SARS-CoV-2 刺突蛋白协同 VEGF-A/neuropilin-1 受体信号诱导镇痛
严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 的全球传播继续有增无减。严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 的刺突蛋白与宿主血管紧张素转换酶 2 的结合会触发病毒进入，但其他蛋白质也可能参与其中，包括神经纤维蛋白 1 受体 (NRP-1)。因为刺突蛋白和血管内皮生长因子-A (VEGF-A)（一种促痛性和血管生成因子）都与 NRP-1 结合，我们测试了刺突蛋白是否可以阻断 VEGF-A/NRP-1 信号传导。刺突蛋白和 NRP-1 抑制剂 EG00229 阻断了 VEGF-A 触发的感觉神经元放电。通过抑制自发脊髓突触活动和减少感觉神经元中的电电流，类似地阻断了 VEGF-A 的伤害感受行为。值得注意的是，阻止 VEGF-A/NRP-1 信号传导在神经性疼痛模型。通过破坏 VEGF-A/NRP-1 信号传导来“沉默”疼痛可能是无症状个体疾病传播增加的基础。严重急性呼吸综合征冠状病毒2的刺突蛋白通过干扰血管内皮生长因子-A/NRP1通路促进镇痛，这可能影响疾病传播动力学。
一、简介
严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 是 COVID-19 的病原体，这是一种冠状病毒疾病，截至 8 月 24 日，该疾病已在全球感染超过 2350 万人，并导致近 810,000 人死亡。大多数感染 SARS-CoV-2 的患者报告出现轻度至重度呼吸道疾病，出现发烧、咳嗽和呼吸急促等症状。然而，通过核酸检测阳性诊断的一部分患者要么无症状，要么症状轻微。越来越多的证据表明，无症状个体可以有效地传播病毒，而这些 SARS-CoV-2 无声传播者的出现限制了对大流行的控制。疼痛是有症状患者日益关注的问题，这可能源于 SARS-CoV-2 对细胞的直接攻击以及受影响细胞释放的“细胞因子风暴”。无症状或症状轻微的个体是否具有降低的疼痛阈值，或者他们的疼痛是否被抑制尚不清楚，但两者都可能导致疾病传播动态增加。
表面表达的血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 已被认为是 SARS-CoV-2 摄取的主要受体。新出现的证据表明，表达 ACE2 的感觉神经元的一个子集与脊髓和脑干 CNS 神经元发生突触，产生神经效应，包括头痛和神经痛。奇怪的是，ACE2 并不存在于大多数神经元中，尽管越来越多关于 COVID-19 患者常见神经系统症状的报道。自相矛盾的是，尽管 ACE2 表达水平随着年龄的增长而下降，但在老年患者群体中发现 COVID-19 的严重程度增加，例如意大利支持ACE2不是SARS-CoV-2进入的唯一途径的论点。
最近的两份报告表明，SARS-CoV-2 刺突蛋白可以与神经纤维蛋白 1 受体 (NRP-1) 的 b1b2 结构域结合。这种相互作用通过一个在 SARS 和中东呼吸综合征 (MERS) 中不保守的多元氨基酸序列 ( 682 RRAR 685 ) 发生，称为“C 端规则”(CendR) 基序，可显着增强其进入细胞的能力。重要的是，“组学”分析显示，与健康对照相比，COVID-19 患者的生物样本中NRP-1显着上调。使用血管内皮生长因子-A (VEGF-A)，一种 NRP-1 中 b1b2 口袋的生理配体，我们研究了刺突蛋白，即 SARS-CoV-2 的主要表面抗原，是否可以阻断 VEGF-A/NRP -1 信号影响疼痛行为。鉴于 VEGF-A 在啮齿动物 4,58 和人类 23,58 中的促痛作用之间的相似性，以及临床发现表明来自 COVID-19 患者的支气管肺泡灌洗液中 VEGF-A 水平升高加上无症状血清中的水平显着降低与有症状的患者相比，次要的问题是测试刺突蛋白是否能产生镇痛作用。我们发现 VEGF-A 使伤害感受器活动敏感——这是神经性疼痛，被刺突蛋白和 NRP-1 抑制剂 EG00229 阻断。此外，我们确定了刺突蛋白的一种新的镇痛作用，这反映在 NRP-1 抑制上。
2。材料和方法2.1。动物
