过表达 BCRP、MRP1、MRP2、MRP3 和 MRP4 的 SN38 抗性 T47D 乳腺癌...
过表达 BCRP、MRP1、MRP2、MRP3 和 MRP4 的 SN38 抗性 T47D 乳腺癌细胞亚系的表征摘要
背景
尽管已经建立了几种新的抗性乳腺癌细胞系，但只有少数抗性乳腺癌细胞系过表达乳腺癌抗性蛋白 ( BCRP )。本研究的目的是利用伊立替康的一种活性代谢物 SN38（7-乙基-10-羟基喜树碱）建立新的抗性乳腺癌细胞系过表达BCRP ，并发现与多药耐药性相关的基因和机制。
方法
通过逐渐增加 SN38 浓度从野生型 T47D 细胞中选择 SN38 抗性 T47D 乳腺癌细胞亚系。通过 3-(4,5-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 测定法评估细胞对抗癌药物的敏感性。使用 RT-qPCR 和蛋白质印迹分析检查抗性相关转运蛋白的表达谱。使用流式细胞术测定抗性细胞中的细胞内荧光染料积累。
结果
SN38 抗性 T47D 乳腺癌细胞亚系 T47D/SN120 和 T47D/SN150 是在野生型 T47D 细胞分别长期暴露于 120 nM 和 150 nM SN38 后（超过 16 个月）建立的。与野生型亲本细胞相比，T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞对 SN38（分别为 14.5 和 59.1 倍）、伊立替康（分别为 1.5 和 3.7 倍）和拓扑替康（分别为 4.9 和 12 倍）的抗性更强. T47D/SN120 和 T47D/SN150 亚系都对各种抗癌药物具有交叉耐药性。这些抗性亚系过表达MRP1、MRP2、MRP3、MRP4和BCRP的 mRNA 。DNA 甲基化酶抑制剂 5-aza-2'-deoxycytidine 和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素 A 增加了BCRP、MRP1、MRP2、MRP3的表达水平和T47D/WT 细胞中的MRP4转录物。与 T47D/WT 细胞相比，发现 T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞中的荧光染料积累较低。然而，用已知的化学增敏剂治疗增加了细胞内荧光染料的积累和抗肿瘤剂的敏感性。
结论
T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞过表达MRP1、MRP2、MRP3、MRP4和BCRP，这可能是由于通过 DNA 高甲基化和组蛋白去乙酰化抑制表观遗传基因沉默。尽管这些耐药细胞对各种抗癌药物的耐药性高于其亲本野生型细胞，但通过化学增敏剂治疗克服了多药耐药性。这些表达抗性蛋白的 SN38 抗性 T47D 乳腺癌细胞亚系可用于开发新的化学增敏剂。
背景
乳腺癌不仅是世界范围内经常被诊断出的癌症，它也是女性癌症相关死亡的主要原因。乳腺癌的治疗主要分为两类：包括手术、放射或两种方式的局部治疗；和全身治疗，包括细胞毒化学疗法、内分泌疗法、生物疗法或这些疗法的组合。全身治疗，用于辅助、新辅助和姑息治疗，在不同阶段的乳腺癌治疗中发挥着重要作用。事实上，全身性药物在治疗开始时对 69-95% 的原发性乳腺癌有效和 50% 的转移性癌症。然而，由于化疗耐药性的发展，癌症进展通常发生在不同持续时间的化疗后，化疗耐药性分为原发性耐药性和获得性耐药性。原发性耐药包括尽管使用了适当的初始化疗但无反应的病例，在治疗期间肿瘤继续生长。获得性耐药包括肿瘤细胞最初似乎对化疗反应良好但由于反复暴露而对抗癌药物产生耐药性的情况; 在这种情况下，细胞对某些同类药物具有抗药性，但对不同类别的药物敏感。然而，观察到最终对多种结构和功能明显不同的抗癌药物产生交叉耐药性；这种现象被称为多药耐药性 (MDR)。
MDR的发生机制和途径复杂且多因素。MDR的机制之一与抗癌药物转运蛋白的改变有关。经典的 MDR 机制之一涉及由于肿瘤细胞膜中药物外排泵的表达增加而导致药物积累减少。这种 MDR 表型由 ATP（三磷酸腺苷）结合盒 (ABC) 转运蛋白介导，包括P-糖蛋白( Pgp )和多药耐药蛋白 ( MRP ) 家族的成员。另一种新型转运蛋白，乳腺癌抗性蛋白 ( BCRP )，已被鉴定为 ABC 半转运蛋白，分布于胎盘和各种癌症类型 。同时，据报道，抗癌药物从细胞核到细胞质的重新分布与非 ABC 转运蛋白介导的 MDR 有关。肺抗性蛋白 ( LRP ) 参与抗癌药物的核质转运和细胞质隔离。MDR 的另一种机制与拓扑异构酶的改变有关。
