APELA基因与妊娠高血压疾病的 病例对照研究
摘要妊娠期高血压疾病 (HDP) 被认为包含一组多因素遗传疾病。最近，据报道，APELA基因敲除小鼠表现出类似 HDP 的症状，包括由于胎盘血管生成缺陷导致的蛋白尿和血压升高。本研究的目的是通过病例对照研究确定人类APELA基因中 HDP 与单核苷酸变异或单倍型之间的关联。受试者是 196 名患有 HDPs 的孕妇和 254 名没有 HDPs 的妇女的对照组。从APELA中选择了六个单核苷酸变体（rs2068792、rs13120303、rs4541465、rs13152225、rs78639146 和 rs67448487）基因区。尽管在病例对照研究中每个单核苷酸多态性没有显着差异，但 HDP 组中 TA 单倍型 rs4541465-rs67448487 的频率显着高于对照组，尤其是在妊娠期高血压患者中。结果表明APELA基因可能是HDP的疾病易感基因。
一、简介孕产妇死亡率，即由于与怀孕或分娩有关的可预防并发症而导致的死亡，是一个国际卫生保健问题，每天导致大约 810 名妇女死亡。世界卫生组织妇女、儿童和青少年健康全球战略的目标（可持续发展目标 3：确保健康的生活方式，促进所有年龄段所有人的福祉，目标是到 2030 年将全球孕产妇死亡率降低到每 100,000 例活产中 70 例以下。妊娠期高血压疾病 (HDP) 很常见：它们发生在 3% 至 5% 的孕妇中（每 10,000 例以上年）在日本，世界上约 7.5% 的怀孕。日本在 2018 年改变了 HDP 的定义和分类，将妊娠期慢性高血压 (CH) 新纳入 HDP。因此，HDPs 目前被定义为妊娠期高血压。HDPs 的许多危险因素已被报道，如高体重指数、肾脏疾病、高龄妊娠和牙周病。因此，由于患有高血压、肥胖和糖尿病等慢性疾病的孕妇人数增加，报告的 HDP 发病率正在增加。近年来，由于生育延迟，日本的 HDP 发病率也被认为正在增加，因为这些生活方式疾病的发生频率往往会随着年龄的增长而增加。先兆子痫 (PE) 是一种仅发生在妊娠期和产后期的疾病，是导致胎儿和母亲发病和死亡的主要原因。此外，有 PE 病史的女性在以后的生活中发生心血管事件的风险增加。尽管 PE 是所有孕产妇死亡病例中至少 12% 的孕产妇死亡原因，但其分子病因仍不清楚。HDPs 被认为包括一组多因素遗传疾病。在我们过去的研究中，我们报道了人类基质相互作用分子 1 ( STIM1 ) 基因中HDP 与单核苷酸变异体 (SNV) 或单倍型之间的关联，该基因调节 Ca 2+浓度和血管收缩。此外，在基于单倍型的PPP1R12A基因病例对照研究中，发现对照组和 HDP 组之间存在显着差异。
肽激素 APELA（apelin 受体，也称为 Toddler、ELA 或 ELABELA）于 2013 年被发现。它通过 apelin 受体 (APJ) 在斑马鱼胚胎心血管系统的形成中发挥重要作用。apelin 的词源被认为源自“一种在身体的许多生理过程中具有多效作用的脂肪因子”。APELA是APJ的内源性配体，与apelin竞争。APELA 作为一种循环激素分泌，以旁分泌和内分泌方式起作用，它由一些器官表达，包括胎盘和肾脏。发现APELA基因敲除小鼠表现出类似 PE 的症状，包括由于胎盘血管生成缺陷导致的蛋白尿和血压升高。
本研究的目的是通过病例对照研究确定人类APELA基因中 HDP 和 SNV 或单倍型之间的关联。
2。材料和方法2.1。科目