将无病原体成年雄性和雌性 Sprague-Dawley 大鼠 (225-250 g; Envigo, Indianapolis, IN) 饲养在温度受控 (23 ± 3°C) 和光控 (12 小时光照/12 小时黑暗周期；07:00-19:00 开灯）房间提供标准啮齿动物食物和可随意饮用的水。亚利桑那大学医学院的机构动物护理和使用委员会批准了所有实验。所有程序均按照美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》进行。动物被随机分配到治疗组或对照组进行行为实验。最初每笼饲养 3 只动物，但在鞘内插管后单独饲养。2.2. 基于酶联免疫吸附试验的 NRP1-spike 蛋白结合试验
用人 Neuropilin-1-Fc（每孔 10 ng，Cat# 50-101-8343，Fisher，Hampton，NH）包被板（96 孔，Nunc Maxisorp；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）并在室温下孵育温度过夜。第二天，用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中的 3% 牛血清白蛋白 (BSA) 洗涤和封闭板，以尽量减少与板的非特异性吸附结合。添加浓度范围为 500 至 0.07 nM 的 SARS-CoV2 刺突蛋白（S1 域 aa16-685，Cat# Z03485；Genscript，Piscataway，NJ）。作为阴性对照，一些孔接受了含有 3% BSA 的 PBS。将板在室温下振荡孵育3小时。接下来，用 PBS 洗涤板以消除未结合的蛋白质。通过 anti-His 探针 HRP（Cat#15165；Thermo Fisher Scientific）检测到结合的 SARS-CoV-2 Spike。四甲基联苯胺 (Cat#DY999; R&D Systems, St. Louis, MO) 用作比色底物。使用设置为 450 nm、校正波长为 570 nm 的酶标仪（Multiskan Ascent；Thermo Fisher Scientific）立即测定每个孔的光密度。使用 GraphPad Prism 8 (GraphPad, San Diego, CA) 通过非线性回归分析分析数据。
2.3. 急性分离的背根神经节神经元的制备
使用如前所述的方法将所有水平的背根神经节 (DRG) 急性分离。使用先前开发的程序从 100 g 雌性 Sprague-Dawley 大鼠中分离出18 个大鼠 DRG 神经元。
2.4. 培养初级背根神经节神经元和微电极阵列分析
将分离的背根神经节神经元保存在含有 Neurobasal（货号 21103049；赛默飞世尔）、2% B-27（货号 17504044；赛默飞世尔）、1% 青霉素/硫酸链霉素（来自 10,000 µg/mL 库存）的培养基中，30 ng/mL 神经生长因子和 10% 胎牛血清（Hyclone R&D Systems，Minneapolis，MN）。将收集的细胞重新悬浮在 DRG 培养基中，并以 10 µL 液滴的形式接种到微电极阵列 (MEA) 的聚-D-赖氨酸涂层电极上（24 孔板，Cat# MED-Q2430L，Alpha Med Scientific，大阪，日本）。让细胞粘附 30 分钟，然后用 DRG 培养基淹没。第二天，在 MED64 presto 上分析细胞，其中可以同时记录 24 个孔，每个孔包含 16 个电极。用指定的神经纤维蛋白 1 配体 Semaphorin 3A（3 nM；Cat#5926-S3-025；R&D Systems）、VEGF-A 处理细胞165（1 nM，Cat#P4853；Abnova）或 VEGF-B（1 nM，Cat#RPU44324；Biomatik）在记录前 30 分钟。在添加 VEGF-A 前 30 分钟，使用尖峰（100 nM，Cat#Z03485；Genscript）或 NRP-1 抑制剂 EG-00229（30 µM，Cat#6986；Tocris Bioscience ）进行处理。在 MEA Symphony 和 Mobius 离线工具包上分析数据，以提取治疗前后有源电极的放电率。对于显示自发活动的电极，发射速率显示为 Hz（每秒事件数）。