基于对耐药机制的全面认识，最近有关于乳腺癌抗癌药物耐药机制的研究报道。此外，探索耐多药的机制，寻找耐药性的分子靶点对于开发治疗癌症的新治疗剂具有重要意义。因此，进一步的研究对于更好地了解乳腺癌中的 MDR 机制和开发各种类型的耐药癌细胞系至关重要。
最近，已经建立了几种新的抗性乳腺癌细胞系。值得注意的是，尽管在原发性乳腺癌和正常乳腺组织中都观察到BCRP表达 ，但只有少数耐药乳腺癌细胞系过度表达BCRP 。对喜树碱衍生的拓扑异构酶 I 抑制剂拓扑替康具有抗性的肿瘤细胞系已显示过度表达BCRP ，并对CPT11、SN38（7-乙基-10-羟基喜树碱）和 9-氨基喜树碱具有显着的交叉抗性。_ SN38 是伊立替康的活性代谢物，通过抑制 DNA 拓扑异构酶 I ，对肿瘤细胞的细胞毒性比伊立替康强得多。在乳腺癌细胞系中，MDA-MB 231 为雌激素受体 (ER) 阴性，而 T47D 和 MCF-7 为 ER 阳性。最近，产生了抗 SN-38 的 MCF-7 和 MDA-MB-231 亚系。然而，到目前为止，还没有开发出抗 SN38 的乳腺癌细胞 T47D 亚系。因此，本研究的具体目的是建立抗 SN38 的乳腺癌细胞亚系，预测转运蛋白（如BCRP ）的过表达并研究 MDR 机制。在此，我们描述了两种 SN38 抗性乳腺癌细胞系，T47D/SN120 和 T47D/SN150，其特征在于MRP1、MRP2、MRP3、MRP4和BCRP过表达。这些耐药癌细胞亚系将用于开发可以逆转耐药性的化学增敏剂。
方法
细胞培养
人乳腺癌细胞系 T47D 购自首尔国立大学（韩国首尔）癌症研究中心。细胞在补充有 10% 胎牛血清 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 的 RPMI-1640 (Gibco BRL Grand Island, NY, USA) 中培养。使细胞粘附在培养皿上并形成单层。一旦细胞达到汇合，就对其进行传代培养。
SN38抗性乳腺癌细胞亚系的建立
通过将 SN38 的浓度从 15 nM（IC 50值）逐渐增加到 120 nM（IC 50 × 8）和 150 nM（IC 50 × 10），分别在亲本 T47D 细胞中。在 16 个月的时间范围内获得了稳定的 T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞系。
细胞群倍增时间的计算
将细胞以每孔 5 × 10 4 个细胞的密度接种到 24 孔培养板中，并在 37°C 下孵育 24 小时。每 24 小时计数一次细胞数，持续 4 天。使用以下公式计算细胞倍增时间 (Td)：Td = T x log2/(log N t - log N 0 )，其中 N 0和 N t表示在一段时间内培养开始和结束时的细胞数T，分别。
使用 MTT 法进行化学敏感性测试
进行 3-(4,5-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT; Sigma-Aldrich) 测定以评估 T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞对抗癌的敏感性药物。50%抑制浓度（IC 50）定义为与未处理对照相比导致细胞数量减少50%的药物浓度。IC 50值直接由剂量反应曲线确定。电阻因子(RF)由T47D/SN120和T47D/SN150与T47D/WT细胞的IC 50值之比计算。
RNA提取和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）测定
使用 RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) 从细胞中提取总 RNA。通过 RT-qPCR 测定 mRNA 表达并标准化为 β- 肌动蛋白 mRNA 表达水平。基因以及常规和实时引物对列于表 1。
表1 PCR的引物序列