本研究组包括 196 名患有 HDPs 的日本孕妇，以及 254 名没有 HDPs 的日本妇女作为对照组。目标样本量使用以下标准确定：病例组需要100人或更多，而对照组的受试者人数应为200人左右，因为对照组的受试者人数最好是两倍比病例组。所有参与者都是从 2006 年至 2015 年期间访问日本东京日本大学医学院板桥医院妇产科的患者和健康志愿者中招募的。与对照组相比，HDP 组的数据分析根据疾病类型分为三组：妊娠期高血压（GH）、PE或叠加性PE（SPE）。HDP 定义为妊娠 20 周后出现收缩压 ≥ 140 mmHg 或舒张压 ≥ 90 mmHg，产后 12 周时改善。GH 定义为妊娠 20 周后出现无蛋白尿的高血压，并在分娩后 12 周恢复正常。PE 定义为妊娠 20 周后出现蛋白尿并在分娩后 12 周恢复正常的高血压。如果妊娠前或妊娠 20 周前出现以蛋白尿为唯一症状的肾脏疾病，则 SPE 定义为妊娠 20 周后出现的高血压；如果妊娠前既往存在高血压和蛋白尿，则高血压在妊娠 20 周后恶化或孕20周前，或孕前或孕20周前出现高血压，孕20周后出现蛋白尿。高血压定义为收缩压 ≥ 140 mmHg 或舒张压 ≥ 90 mmHg。蛋白尿定义为在 24 小时尿液中检测到≥300 mg/天的蛋白质。不符合 HDP 诊断标准的女性被纳入对照组。对照组包括没有任何医疗或产科并发症证据的健康初产妇。HDPs和亚型的诊断是根据可观察的临床过程进行的，原则上，临床数据是在怀孕期间获得的。
本研究方案经日本大学医学院伦理委员会批准（批准号 249-1）。每个参与者都获得了书面知情同意书。
2.2. 基因分型
APELA基因位于染色体4q32.3上，包含四个外显子（图1）。
图 1. APELA基因 的组织结构和 SNV 的位置。APELA基因位于 4q32.3 。箭头表示 SNV 的位置。打开和闭合的框分别表示外显子中的未翻译区域和翻译区域。线表示内含子。
选择人类APELA基因中的6个SNV作为关联实验的遗传标记。所有六个 SNV 均选自 NCBI 网站（登录号 rs2068792、rs13120303、rs4541465、rs13152225、rs78639146 和 rs67448487）作为在日本人群中次要等位基因频率 (MAF) 超过 2% 的 SNV。其中四个 SNV 是不相邻的：rs13120303 和 rs13152225 位于内含子中；rs4541465 是同义的 SNV，不会导致氨基酸的变化；rs2068792位于5′-UTR；rs78639146 和 rs67448487 位于 3'-UTR。
每个SNV周围的MAF和核苷酸上下文序列如下：rs2068792，MAF（C）= 0.05，5'-TAAGTCATTCTCTTCTTGGAGCTTTGGAGTACACTTCCACTAAAGTTATA-3'；rs13120303, MAF (G) = 0.43, 5'-GATATTACTATTAAGATGTTGCTATTTGCTCAACGATGGAGTTAAAAAAA-3'; rs4541465, MAF (T) = 0.41, 5'-TGCCTCTCCATTCACGAGTACCCTTCCCTGAGGTATTTCTGACAGAAAAT-3'; rs13152225, MAF (A) = 0.14, 5'-AAACTATGACATTATTAGTATATTCCTTCAGCTCTCTTATACTTGCTGCT-3'; rs78639146, MAF (A) = 0.02, 5'-ACATTTGAACTCCATTTTTGAAAAAATAAAAACTAACACCCACGAAAAAT-3'; 和 rs67448487, MAF (A) = 0.15, 5'-TAATCCCAGCACTTTGGGAATCTAAACAGGAGGATTGCTTGAAGCAAAGA-3'。
使用苯酚和氯仿提取方法从外周血白细胞中获得所有基因组 DNA。用分光光度计将核酸浓度调至 100 ng/μL。TaqMan PCR 和 TaqMan SNP Genotyping Assay（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）用于根据制造商的说明确定基因型。将提取的 DNA、TaqMan Universal PCR Master Mix、Assay Mix（TaqMan 探针和引物）和蒸馏水混合并注入 96 孔板进行反应。对于 DNA 扩增，将 DNA 置于 2720 热循环仪（Applied Biosystems）中，设置为 95°C 10 分钟，然后在 92°C 15 秒，60°C 1 分钟，50 到 70 个循环，最后保持在 4 °C。ABI PRISM 7700 序列检测器（PE Biosystems，Rotkreuz，