2.5. 急性分离的背根神经节神经元中 Na +和 N 型 (Ca v 2.2) Ca 2+电流的全细胞贴片记录
如前所述，从急性分离的 DRG 神经元中获得记录。用于测量钠电流的解决方案和协议与描述的完全相同。 Khanna 等人先前描述了用于隔离 N 型钙电流的协议。为分离 DRG 中的 N 型通道，使用以下亚基选择性阻断剂（均购自耶路撒冷 Alomone Labs）阻断高电压和低电压激活的钙通道亚型的贡献：硝苯地平（10 μM ，L型）；ω-agatoxin GIVA（200 nM，P/Q 型）；SNX-482 (200 nM, R 型); 和 TTA-P2（1 µM，T 型）。如前所述，用电流 - 电压（IV）和激活/失活电压协议询问背根神经节神经元。
为了确定 VEGF-A 应用对电压门控钠和钙电流的影响，我们在全细胞记录前将重组大鼠 VEGF-A（PBS 中 1 nM）与 DRG 神经元一起孵育 30 分钟。此外，在记录前，还将重组刺突蛋白（PBS 中 100 nM）和神经纤毛蛋白 1 (NRP-1) 阻断剂 EG00229（DMSO 中 30 μM，目录号 6986；Tocris Bioscience）应用于培养基 30 分钟. 对于组合测试蛋白质的实验，首先添加刺突蛋白 30 分钟，然后添加 VEGF-A 和 EG00229，然后开始记录。控制条件使用 PBS、二甲基亚砜 (DMSO) 或两者来匹配实验条件中使用的溶液。
2.6. 脊髓切片的制备
如前所述，从年轻大鼠（出生后 10-14 天）制备65 个横向 380-μm 厚的横向切片，用于在室温下进行电生理记录。如图所示，将 VEGFA (1 nM)、NRP-1 抑制剂 (EG00229, 30 µM) 和刺突蛋白直接添加到记录溶液中。切片在记录前处理 30 分钟。
2.7. 全细胞膜片钳对脊髓切片的电生理记录
使用先前描述的方法记录实质的明胶神经元。
2.8. 后爪注射程序
注射 PBS 载体（NaCl 137 mM、KCl 2.5 mM、Na 2 HPO 4 10 mM 和 KH 2 PO 4 1.8 mM）、VEGF-A 165 (10 nM)、spike (100 nM) 和 EG00229 (30 µM)在左后爪的背部皮下，单独或联合使用。将大鼠轻轻束缚在布布下，并使用 0.5-mL 注射器（27-G 针头）注射 50 µL。2.9。鞘内导管植入
对于鞘内 (it) 药物给药，大鼠长期植入导管，如 Yaksh 和 Rudy 所述。
2.10。异常性疼痛测试
如 Chaplan 等人所述，使用一系列校准的细 (von Frey) 细丝评估触觉异常性疼痛（即，在用通常无害的机械刺激探测后缩爪的阈值降低）。
2.11。幸免于神经损伤
如前所述造成神经损伤。手术后第 10 天对12只大鼠进行了测试，此时它们已出现稳定且最大的机械异常性疼痛。
2.12. 突触富集和分离
使用异氟醚麻醉成年大鼠并断头。脊髓被移除，脊髓的背角被解剖，因为这个结构包含从背根神经节产生的突触。如前所述进行突触体分离。42通过免疫印迹验证非突触后密度（非 PSD）和突触后密度部分的完整性。PSD95 富含突触后密度部分，而突触素富含非 PSD 部分（未显示）。BCA蛋白质测定用于确定蛋白质浓度。
2.13. 免疫印迹制备和分析
使用 BCA 蛋白质测定法（Cat# PI23225；Thermo Fisher Scientific）测定蛋白质浓度。指示的样品加载在 4% 至 20% Novex 凝胶（Cat# EC60285BOX；Thermo Fisher Scientific）上。使用 TGS (25 mM Tris pH = 8.5, 192 mM 甘氨酸, 0.1% (mass/vol) SDS), 20% (vol/vol) 甲醇作为转移缓冲液至 0.45 μm 聚偏二氟乙烯膜，将蛋白质在 120 V 下转移 1 小时（货号 IPVH00010；Millipore，Billerica，MA），在纯甲醇中预活化。