使用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（Bethesda Research Laboratories，USA）和寡（dT）引物在 37°C 下逆转录 RNA 1 小时。合成的 cDNA 用水 1:5 稀释，并使用 2.5 单位的 Taq DNA 聚合酶（TaKaRa，Tokyo，Japan）和 10 pmol 的每种引物，在规定的 PCR 条件下，使用 GeneAmp PCR 系统 9600（Perkin-Elmer-Cetus ，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。在最后一个循环后，所有 PCR 产物在 72°C 下进行最终延伸 5 分钟。PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳。qPCR 由 LightCycler® 2.0 (Roche, USA) 使用 TB Green® Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa, Tokyo, Japan) 进行。PCR 定量 (Ct) 中使用的终点定义为越过任意设置的信号阈值的 PCR 循环数。
蛋白质印迹分析
用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤细胞并在 50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、250 mM NaCl、0.5% Triton X - 100、10% 甘油、1 mM DTT、1 mM 苯甲基磺酰氟和蛋白酶中裂解抑制剂混合物（Pierce Biotechnology，Rockford，IL，USA）。将细胞裂解物离心，然后通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。使用先前描述的方法的轻微修改进行蛋白质印迹。将膜与抗MRP1（1:1000；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）、MRP2（1:5000；Sigma-Aldrich）、MRP3（1:50；Abcam，Cambridge，England）、MRP4的原代兔多克隆抗体一起孵育（1:50；美国广播公司），BCRP (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 和 GAPDH (1:6000; Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA)。然后洗涤膜并与辣根过氧化物酶偶联的二抗（BCRP和 GAPDH 为 1:2500）孵育 1 小时。然后使用 ECL 检测试剂盒 (Amersham, Piscataway, NJ, USA) 检测信号。印迹的密度通过使用 Kodak Image Station 4000MM (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA) 的光密度分析来确定。
荧光染料积累测定
将 PBS 中的细胞悬液（5 × 10 5 个细胞）在 37 °C 下暴露于 1 μM 罗丹明 123、50 nM calcein-AM 和 20 μM 米托蒽醌 1 小时。此外，将细胞在每种荧光底物与 10 nM PSC833、1 mM 丙磺舒、5 mM 丙磺舒、200 μM 染料木黄酮和 2 mM 氰化物的 PBS 溶液中在 37 °C 下孵育 1 小时。孵育后，使用检测药物荧光的流式细胞仪（FACSCalibur，Becton Dickinson，MA，USA）测定细胞荧光染料积累。聚焦的氩激光束 (488 nm) 激发层流鞘流中的细胞，随后检测到 530 nm（罗丹明 123 和钙黄绿素-AM）和 670 nm（米托蒽醌）的荧光发射以生成直方图。
筛选化学增敏剂
SN38的IC 50值是在存在和不存在针对SN38抗性T47D亚系的化学增敏剂的情况下获得的，并且该比率被定义为化学增敏指数。
确定 T47D/WT 细胞中转运蛋白的表观遗传基因沉默的参与
我们通过用 DNA 甲基转移酶抑制剂（2.5 uM 5-aza-2'-deoxycytidine）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂（100 ng / ml 曲古抑菌素）处理细胞 96 小时来测试高甲基化和去乙酰化是否参与表观遗传基因沉默A) 分别为 48 小时。
统计分析
所有实验都重复了 3 次以上。使用学生 t 检验确定数据的统计显着性。P值小于0.05被认为是显着的。
结果