2.3. 统计分析rs2068792 和 rs78639146 的分析被省略，因为在基因型和单倍型的参与者中没有发现变异。所有连续变量的临床数据均显示为平均值±标准差 (SD)。使用 Mann-Whitney U 检验分析 HDP 和对照组之间连续变量的差异。使用Fisher精确检验，分析了HDP和对照组之间基因型的分布。使用 SNPAlyze 第 9 版软件（Dynacom，Chiba，Japan）进行连锁不平衡分析和基于单倍型的病例对照研究。单倍型块定义为|D'| > 0.5的值将所有四个SNV位置分配给同一块（数据未显示）。选择 r 2 <0.5 的 SNV 作为标记。r 2rs13120303 和 rs4541465 之间以及 rs13152225 和 rs67448487 之间的值 > 0.5（表 1），在基于单倍型的病例对照研究中，具有更高 MAF 的 SNV 是首选。
表 1. 连锁不平衡模式 (r 2 )。
在基于单倍型的病例对照研究中，频率小于 0.02 的单倍型被排除在外。通过χ 2检验检查频率分布。显着性建立在p < 0.05。使用适用于 Windows 的 SPSS®软件第 25 版（SPSS，Chicago，IL，USA）进行统计分析。
3. 结果研究参与者的临床特征见表2。
表 2. 研究参与者的特征。
HDP、PE和SPE组的高血压家族史患病率高于对照组。HDP、GH、PE和SPE组孕前SBP、DBP和BMI较高，分娩胎龄和新生儿出生体重低于对照组。HDP、GH和PE组分娩时的BMI高于对照组。HDP、PE和SPE组5分钟时的Apgar评分低于对照组。
基因型、显性模型、隐性模型和等位基因如表3所示。
表 3. 对照组、HDP、GH、PE 和 SPE 组之间的基因型和等位基因分布。
对照组中四个 SNV 的基因型频率分布符合 Hardy-Weinberg 平衡，p值 > 0.05（rs13120303：p = 0.06；rs4541465：p = 0.24；rs13152225：p = 0.22；和 rs67448487：p = 0.17 ）。
在分析的 SNV 中，HDP 组和对照组之间的等位基因或基因型频率分布没有显着差异。GH、PE和SPE组之间的基因型和等位基因没有显着差异。
基于单倍型的对照研究结果如表4所示。
表 4. 使用单核苷酸变体的对照组和 HDP 组之间基于单倍型的病例对照研究。
TA 单倍型 rs4541465-rs67448487 在 GH 组中比在对照组中更常见，排列p值为 2%。TA 单倍型 rs4541465-rs13152225 在 HDP 和 GH 组中也比对照组更常见。没有显示具有这种特定单倍型的受试者具有特定的临床数据（数据未显示）。
4。讨论
已知大约每 20 名孕妇中就有 1 名发生 HDP，如果它们发生在妊娠 4 周内，它们可能会变得严重，因此需要谨慎。HDPs 被认为是由一组多因素遗传疾病组成，尽管近年来已经进行了 HDPs 的关联研究，但尚未确定特定的致病基因。高血压、HDPs 病史、高血压家族史、肥胖、高龄孕妇、糖尿病、多胎妊娠、初产妇和肾脏疾病是 HDPs 的已知危险因素。在本研究中，HDP 组和对照组在妊娠期 BMI 和高血压个体数量（7.78% vs. 1.45%）、高血压家族史（35.9% vs. 23.1%）、或有 HDPs 病史（31.0% vs. 0.0%），但患有糖尿病（0.0% vs. 0.48%）或肾病（2.29% vs. 0.97%）的人数，初产妇比例（58.2% vs. . 63.1%)，并且怀孕期间增加的体重（9.4 公斤对 10.2 公斤）在各组之间没有显着差异。