转移后，将膜在室温下用 TBST（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.1% Tween 20）、5%（质量/体积）脱脂奶粉封闭 1 小时，然后分别在一抗 VEGFR2 (Cat#PA5-16487; Thermo Fisher), pY1175 VEGFR2 (Cat#PA5-105167; Thermo Fisher), Flotillin (Cat#F1180; Sigma-Aldrich, St Louis, MO), 或 neuropilin-1 (Cat#sc-5307; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) TBST、5% (mass/vol) BSA，在 4°C 下过夜。在 Jackson ImmunoResearch 的辣根过氧化物酶缀合的二抗中孵育后，在暴露于摄影胶片之前，通过增强的发光 (WBKLS0500; Millipore) 显示印迹。使用 Silk Scientific Inc. 的 Un-Scan-It gel 7.1 版扫描软件对胶片进行扫描、数字化和量化。
2.14。血管内皮生长因子-A 刺突蛋白和 EG00229 与 NRP-1 的对接
使用 Glide (Schrödinger) 将弗林蛋白酶切割的 SARS-CoV-2 刺突蛋白 681-PRRAR-685（蓝色棒）的 C 端肽与 NRP-1-b1 结构域（白色表面，红色结合位点；PDB 6fmc对接 )。使用 PyMol 1.8 (Schrödinger, LLC.) 生成的分子图。
2.15。统计分析
首先使用 D'Agostino-Pearson 测试（Prism 8 Software，Graphpad，San Diego，CA）测试所有数据的高斯分布。平均值之间差异的统计显着性由方差参数分析确定，然后是 Tukey 事后检验或非参数 Kruskal-Wallis 检验，然后是 Dunn 事后检验，具体取决于数据集是否达到正态性。通过使用 Sidak 事后检验的双向方差分析来分析具有时间进程的行为数据。如果P ≤ 0.05 ，则认为差异显着。图中的误差线代表平均值±SEM。所有数据都绘制在 Prism 8 中。
3. 结果3.1。NRP-1信号的配体特异性参与诱导伤害感受器活动和疼痛
最初，我们评估了尖峰和 NRP-1 在 VEGF-A/NRP-1 通路中的参与。酶联免疫吸附试验证实了尖峰（S1 结构域 aa 16-685，包含 CendR 基序682 RRAR 685 ）和 NRP-1 的细胞外部分之间的相互作用（图 1A）。我们计算出这种相互作用的解离平衡常数（Kd）为~166.2 nM（图1A）。接下来，我们将感觉神经元置于多孔 MEA 上，这是一种能够对来自大量细胞的自发以及刺激诱发的细胞外动作电位进行多重测量的方法。血管内皮生长因子-A 增加了背根神经节神经元的自发放电，这被棘突蛋白的 S1 结构域和 NRP-1 抑制剂 EG00229 阻断（图 1A）。相比之下，配体 VEGF-B（VEGFR1 的配体——NRP-1 的共同受体）和信号素 3A（Sema3A，丛蛋白受体的配体——也是 NRP-1 的共同受体）不影响伤害感受器的自发放电（图 1B 和 C）。VEGF-B 和 Sema3A 缺乏作用分别排除了 VEGF-R1 和 plexin 的作用，因此暗示了一种新的配体 - VEGF-A 和受体 - NRP-1，驱动伤害感受器放电的特定途径（图 1）。一维）。
图1。：配体特异性参与神经纤毛蛋白-1 受体 (NRP-1) 信号传导诱导伤害感受器活动，促进疼痛样表型。(A) 显示标准化 NRP-1 与增加浓度的重组刺突蛋白结合的图表（每个浓度 n = 8 个重复）。假设一个位点结合模式拟合数据并产生~166.2 nM的Kd。(B) 与 VEGF-B (1 nM)、Sema3A (3 nM)、VEGF-A (1 nM)、VEGF-A 孵育 30 分钟的培养的 DRG 感觉神经元的平均动作电位放电率 (Hz，每秒事件数)加穗 (100 nM)，或 VEGF-A 加 NRP-1 抑制剂 EG00229 (30 μM)。在测试的配体中，只有作用于 VEGFR2 的 VEGF-A 是 NRP-1 的配体，可触发伤害感受器的自发放电增加。数据显示为平均值±SEM，并通过非参数双向方差分析（事后：Sidak）进行分析。显示了P值，与对照 (PBS) 或 VEGF-A 相比。