抗性细胞系的建立和表征
在分别长期暴露（超过 16 个月）至 120 nM 和 150 nM SN38 后，从野生型 T47D 细胞中建立了 SN38 抗性 T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞亚系。显微镜观察显示，与其亲本细胞系相比，抗 SN38 的 T47D 亚系有一些明显的特征。在单层中，T47D/WT 细胞在大小和形状上相对一致，而抗性细胞呈现梭形形态并且尺寸更小（补充图 1）。有趣的是，T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞系的倍增时间分别比亲本细胞系（70.5±3.84 小时）短，分别为 38.0±1.33 小时和 46.7±2.64 小时（补充图 2）。
耐药细胞系对其他抗癌药物的交叉耐药性
MTT 检测显示，T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞对 SN38（分别为 14.5 和 59.1 倍）、伊立替康（分别为 1.5 和 3.7 倍）和拓扑替康（分别为 4.9 和 12 倍）的耐药性更强。野生型药物敏感的亲代细胞。除了拓扑异构酶 I 抑制剂外，T47D/SN120 和 T47D/SN150 亚系都对用于乳腺癌治疗的各种抗癌药物具有交叉耐药性，包括微管抑制剂（紫杉醇和长春碱）、抗代谢物（5-氟尿嘧啶） )、拓扑异构酶 II 抑制剂（多柔比星和米托蒽醌）、雌激素受体阻滞剂（安多昔芬）和酪氨酸激酶抑制剂（吉非替尼）（表 2）。
表2 T47D/WT、T47D/SN120和T47D/SN150细胞对SN38等抗癌药物的敏感性。药物按照T47D/SN120细胞对T47D/WT细胞的相对耐药性排序
如表2所示，两种抗性亚系都对紫杉醇和长春碱具有高度抗性。此外，T47D/SN150 细胞对 SN38、米托蒽醌和多柔比星表现出高抗性，对拓扑替康表现出中等抗性。然而，两种耐药亚系对吉非尼、安多昔芬、5-FU 和甲氨蝶呤的敏感性似乎相似。
T47D/SN 亚系中转运蛋白的表达谱
RT-qPCR 证实 T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞过表达MRP1（分别为 7 倍和 11 倍）、MRP2（分别为 795 倍和 1061 倍）、MRP3（分别为 57 倍和 96 倍，分别）、MRP4（均为 204 倍）和BCRP（分别为 536 倍和 3083 倍），与 T47D/WT 细胞相比（图1）。
图。1
MRP1、MRP2、MRP3、MRP4 和 BCRP mRNA 的逆转录定量 PCR 测定。RT-qPCR 证实 T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞过表达MRP1（分别为 7 倍和 11 倍）、MRP2（分别为 795 倍和 1061 倍）、MRP3（分别为 57 倍和 96 倍，分别）、MRP4（均为 204 倍）和BCRP（分别为 536 倍和 3083 倍），与 T47D/WT 细胞相比。列上方的数字是指与 WT 细胞相比的相对倍数增加。*, P < 0.05 vs WT ( n = 3)
通过蛋白质印迹分析确定MRP1、MRP2、MRP3、MRP4和BCRP的表达水平。将 T47D/SN150 细胞中的MRP1、MRP2、MRP3和MRP4表达水平与 T47D/SN120 细胞中的表达水平进行比较。MRP4和BCRP但不是MRP1、MRP2和MRP3的表达水平在两种抗性亚系之间显着不同（图2，补充图 3）。
图 2
MRP1、MRP2、MRP3、MRP4 和 BCRP 蛋白的蛋白质印迹分析。将 T47D/SN150 细胞中的MRP1、MRP2、MRP3和MRP4表达水平与 T47D/SN120 细胞中的表达水平进行比较。T47D/SN150 细胞过表达MRP4（2.2 倍）和BCRP（4 倍）蛋白。与表达微量BCRP的 T47D/WT 细胞相比，T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞的BCRP蛋白表达量分别高出 85.3 倍和 327.5 倍。( n = 3)
与表达微量BCRP的 T47D/WT 细胞相比，T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞的BCRP蛋白表达量分别高出 85.3 倍和 327.5 倍。与 T47D/SN120 细胞相比，T47D/SN150 细胞的BCRP表达高 4 倍（图2）。