HDP 组和对照组的分娩年龄没有显着差异 (31. 8 ± 6.3 年 vs. 31.2 ± 6.7 年），但 SPE 组和对照组之间存在显着差异（35.3 ± 6.1 年 vs. 31.2 ± 6.7 年）。在比较 HDP 组和对照组时，分娩时的胎龄（35.1 ± 4.0 周 vs. 38.7 ± 1.7 周）、新生儿出生体重（2150.8 ± 863.9 g vs. 3042.5 ± 479.7 g）和5 分钟时的 Apgar 评分（7.7 ± 2.3 对 8.7 ± 0.8），但不是在怀孕期间增加的体重（9.4 ± 6.2 kg 对 10.2 ± 4.2 kg）。由于 HDPs 尚无安全有效的治疗方法，且 HDPs 产后消退，因此剖宫产往往在足月妊娠前（妊娠 37 ～ 42 周）进行，低出生体重儿比例正在增加. 但 SPE 组和对照组之间存在显着差异（35.3 ± 6.1 年对 31.2 ± 6.7 年）。在比较 HDP 组和对照组时，分娩时的胎龄（35.1 ± 4.0 周 vs. 38.7 ± 1.7 周）、新生儿出生体重（2150.8 ± 863.9 g vs. 3042.5 ± 479.7 g）和5 分钟时的 Apgar 评分（7.7 ± 2.3 对 8.7 ± 0.8），但不是在怀孕期间增加的体重（9.4 ± 6.2 kg 对 10.2 ± 4.2 kg）。由于 HDPs 尚无安全有效的治疗方法，且 HDPs 产后消退，因此剖宫产往往在足月妊娠前（妊娠 37 ～ 42 周）进行，低出生体重儿比例正在增加. 但 SPE 组和对照组之间存在显着差异（35.3 ± 6.1 年对 31.2 ± 6.7 年）。在比较 HDP 组和对照组时，分娩时的胎龄（35.1 ± 4.0 周 vs. 38.7 ± 1.7 周）、新生儿出生体重（2150.8 ± 863.9 g vs. 3042.5 ± 479.7 g）和5 分钟时的 Apgar 评分（7.7 ± 2.3 对 8.7 ± 0.8），但不是在怀孕期间增加的体重（9.4 ± 6.2 kg 对 10.2 ± 4.2 kg）。由于 HDPs 尚无安全有效的治疗方法，且 HDPs 产后消退，因此剖宫产往往在足月妊娠前（妊娠 37 ～ 42 周）进行，低出生体重儿比例正在增加. 分娩胎龄（35.1 ± 4.0 周 vs. 38.7 ± 1.7 周）、新生儿出生体重（2150.8 ± 863.9 g vs. 3042.5 ± 479.7 g）和 5 分钟 Apgar 评分（7.7 ± 2.3 vs. 8.7 ± 0.8），但不是在怀孕期间增加的体重（9.4 ± 6.2 kg vs. 10.2 ± 4.2 kg）。由于 HDPs 尚无安全有效的治疗方法，且 HDPs 产后消退，因此剖宫产往往在足月妊娠前（妊娠 37 ～ 42 周）进行，低出生体重儿比例正在增加. 分娩胎龄（35.1 ± 4.0 周 vs. 38.7 ± 1.7 周）、新生儿出生体重（2150.8 ± 863.9 g vs. 3042.5 ± 479.7 g）和 5 分钟 Apgar 评分（7.7 ± 2.3 vs. 8.7 ± 0.8），但不是在怀孕期间增加的体重（9.4 ± 6.2 kg vs. 10.2 ± 4.2 kg）。由于 HDPs 尚无安全有效的治疗方法，且 HDPs 产后消退，因此剖宫产往往在足月妊娠前（妊娠 37 ～ 42 周）进行，低出生体重儿比例正在增加. 4 ± 6.2 千克与 10.2 ± 4.2 千克）。由于 HDPs 尚无安全有效的治疗方法，且 HDPs 产后消退，因此剖宫产往往在足月妊娠前（妊娠 37 ～ 42 周）进行，低出生体重儿比例正在增加. 4 ± 6.2 千克与 10.2 ± 4.2 千克）。由于 HDPs 尚无安全有效的治疗方法，且 HDPs 产后消退，因此剖宫产往往在足月妊娠前（妊娠 37 ～ 42 周）进行，低出生体重儿比例正在增加.