EG00229 是一种 NRP-1 抑制剂 (PDB 3i97)。(C)左上：与 NRP-1 b1 结构域复合的 VEGF-A 肝素结合结构域（带有 R323 的灰色卡通片）（白色表面，红色结合位点；PDB 4deq）。右上：弗林蛋白酶切割的 SARS-CoV-2 刺突蛋白 681-PRRAR-685 的 C 端肽（蓝色棒）与 NRP1-b1 结构域对接（白色表面，红色结合位点；PDB 6fmc ) 使用 Glide (薛定谔)。仅出于说明目的而建模的其他尖峰残基 678-TNS-680（蓝色卡通）。底部：与 NRP-1 b1 结构域复合的化合物 EG00229（青色棒）（白色表面，红色结合位点；PDB 3i97 ）。(D) 假设 SARS-CoV-2 刺突蛋白与 NRP-1 b1b2 结构域结合触发细胞内级联反应，增加钠和钙通道活性以增加伤害感受器活性，最终导致疼痛加剧的假设示意图。DRG，背根神经节；SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒 2；VEGF，血管内皮生长因子。此图的面板 D 是使用 BioRender.com 创建的。
因为 VEGF-A 和刺突蛋白在 NRP-1 上共享一个共同的结合口袋（图 1C），我们询问刺突蛋白是否可以阻断 VEGF-A/NRP-1 信号传导以影响疼痛行为。与先前的报道一致，我们证实 VEGF-A 具有促痛作用，因为足底内注射 VEGF-A 降低了两个缩爪阈值 (PWT)（图 2A 和 B以及表 S1）和雄性大鼠对热刺激的潜伏期（图 2C 和 D以及表 S1）。在雌性大鼠中也获得了类似的结果（图 2E-H和表 S1）。用 NRP-1 抑制剂 EG00229 阻止 VEGF-A 与 NRP-1 结合或激活 VEGF-A/NRP-1 信号传导的尖峰减弱了单独由 VEGF-A 诱导的机械异常性疼痛和热痛觉过敏（图 2和表 S1）。Spike 和 EG00229 单独对任何性别的这些行为（图 2和表 S1）都没有任何影响。总之，这些数据提供了功能性证据，表明 VEGF-A/NRP-1 信号传导通过使伤害感受器活性敏感来促进疼痛样表型（图 1D）。
图 2：血管内皮生长因子-A (VEGF-A) 促进了一种疼痛样表型，这种表型在雄性和雌性大鼠中被刺突蛋白或神经纤维蛋白-1 受体 (NRP-1) 抑制所阻断。对于在爪中注射 VEGF-A (10 nM) 的雄性和雌性幼稚大鼠的爪缩回阈值（A、B-雄性和 E、F-雌性）或潜伏期（C、D-雄性和 G、H-雌性），单独或组合使用尖峰 (100 nM)、EG00229 (30 µM) 或 PBS（载体）（50 µL/大鼠；= 6-12）。为清楚起见，时间过程图中未显示统计显着性，而是在表 S1 中显示图 B、F、D 和 H 是 0 到 24 小时曲线下的面积。数据显示为平均值±SEM，并通过非参数双向方差分析进行分析，其中时间是受试者内因素，治疗是受试者间因素（事后：Sidak），* P < 0.05。通过 Kruskal-Wallis 事后检验的单向方差分析比较曲线下面积。实验由对治疗不知情的研究人员进行分析。有关完整的统计分析，请参见表 S1。
3.2. 血管内皮生长因子-A介导的背根神经节离子通道电流增加通过破坏VEGF-A/NRP-1信号传导而正常化
为了深入了解 VEGF-A 促进伤害感受器活性增加的机制，我们假设 DRG 中的离子通道可能受到影响，因为这些离子通道有助于伤害感受可塑性。来自小直径 DRG 神经元的典型 Na +电流家族如图 3A所示。与载体（PBS）处理的DRG相比，血管内皮生长因子-A促进总Na +电流增加1.9倍，DRG完全被刺突蛋白阻断（图3B和C）。单独的刺突蛋白不影响 Na +电流（图 3B 和 C以及表 S1）。因为这种减少的电流可能是由通道门控的变化引起的，我们确定了 DRG Na +电流的激活和失活动力学是否受到影响。半最大激活和失活 (V 1/2 ) 以及激活和失活的斜率值 ( k ) 在测试条件之间没有差异（图 3D 和 E以及表 S1、S2），除了由 VEGF-A 和 EG00229 共同治疗引起的钠通道失活中的 ∼8-mV 超极化转变（表 S2 ） . NRP-1抑制剂EG00229也获得了类似的结果，它也抑制了VEGF-A介导的总Na增加+电流（图 3F-H和表 S1）但对生物物理特性没有影响（图 3I 和 J以及表 S1、S2）。