在各种化学增敏剂存在下 SN38 抗性 T47D 亚系对 SN38 的敏感性
评估了几种化学增敏剂的作用，包括 Pgp [维拉帕米、PSC833 和 7,3',4-三甲氧基黄酮 (TMF)]、MRP（丙磺舒）和 BCRP（染料木黄酮）抑制剂，对 SN38 耐药的 T47D 亚系 . 在 Pgp 抑制剂中，只有 TMF 对 SN38 具有浓度依赖性的化学增敏作用。丙磺舒和染料木黄酮也以浓度依赖性方式使 SN38 抗性 T47D 亚系对 SN38 敏感（图3）。丙磺舒的化学增敏作用在 T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞之间相似，而 T47D/SN150 细胞中的 TMF 和染料木黄酮的化学增敏作用比 T47D/SN120 细胞更敏感。如表 3所示，化学增敏指数的计算方法是IC 50相除。不存在化学增敏剂时的值与其存在时的值。在两种细胞系中丙磺舒（5 和 50 μM）和染料木黄酮（1 和 10 μM）的化学增敏指数分别为 1.3-2.0 和 1.2-10.8，而维拉帕米（1 和 10 μM）和 PSC833（5 和50 nM) 均小于 1.0，但 T47D/SN120 细胞系中的 PSC833 除外，其化学增敏指数为 1.3。
图 3
在各种化学增敏剂存在下，抗 SN38 的 T47D 亚系对 SN38 的敏感性。评估了几种化学增敏剂对 SN38 耐药 T47D 亚系的影响，包括Pgp [维拉帕米、PSC833 和 7,3',4-三甲氧基黄酮 (TMF)]、MRP（丙磺舒）和BCRP （染料木黄酮）抑制剂。在Pgp抑制剂中，只有 TMF 对 SN38 具有浓度依赖性的化学增敏作用。Probenecid 和染料木黄酮还以浓度依赖性方式使 SN38 抗性 T47D 亚系对 SN38 敏感。( n = 3)。副总裁，维拉帕米；TMF，7,3',4-三甲氧基黄酮；PB，丙磺舒；GS，染料木黄酮
表 3 化学增敏剂对 SN38 耐药 T47D 亚系的影响
T47D/WT 细胞中 MRP1、MRP2、MRP3、MRP4 和 BCRP 的表观遗传基因沉默的参与
接下来，我们研究了在用 2.5 μM 5-aza-2'-deoxycytidine 处理 96 小时或 100 ng/mL 曲古抑菌素 A (TSA) 后，MRP1、MRP2、MRP3、MRP4和BCRP是否可以在 T47D/WT 细胞中被表观遗传诱导。 48 小时。RT-qPCR 表明 5-aza-2'-deoxycytidine 诱导 T47D/WT 细胞中MRP2、MRP3、MRP4和BCRP的 mRNA 表达，而 TSA 诱导MRP1、MRP2、MRP4和BCRP的 mRNA 表达（图 2）。4）。
图 4
5-aza-2'-deoxcytidine (AdC) 和 trichostatin A (TSA) 对 T47D/WT 细胞中 MRP1、MRP2、MRP3、MRP4 和 BCRP 表达的影响。RT-qPCR 表明 5-aza-2'-deoxycytidine 诱导T47D/WT 细胞中MRP2、MRP3、MRP4和BCRP的 mRNA 表达，而 TSA 诱导MRP1、MRP2、MRP4和BCRP的 mRNA 表达。*, P < 0.05 与 CTL ( n = 4)
T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞中的荧光染料积累减少
测定荧光染料积累以估计 T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞中转运蛋白的功能活性。Calcein AM 和米托蒽醌分别用作 MRP 和 BCRP 的荧光底物，并使用流式细胞仪检测。与 T47D/WT 细胞相比，T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞中两种底物的积累均减少。然而，在用抑制剂丙磺舒和染料木黄酮处理后，两种底物的积累都有所增加（图 5-6）。
图 5