从牛胃中提取的 Apelin 作为 APJ 的内源性配体，于 1998 年由 Tatemoto 等人首次鉴定。apelin/APJ 系统调节体液稳态，扩张外周血管，增强心肌收缩力。据报道，apelin 和 APELA 都通过 APJ 起作用，并且它们具有相似的功能。然而，关于 APELA 的生物学特性和功能知之甚少。母体心血管稳态和胎盘发育的关键方面受 APELA 信号传导机制的调节。APELA 在一氧化氮 (NO) 的产生中发挥作用，以增加子宫血流量，促进细胞滋养层侵袭和血管生成，并减少胎盘氧化应激引起的细胞凋亡。APELA 在促进滋养层分化为侵入性绒毛外滋养层和随后的螺旋动脉重塑方面具有旁分泌信号传导作用。因此，缺乏 APELA 可能会导致 PE 样症状，包括胎盘血管功能受损。患有 PE 的胎盘的特点是内皮功能障碍和滋养细胞侵袭不良。
许多研究人员现在都在报道 APELA。德尼兹等人。据报道，PE 组，尤其是患有严重 PE 的女性，母体血液中的 APELA 量和 NO 水平显着低于对照组。然而，普里查德等人。据报道，PE 患者的母体循环或胎盘中的 APELA 水平没有降低。另一组报道，由于 APELA 对人滋养层细胞迁移和增殖的影响，晚发性 PE 的 mRNA、蛋白表达和 APELA 水平显着降低。APELA 的输注具有血管扩张活性，并且在大鼠实验中已被证明可以降低血压。虽然细胞内信号转导机制尚未阐明，但有人提出 APELA 可能通过以 NO 非依赖性方式抑制 ERK 活化而具有降压作用。APELA 可能是治疗肾缺血再灌注损伤和急性肾损伤的潜在候选药物。APELA 缺乏可能导致胎盘缺血和母体肾脏/内皮功能障碍，并导致孕妇出现 GH 或 PE。Apelin 已被证实与高血压的发生和发展密切相关，并且 Apelin 和 APELA 共享 APJ 并表现出相似的心血管特征。先前的一项研究报道，GH 组的血浆 APELA 浓度高于对照组。在 2019 年进行的一项初步研究中，Li 等人。证明由于血管功能受损，原发性高血压患者的循环 APELA 水平较低。
本研究表明，APELA基因的单倍型与HDPs，尤其是GH有关。为了确定与疾病关联最强的区域，有必要对附近的多态性进行关联研究。对于这样的调查，基于单倍型的病例对照研究可能比基于个体 SNV 的分析更有利，特别是在识别多因素疾病的易感性标记方面。单倍型是来自一个父母的染色体上的等位基因序列，它们比单个 SNV 更多样化。因此，通过添加使用单倍型的关联分析，可以提高疾病易感基因的检测灵敏度。此外，包含使用单倍型的关联分析将大大减少分析所需的时间和精力，并能够有效地确定疾病易感性的存在或不存在。事实上，我们使用单个 SNV 确定了重要的遗传标记，即使患者和对照组之间 SNV 的等位基因或基因型频率的总体分布没有显着差异 。重要的TA单倍型，即rs4541465，它是同义的SNV，和rs67448487，位于3'-非翻译区（UTR），不直接影响氨基酸序列的变化或APELA基因的构建。在本研究中，存在与 HDP 中经常观察到的单倍型相关的变异，这些变异可能通过降低APELA基因的功能和表达水平与疾病的发作有关。
杨等人。据报道，APELA基因 5'-UTR 的罕见变异与 PE 相关，但迄今为止还没有研究通过基于单倍型的病例对照研究表明APELA基因与 HDP 之间的关系 。本研究中鉴定的 HDP 敏感单倍型可能会影响APELA中导致遗传疾病的变体。为了明确证明这一点，有必要调查具有APELA易感性单倍型的参与者的整个外显子区域基因通过核苷酸测序。尽管尚未显示具有这种特定单倍型的受试者具有特定的临床数据，但有必要关注启动子区域和翻译区域以寻找可能与未来本研究中发现的单倍型相关的变体。
在本研究中，通过仅选择没有任何医疗或产科并发症证据的健康初产妇，对对照组应用了严格的标准。对照组的这些严格标准确保了我们研究数据的样本置信度增加。虽然这项研究的样本量不大，但疾病组的受试者人数至少需要 100 人，而对照组的受试者人数应该在 200 人左右，因为最好有两倍的人数。在病例对照研究中，对照组的受试者比疾病组的受试者高。未来通过增加受试者数量，遗传因素的关联将变得更加清晰。
5。结论
HDP组中TA单倍型rs4541465-rs67448487的频率显着高于对照组，尤其是在妊娠期高血压患者中。这些结果表明APELA基因可能是HDPs的疾病易感基因。如果这些发现得到证实，预计进一步的研究将确定 HDP 的潜在生物学机制与这些基因的功能变体之间的关系。
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