图 3：血管内皮生长因子-A (VEGF-A) 介导的钠电流增加通过背根神经节神经元中的刺突蛋白或神经纤维蛋白-1 受体 (NRP-1) 抑制而正常化。从小型背根神经节神经元记录的代表性钠电流轨迹（A 和 F），用指定的处理孵育 30 分钟，以响应从 -60 mV 的保持电位从 -70 到 +60 mV 的去极化步骤。如图所示，来自背根神经节神经元的电流-电压曲线（B 和 G）和归一化峰值（C 和 H）电流 (pA/pF) 的总结。玻尔兹曼拟合归一化电导 (G/Gmax）电压依赖性激活（D和I）和失活（E和J）的感觉神经元的电压关系，如图所示。误差线表示平均值±SEM。表 S2 中显示的激活和失活值的半最大激活和失活 (V 1/2 ) 和斜率值 ( k ) 。处理之间比较的P值如所示；有关完整的统计分析，请参见表 S1。
因为钙通道在初级传入疼痛通路中疼痛相关信息的传递和处理中发挥着多重关键作用，我们评估了它们是否受到影响。我们专注于 N 型 (Ca v 2.2) 通道，因为这些通道介导背角传入纤维突触处的神经递质释放，并且在疼痛基质中至关重要。与载体 (PBS) 处理的 DRG 相比，血管内皮生长因子-A 促进总 Ca 2+电流增加 1.8 倍，后者被刺突蛋白完全阻断（图 4A-C和表 S1）。单独的刺突蛋白不影响 Ca 2+电流（无花果。4A-C )。此外，我们没有观察到测试条件之间激活和失活动力学的任何变化（图 4D 和 E以及表 S1 和 S2）。NRP-1 抑制剂 EG00229 获得了类似的结果，它抑制了 VEGF-A 介导的 N 型 Ca 2+电流增加（图 4F-H和表 S1）但对生物物理特性没有影响（图 4I 和 J以及表 S1 和 S2 ）。这些数据表明 Na +和 Ca 2+中的刺突蛋白和 NRP-1 （Ca v2.2) VEGF-A/NRP-1 信号通路。图 4：血管内皮生长因子-A (VEGF-A) 介导的钙电流增加被背根神经节神经元中的刺突蛋白或神经纤维蛋白-1 受体 (NRP-1) 抑制正常化。从小型 DRG 神经元记录的通过 N 型通道（A 和 F）的钙电流的代表性痕迹，用指定的处理孵育 30 分钟，以响应 -60 mV 的保持电压和在 5 处施加 200 毫秒的电压阶跃-s 间隔以 +10 mV 为增量，从 -70 到 +60 mV。N型的药理分离（Ca v2.2）电流是用毒素/小分子混合物实现的。如图所示，来自背根神经节神经元的电流-电压曲线（B 和 G）和归一化峰值（C 和 H）电流 (pA/pF) 的总结。玻尔兹曼适合如所示的感觉神经元的电压依赖性激活（D 和 I）和失活（E 和 J）的归一化电导 (G/Gmax) 电压关系。误差线表示平均值±SEM。在任何条件下，激活和失活的半最大激活和失活 (V 1/2 ) 和斜率值 ( k ) 没有差异（P > 0.9999，Kruskal-Wallis 检验与 Dunn post hoc）；表 S2 中显示的值。磷处理之间的比较值如所示；有关完整的统计分析，请参见表 S1。
3.3. 血管内皮生长因子-A增强腰背角突触活性，通过抑制 NRP-1 信号传导和刺突蛋白使其正常化
脊髓是感觉传递的整合者，传入的伤害感受信号在此经历收敛和调制。脊髓突触前神经传递依赖于背根神经节神经元动作电位放电和神经递质释放。根据这些基本生理原理以及上述结果，我们被提示评估腰背角的突触活动是否受到影响。腰背角凝胶质区域神经元的自发兴奋性突触后电流 (sEPSCs) 的幅度不受 VEGF-A 的影响（图 5A 和 B和表 S1，）。相比之下，VEGF-A 应用使 sEPSC 频率增加了 ∼3.6 倍，通过用 EG00229 抑制 NRP-1 降低了 ∼57%，通过刺突蛋白降低了 ∼50%（图 5A 和 C以及表 S1）。sEPSC 的幅度和事件间隔累积分布曲线如图 5D 和 E所示。与载体对照相比，有或没有 NRP-1 抑制剂或刺突蛋白的 VEGF-A 对自发 EPSC 的累积振幅分布没有影响（图 5D和表 S1），但改变了自发 EPSCs 的累积频率分布，间隔显着更长（图 5E ）和表 S1）。总之，这些数据表明了刺突蛋白和 NRP-1 的突触前作用机制。