T47D/WT、T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞的细胞内 calcein-AM 积累。与 T47D/WT 细胞相比，T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞中钙黄绿素 AM 的积累减少。然而，在用 MRP 抑制剂（丙磺舒）和 ATP 耗尽氰化物治疗后，钙黄绿素 AM 的积累增加。*, P < 0.05 vs WT ( n = 3)
图 6
T47D/WT、T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞的细胞内米托蒽醌积累。与 T47D/WT 细胞相比，T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞中的米托蒽醌积累减少。然而，在用 BCRP 抑制剂（染料木黄酮）和 ATP 耗尽氰化物处理后，米托蒽醌的积累增加。*, P < 0.05 vs WT ( n = 3)
同时，在 T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞中，罗丹明 123（ Pgp的荧光底物）的细胞内水平不受Pgp抑制剂 PCS833 处理的影响（补充图 4）。
讨论
尽管乳腺癌预后和治疗的新策略不断发展，但经常遇到化疗耐药性，并且仍然是乳腺癌治疗的主要障碍。最终，MDR 在大多数全身复发或最初转移的乳腺癌患者中发展。克服耐多药可显着提高化疗疗效。
本研究的目的是建立新的耐药乳腺癌细胞系，以帮助开发新型化学增敏剂以最终克服 MDR 并研究 MDR 机制。
我们建立了两个新的耐药乳腺癌细胞亚系，T47D/SN120 和 T47D/SN150。两个亚系都显示出对本研究中测试的抗癌药物的多种耐药性，从巨大的耐药性（紫杉醇和长春碱）到低耐药性或无耐药性（5-FU 和甲氨蝶呤）。
通常，电阻水平分为高 (RF >20x)、中等 (RF 5-15x) 和低或无电阻 (RF <5x)。考虑到MRP和BCRP的共同底物是 SN38、伊立替康和甲氨蝶呤，而MRP的底物只有紫杉醇、长春碱和顺铂，而BCRP的底物只有阿霉素、托泊替康、吉非替尼、米托蒽醌，因此耐药性两种抗癌药物的耐药亚系的概况似乎与转运蛋白的表达水平密切相关，尽管仍有一些例外情况有待确定。
与其亲代细胞系相比，T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞表现出更快的增殖和更短的倍增时间。这些特征与其他耐药细胞系如 MCF-7/TAX 、BEL-7402/5-FU 、MCF-7/Doc 和 MCF-7/Adr 不一致。这可能是潜伏期短的结果。大多数细胞遵循 S 形生长模式；然而，我们在 S 形增长曲线之前的时间点计算了倍增时间。
将 T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞中转运蛋白基因的 mRNA 表达谱与 T47D/WT 细胞系中的那些进行比较。T47D/WT 不表达Pgp和MRP1 mRNA，这已在另一项研究中报道。我们发现 T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞过表达 MRP1、MRP2、MRP3、MRP4 和 BCRP。然而，尽管已经报道了许多 MPR mRNA 的剪接变体，但我们没有进行 RNA 测序。此外，在暴露于更高浓度的 SN38 后获得的 T47D/SN150 细胞表达更高水平的与 MDR 相关的转运蛋白基因。这表明 MDR 与使用的药物浓度以及 MDR 相关基因的过表达有关。
进行 MTT 测定以评估 SN38 抗性 T47D 亚系在抑制剂存在下对 SN38 的敏感性（Pgp抑制剂：维拉帕米、PSC833 和 TMF；MRP抑制剂：丙磺舒；BCRP抑制剂：染料木黄酮）。TMF、丙磺舒和染料木黄酮显示出浓度依赖性化学增敏作用。T47D/SN150细胞中MRP和BCRP的表达高于T47D/SN120细胞，TMF和染料木素的化学增敏作用在T47D/SN150中比在T47D/SN120细胞系中更有效。有趣的是，管理著名的Pgp抑制剂维拉帕米和 PSC833 不会使细胞对 SN38 敏感；然而，在施用 TMF 后敏感性恢复。此外，在用 TMF 处理的 SN38 抗性乳腺癌细胞中观察到的敏感性恢复模式与在用染料木黄酮处理的 SN38 抗性乳腺癌细胞中观察到的相似。这表明 TMF 不仅起到Pgp抑制剂的作用，而且还影响其他 MDR 机制。TMF 对非Pgp转运蛋白的抑制作用仍有待研究。
