我们的研究中，我们没有观察到来自静脉的大血管 EC 上的 CD200，例如 HUVEC 对蛋白质的影响。和 mRNA 水平。这种差异可能是由于大鼠和人类皮肤之间存在明显差异，因此无法直接比较这两项研究的结果。然而，据我们所知，没有关于 CD200 在人体皮肤中分布的报道。
Wakabayashi 等人进行的另一项调查。在小鼠中检测到大多数器官的 ECs 中的 CD200 表达，除了肝脏。此外，作者确定 CD200 也在所有 CD157 + ECs 上共表达。有趣的是，CD157 在他们的研究中被表征为组织驻留血管内皮干细胞 (VESC) 的标志物，具有比 CD157 - CD200 - ECs 更高的增殖潜力和克隆扩增。Wakabayashi 等人描述的鼠标 VESC。其特点是它们增加的增殖率以及增强的集落形成潜力以及它们在伤口愈合过程中分化成成熟 EC 的能力。
尽管作者没有研究 CD200 在人类 ECs 上的表达，也没有区分小鼠血液和淋巴管内皮细胞，但他们的研究表明 CD200 也可能作为人类 ECs 中的推定血管干细胞标志物。因此，我们在我们的研究中进行了克隆形成和增殖测定，以评估 CD200 + EC 可能的干细胞潜力。然而，与 CD200 -EC 相比，我们无法观察到使用 CD200 +增强的稳态和再生干细胞特性，这表明 CD200 +细胞在人体组织中具有另一种可能的功能。因此，需要进一步的研究来验证 CD200 +人类微血管 ECs 作为人类皮肤中的 VESC 的潜在作用。
已经证明，表面分子的特异性表达是组织炎症期间内皮上 T 细胞、单核细胞/巨噬细胞和其他白细胞运输的原因。此外，先前还报道了大鼠淋巴结中高内皮小静脉 (HEV) 的特化内皮细胞具有明显的 CD200 免疫反应性。HEV 形成高度空间组织的毛细血管后小静脉的分支网络，募集和控制淋巴细胞从血流进入淋巴结。在抗原刺激后，活化的淋巴细胞通过淋巴管离开淋巴结并重新进入血液。因此，在 HEV 中检测到的显着内皮 CD200 表达表明 CD200-CD200R 相互作用可能参与体内免疫细胞运输的调节。
此外，我们证明了 **** Hidden Message *****事实上，以前的研究表明，在免疫细胞运输到淋巴结中，podoplanin 表达在 HEV 完整性中的关键作用。
因此，本研究中获得的数据表明，CD200-CD200R 相互作用通过在 HEV 中提供 CD200 + ECs 和表达 CD200R 的免疫细胞之间的通信，对先天免疫系统的正常功能至关重要。
此外，人体皮肤微血管内壁的 EC 是与大多数血源性细胞（例如皮肤内的免疫细胞）的第一次接触。在本研究中，我们检查了 CD200R 的表达和分布，它是 CD200 的同源受体。我们在大鼠和人类皮肤以及组织工程 DESS 中的单核细胞/巨噬细胞、粒细胞和 T 细胞上发现了 CD200R。正如先前报道的那样，CD200 与 CD200R 结合，主要在 CD11b +骨髓细胞、单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞上表达，抑制它们在体内的促炎激活和白细胞介素产生。这种特定的相互作用抑制了 MAP 激酶 p38、ERK 和 JNK，它们是参与巨噬细胞经典激活的常见信号通路，理论上将抗炎 M2 细胞维持在其极化状态。此外，先前在小鼠中的研究报道，特定抗 CD200 免疫球蛋白的应用也诱导了树突状细胞的免疫耐受。
这些结果表明，CD200–CD200R 物理结合可能在免疫细胞和内皮细胞之间的细胞粘附中起重要作用和相互作用。我们在此证实，皮肤微血管系统中的 CD200 表达确实是血液来源的单核细胞/巨噬细胞和 T 细胞体外特异性粘附所必需的。这些数据与之前的报道一致，表明抗人 CD200 抗体在体外完全阻断了人 T 细胞（Jurkat T 细胞）与 EC 之间的相互作用。因此，连同以前的报告，本研究中获得的数据表明 CD200-CD200R 通过阻断活化的单核细胞/巨噬细胞和 T 细胞在免疫系统下调中的特定作用。
此外，我们在体内检测到 vascDESS 中的特定 CD200-CD200R 相互作用。具体而言，主要是淋巴管内皮CD200 +与CD200R相互作用。这些数据与 Ko 等人的观察结果一致。这表明 CD200–CD200R 信号传导介导免疫细胞与体内小鼠组织中 ECs 的细胞间相互作用。同一组还报告说，CD200–CD200R 信号传导可防止小鼠体内进一步的血细胞渗出，因此，它可以减少受伤后的组织炎症 。此外，如 Ngwa 等人所述，CD200–CD200R 信号传导会在炎症刺激下导致有效的免疫抑制。此外，在自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 、自身免疫性葡萄膜炎 (EAU) 、胶原诱导的关节炎和炎症介导的神经变性模型中，CD200 过表达在自身免疫性炎症中发挥保护作用]。
重要的是，CD200 与 CD200R 的相互作用与降低移植物排斥风险以及延长小鼠移植存活率有关。CD200 在成功抑制排斥反应的小鼠移植模型中显示上调，并且被认为在受体 CD200R 与骨髓细胞结合后发出免疫抑制信号 。结合后，CD200:CD200R 介导细胞因子产生的改变，增加抗炎细胞因子的表达：白细胞介素 4 (IL-4)、IL-10 和转化生长因子-β (TGF-β)，并降低 IL- 2、干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。此外，在 CD200 存在下体外培养异体刺激的细胞会抑制细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 反应。在体内植入后也观察到了效果。
因此，CD200 与其 CD200R 的相互作用对于皮肤组织工程至关重要。因此，将 CD200 + EC 加入预血管化的皮肤替代物可以通过其免疫抑制功能防止过度炎症，从而降低移植排斥的风险。因此，我们之前报道了 vascDESS 与非 vascDESS 相比改善了伤口愈合和移植物取用率 。在这些研究中，我们之前证明了与 vascDESS 相比，非 vascDESS 中移植物排斥增强、移植物取延迟和促炎 M1 巨噬细胞反应延长，这表明 EC/骨髓细胞上的 CD200-CD200R 轴在这些结果中起重要作用。我们的数据与 Hoek 等人先前的证据一致。CD200 对骨髓细胞发挥抑制功能 ，并且 CD200 信号传导的过表达有助于细胞因子产生极化，从而产生抗炎、促再生的细胞因子谱 [。
5。结论**** Hidden Message *****
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