图 5：自发兴奋性突触后电流频率因 EG00229 对神经纤维蛋白 1 受体 (NRP-1) 的药理拮抗作用而降低。(A) 在指定条件下处理至少 30 分钟的浅背角 (lamina I/II) 中凝胶质神经元的代表性 sEPSC 痕迹。显示了所有组的 sEPSC 的幅度 (B) 和频率 (C) 的摘要。如图所示，从细胞记录的 sEPSC 幅度 (D) 和间隔间隔 (E) 的累积分布。30 μM EG00229 的灌注降低了腰背角神经元中的自发兴奋性突触传递 (A-E)。处理之间比较的P值如所示；有关完整的统计分析，请参见表 S1，sEPSC，自发兴奋性突触后电流。
3.4. 刺突蛋白和 NRP-1 的抑制在慢性神经性疼痛的神经损伤模型中赋予镇痛作用
我们使用了神经性疼痛的幸存神经损伤 (SNI) 模型，选择该模型是因为它会产生可靠且一致的疼痛敏感性增加，以评估 VEGF-A/NRP-1 通路的潜在破坏以逆转伤害感受。血管内皮生长因子-A 触发 VEGFR2 在 Y1175, 的自磷酸化，从而充当 VEGF-A 信号激活的代理。在患有 SNI 的大鼠中，鞘内施用尖峰可降低对侧（未受伤）和同侧（受伤）侧的 VEGFR2（Y1175）的磷酸化（图 6A 和 B）。这表明在慢性神经性疼痛大鼠模型中，spike 可以抑制 VEGF-A 信号传导. 损伤后 10 天，备用神经损伤有效减少了 PWT（机械性异常性疼痛，图 6C和表 S1， ）。刺突蛋白的脊髓给药以剂量依赖性方式显着增加 PWT（图 6C和表 S1），持续 5 小时。与载体处理的受伤动物相比，曲线下面积的分析证实了机械异常性疼痛的剂量依赖性逆转（图 6D和表 S1）。用尖峰注射的雌性大鼠观察到类似的结果（图 6E 和 F）。最后，用 EG00229 抑制 NRP-1 信号传导也逆转了缩爪阈值（图 6G 和 H以及表 S1 ）。
图 6：严重的急性呼吸综合征冠状病毒 2 的刺突蛋白和神经纤毛蛋白-1 受体 (NRP-1) 拮抗作用可逆转 SNI 诱导的机械性异常性疼痛。手术后 10 天，备用神经损伤 (SNI) 引起机械性异常性疼痛。(A) SNI 后大鼠脊髓背角突触前部位 NRP-1、总和 pY1175 VEGF-R2 水平的代表性免疫印迹。在鞘内注射刺突蛋白的受体结合结构域 (2.14 μg/5 μL) 后 3 小时（即在抗异常性疼痛高峰）收集组织。(B) 带有散点图的条形图显示 n = 4 个样本的量化，如 (A) (* P< 0.05，Kruskal-Wallis 检验）。SNI 大鼠（雄性）鞘内注射盐水（载体）或 4 剂刺突蛋白受体结合结构域（0.00214-2.14 μg/5 μL）的缩爪阈值（it）；n = 6 至 12) (C) 雌性大鼠中 2.14 μg/5 μL 的尖峰剂量，或雄性大鼠中的 NRP-1 抑制剂 EG00229 (2 μg/5 μL；n = 6) (E)。(D、F、H) 面板 C、E 和 G 中显示的数据汇总，绘制为 0 到 5 小时的曲线下面积 (AUC)。指示了P值与对照。数据显示为平均值±SEM，并通过非参数双向方差分析进行分析，其中时间是受试者内因素，治疗是受试者间因素（事后：Sidak）。通过 Mann-Whitney 检验比较 AUC。实验由对治疗不知情的研究人员进行分析。磷处理之间的比较值如所示；有关完整的统计分析，请参见表 S1，。
4。讨论
我们的数据表明，SARS-CoV-2 刺突蛋白破坏了 VEGF-A/NRP-1 的伤害性信号传导。与慢性神经性疼痛相关，尖峰否定 VEGF-A 介导的增加：（1）DRG 神经元中的电压门控钠和 N 型钙电流密度；(2) DRG 神经元的自发放电；(3) 脊髓神经传递；(4)机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。因此，刺突蛋白在神经损伤大鼠模型中具有镇痛作用。根据报道的 COVID-19 患者 VEGF-A 水平升高，人们会期望观察到与疼痛相关的症状增加。然而，我们的数据表明，SARS-CoV-2 刺突蛋白劫持 NRP-1 信号传导以改善 VEGF-A 介导的疼痛。这增加了疼痛作为 COVID-19 的早期症状可能直接被 SARS-CoV-2 刺突蛋白抑制的可能性。我们的结果不排除刺突或其他病毒蛋白的替代片段可能具有伤害感受的可能性。利用 SARS-CoV-2 刺突蛋白的这种非典型功能，可能会产生一类新型的疼痛疗法。