接下来，设计实验来确定MRP1、MRP2、MRP3、MRP4和BCRP的表达与表观遗传基因沉默之间的关系。通常，癌症中基因功能的改变归因于遗传改变（例如突变或缺失）或表观遗传改变，这些改变会改变基因表达状态 。表观遗传改变包括启动子甲基化和染色质重塑，例如组蛋白修饰而不改变 DNA 序列。由癌症表观遗传改变引起的基因表达变化可分为三类，由启动子 CpG 岛（基因组中的病变富含由鸟嘌呤前的胞嘧啶组成的序列）甲基化引起的转录回归，由低甲基化引起的基因表达增加，以及降低与组蛋白脱乙酰酶 (HDAC) 相关的基因表达。正常未甲基化的基因启动子 CpG 岛中的异常 DNA 甲基化导致基因表达降低。肿瘤抑制基因中启动子 CpG 岛的高甲基化是所有人类癌症的标志。此外，DNA 的整体低甲基化通过诱导基因组不稳定性而导致致癌。DNA 低甲基化与原癌基因的激活有关。最后，活化的 HDAC 诱导启动子 DNA 甲基化并抑制基因表达。因此，表观遗传基因沉默通过 DNA 高甲基化和组蛋白去乙酰化发生。因此，抑制 DNA 甲基化和组蛋白去乙酰化的 DNA 甲基转移酶抑制剂和 HDAC 抑制剂会诱导异常抑制的基因表达。因此，它们已被用作治疗剂来治疗由表观遗传基因沉默引起的癌症。在这项研究中，发现用 DNA 甲基转移酶抑制剂 5-aza-2'-deoxycytidine 处理的 T47D/WT 癌细胞中 MRP2、MRP3、MRP4 和 BCRP 的表达显着增加。类似地，用 HDAC 抑制剂曲古抑菌素 A 处理 T47D/WT 癌细胞显着增加了MRP1、MRP2、MRP4和BCRP的表达. 换句话说，与表观遗传基因沉默诱导的癌症中发生的情况相反，MRP1、MRP2、MRP3、MRP4和BCRP的过表达可能是由 DNA 去甲基化和组蛋白乙酰化引起的。这些结果表明MRP1、MRP2、MRP3、MRP4和BCRP的表达可以通过抑制表观遗传基因沉默来诱导。这些发现与表明表观遗传基因沉默与结直肠癌细胞中伊立替康敏感性有关的报道一致。细胞内伊立替康被 UGT1A1 灭活或被ABCB1 ( Pgp ) 等转运蛋白泵出，ABCC1 ( MRP1 ) 和ABCC2 ( MRP2 )。由于 UGT1A1 和转运蛋白的沉默通过 DNA 甲基化发生，DNA 甲基转移酶抑制剂可以恢复基因表达，从而增强 SN38 失活。ABC 转运蛋白基因沉默通过组蛋白去乙酰化发生. 在这项研究中，令人惊讶的是，用 TSA 处理后 MRP3 的表达下降；然而，潜在的机制仍有待阐明并且难以解释，因为对 ABC 基因座的表观遗传谱的研究仍然不完整。此外，ABC 转运蛋白过表达的其他可能机制包括基因扩增和 miRNA 的转录后调节。
BCRP、MRP1、MRP2、MRP3和MRP4减少了细胞内荧光染料的积累。当加入BCRP和MRP抑制剂染料木黄酮和丙磺舒作为化学增敏剂时，发现细胞内荧光染料浓度增加。然而，添加Pgp抑制剂 PSC833 并没有增加细胞内荧光染料的积累，这表明 T47D/SN120 和 T47D/SN150 细胞对抗癌药物的耐药性与Pgp无关。
结论
通过逐渐暴露于 SN38 建立了两个 SN38 抗性乳腺癌细胞亚系 T47D/SN120 和 T47D/SN150。耐药细胞过表达 MRP1、MRP2、MRP3、MRP4 和 BCRP，这可能是由于通过 DNA 高甲基化和组蛋白去乙酰化抑制表观遗传基因沉默。这些耐药细胞呈现出经典的 MDR 表型，其特点是对各种其他抗癌药物具有交叉耐药性。这种 MDR 表型减少了细胞内药物积累，这分别被已知的 MRP 和 BCRP 化学增敏剂丙磺舒和染料木黄酮逆转。因此，过表达 MRP 和 BCRP 的两种 SN-38 抗性亚系对于筛选抑制两种转运蛋白的化学增敏剂是有价值的。
缩写
BCRP：乳腺癌抗性蛋白
SN38：7-乙基-10-羟基喜树碱
MTT：3-(4,5-甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-溴化四唑
耐多药：多药耐药
美国广播公司：ATP（三磷酸腺苷）结合盒
物料需求计划 1：多药耐药蛋白1
物料需求计划2：多药耐药蛋白2
物料需求计划 3：多药耐药蛋白3
MRP4：多药耐药蛋白4
LRP：肺抗性蛋白
射频：阻力系数
逆转录定量PCR：逆转录-定量聚合酶链反应
PBS：磷酸盐缓冲溶液
商标法：7,3',4-三甲氧基黄酮
pgp：P-糖蛋白
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