VEGF-A 导致疼痛的临床发现得到以下观察结果的支持：在骨关节炎中，滑液中 VEGF 表达增加与更高的疼痛评分相关。据报道，血管内皮生长因子-A 可增强正常、神经损伤和糖尿病动物的疼痛行为。已显示阻断 VEGF-A 可减少啮齿动物的伤害感受，并通过改善神经元恢复和传导、降低感觉神经元中促凋亡的 Caspase-3 水平、防止神经灌注和表皮感觉纤维损失来发挥神经保护作用。VEGF-A 基因的可变剪接产生了几种含有 121 到 206 个氨基酸残基的成熟蛋白同工型，其中 VEGF-A165a通过对瞬时受体电位通道和 ATP 门控嘌呤能 P2X2/3 受体的敏化而具有促性感受 23 DRG 神经元。VEGF-A165b 是一种 VEGFR2 部分激动剂，可与 VEGF-A165a 竞争结合 VEGFR2。VEGF-A165a 同种型也与 NRP-1 辅助受体结合，而 VEGFA165b 则不。因此，剪接异构体 (VEGF-Aa/b) 的平衡可能决定了对感觉神经元的伤害性影响。
我们的数据显示，VEGF-A 在雄性和雌性幼稚大鼠中引起持久（长达 24 小时）的机械异常性疼痛和热痛觉过敏，从而支持 VEGF-A 具有伤害性感受的前提。类风湿性关节炎患者血清中的血管内皮生长因子增加。与有症状个体相比，无症状个体血清中的 VEGF-A 水平显着降低，并且与健康对照中的水平相匹配。相反，与健康对照组相比，COVID-19 患者的 VEGF-A 辅助受体 NRP-1 转录水平升高。NRP-1 是一种二聚体跨膜受体，可调节多效生物学过程，包括轴突引导、血管生成和血管通透性。在慢性神经性疼痛中，据报道 DRG 神经元中 NRP-1 和 VEGF-A 的同时增加。我们观察到，使用 EG00229 对 NRP-1 的 VEGF-A 结合 b1b2 结构域的药理学拮抗作用导致 SNI 中的机械异常性疼痛减少。与此相关的推论是，VEGF-A 诱导的 DRG 致敏和幼稚大鼠相关的异常性疼痛/痛觉过敏被 NRP-1 拮抗作用消除。这项工作确定了迄今为止未知的 VEGF-A/NRP-1 信号在疼痛中的作用。我们的工作模型表明，NRP-1 的 VEGF-A 参与被刺突蛋白阻断，因此降低了两个关键的伤害性电压门控钠通道的活性，可能是 Na v 1.7 和钙 (Ca v 2.2) 通道（图 1D）。刺突蛋白导致的自发DRG神经元放电减少转化为疼痛减轻（图1D）。VEGF-A/NRP-1 信号下游的分子级联特征有待进一步研究。
总之，我们的数据表明，使用 SARS-CoV-2 刺突或 NRP-1 抑制剂 EG00229 干扰 VEGF-A/NRP-1 具有镇痛作用。对于癌症，该途径已被广泛靶向用于抗血管生成。靶向 VEGF-A 的单克隆抗体（贝伐单抗，阿瓦斯汀）已被用作癌症治疗。针对 NRP-1 的 VEGF 结合位点的 NRP-1 抗体 MNRP1685A (Vesencumab) 的 1a 期临床试验在癌症患者中具有良好的耐受性，62但注意到神经病变。造成这种情况的可能原因包括抗 VEGF-A 疗法可能靶向具有神经保护作用的可变剪接 VEGF-A165b 异构体。值得注意的是，VEGF-A165b 同种型以与 VEGF165a 相同的亲和力与 VEGFR2 结合位点结合，但不与辅助受体神经纤维蛋白 1 (NRP-1) 结合，因此可作为 VEGF-A- 的抑制剂。 NRP-1 通路。3抗 VEGF-A 疗法可以同时抑制涉及多种 VEGF-A 同种型的促痛觉和抗痛觉通路，因此随之而来的平衡丧失可能有利于伤害感受器致敏。在这里，我们正在专门研究 VEGF-A165a 与 NRP-1 的 b1 结构域结合后的下游作用。与已开发用于癌症治疗的广泛 VEGF-A 抑制剂相比，靶向这种相互作用可能更具特异性。因此，我们的临床前工作为在未来的临床试验中靶向 VEGF-A/NRP-1 伤害性信号轴提供了理论依据。
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